Le cytosquelette se compose de microfilaments (polymères d’actine), de microtubules (polymères de tubuline) et de filaments intermédiaires (polymères de desmine, de lamines …). Le sepsis défini par une infection associée à une réaction inflammatoire systémique est responsable de dysfonctions myocardiques de mauvais pronostique. Cette cardiomyopathie apparait dans les premières heures du sepsis et guérit en moins de deux semaines chez les survivants. Même si certaines études démontrent l’implication d’éléments du cytosquelette dans la cardiomyopathie septique, les rôles des microfilaments et des microtubules ne sont pas clairement établis.Macrophage migration inhibitory factor (MIF) est une cytokine pro-inflammatoire sécrétée en excès dans le sepsis qui serait responsable d’un ralentissement de la récupération myocardique. Dans un premier temps, notre travail a consisté à caractériser l’implication des microtubules dans la dysfonction musculaire cardiaque induite par MIF. Dans un modèle de trabécules auriculaires droites humaines nous avons démontré que MIF induit une hyperpolymérisation des microtubules responsable d’une hyperviscosité intracellulaire, d’une dysfonction mitochondriale et d’une dysfonction contractile. Nos résultats suggèrent qu’une hyperpolymérisation des microtubules induite par MIF pourrait être responsable d’un ralentissement de la récupération myocardique à la phase tardive de la myocardiopathie septique. Dans un second temps, nous avons évalué l’implication des microfilaments dans un modèle murin de dysfonction myocardique inflammatoire induite par l’injection d’une endotoxine bactérienne, le lipopolysaccharide. Nos résultats suggèrent qu’à la phase précoce de la cardiomyopathie inflammatoire il existe une hyperpolymérisation des microfilaments responsable de dysfonctions contractile et mitochondriale.Les connaissances fondamentales acquises au cours de ce travail de thèse suggèrent une implication directe des microtubules et des microfilaments dans la physiopathologie des cardiomyopathies inflammatoires. / The cytoskeleton is composed of intracellular microfilaments (actin polymers), microtubules (tubulin polymers) and intermediate filaments (desmin, lamin … polymers).Sepsis, the association of an infection and a systemic inflammatory response, induces myocardial dysfunction. Septic cardiomyopathy appears in the early phase of sepsis and is associated with fatal outcome. Complete recovery of myocardial function occurs within two weeks following the onset of myocardial dysfunction in surviving patients. Although several studies demonstrate a role of cytoskeleton in septic cardiomyopathy, the involvement of microfilaments and microtubules is not clear.Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a pro-inflammatory cytokine secreted during sepsis that is suggested to postpone myocardium recovery. The first aim of the study was to characterize microtubule implications in MIF-induced cardiac muscle dysfunction. In a model of human right atrial trabecule we demonstrated that MIF induces microtubule stabilizations which are responsible for high intracellular viscosity, contractile and mitochondria dysfunctions. Our results suggest that MIF-induced microtubule stabilizations might be responsible for a delay of myocardial recovery during septic cardiomyopathy. The second aim of the study was to characterize microfilament involvements in a murine inflammatory cardiomyopathy induced by a lipopolysaccharid (LPS) injection. Our results suggest that microfilament stabilizations might be responsible for LPS-induced contractile and mitochondria dysfunctions in the early phase of inflammatory cardiomyopathy. Thus, these new fundamental mechanisms suggest a direct involvement of microtubules and microfilaments in the development and evolution of inflammatory cardiomyopathies.

De nombreuses études portant sur le microbiote intestinal ont mis en évidence son importance dans la physiologie et la physiopathologie de l’hôte. Les bactéries, acteurs majeurs du microbiote, participent au maintien de l’homéostasie intestinale en régulant plusieurs fonctions essentielles allant de la protection de la barrière intestinale au développement du système immunitaire. Des altérations de la composition et de la diversité de ce microbiote ont été observées dans des pathologies du tractus digestif comme le syndrome de l’intestin irritable et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Afin de restaurer l’homéostasie intestinale, des thérapies utilisant des bactéries probiotiques ont été utilisées. Parmi les bactéries probiotiques testées, Escherichia coli Nissle 1917 (E. coli Nissle 1917) a été décrite comme exerçant des fonctions anti-diarrhéiques, analgésiques et anti-inflammatoires. Néanmoins les mécanismes d’actions impliqués dans ces activités demeurent inconnus. Afin de les mettre en évidence, nous avons utilisé deux approches en spectrométrie de masse pour analyser les lipides bactériens. Une première approche sans apriori, nous a permis de mettre en évidence la production de lipopeptides dont le C12AsnGABAOH constitué d’un acide gras de 12 carbones, d’une asparagine et du GABA, le neurotransmetteur inhibiteur majoritaire du système nerveux. Ce lipopeptide était produit par des enzymes codées par des gènes faisant partis d’un cluster : l’îlot pks. A l’inverse du GABA seul, le C12AsnGABAOH traversait la barrière épithéliale intestinale (BEI) in vitro et in vivo. L’ajout de l’aminolipide par la bactérie confère donc au GABA la capacité d’atteindre les terminaisons nerveuses sensitives. Ce lipopeptide diminuait l’activation neuronale induite par l‘activation de nocicepteurs dans des cultures de neurones sensitifs via le récepteur GABAB. In vivo, il inhibait l’hypersensibilité viscérale induite par l’activation de nocicepteurs chez la souris. Dans une deuxième étude, nous avons réalisé une étude en spectrométrie de masse avec apriori en recherchant les acides gras à longue chaine (AGLC) hydroxylés dans différentes souches d’E. coli. Le C18-3OH un AGLC de 18 carbones possédant une hydroxylation en position 3 était produit en plus grande quantité par les bactéries E. coli Nissle 1917 indépendament de l’ilôt pks. Le C18-3OH n’était pas capable de traverser la BEI et s’accumulait dans les cellules in vitro, dans les tissus ex vivo, et dans le colon in vivo. Dans les tissus, le C18-3OH modulait l’expression de gènes qui était sous la dépendance du récepteur PPAR-γ. Enfin nous avons mis en évidence dans un modèle de colite induite par le DSS que le C18-3OH réduisait la perméabilité paracellulaire et les paramètres inflammatoires chez la souris. Ces travaux de thèse nous ont permis de démontrer pour la première fois que les bactéries E. coli Nissle 1917 pouvaient communiquer avec les cellules de l’hôte en sécrétant des lipopeptides et des AGLC. Deux d’entre eux le C12AsnGABAOH et le C18-3OH étaient des molécules bioactives. Le C12AsnGABAOH inhibait l’hypersensibilité viscérale et le C18-3OH réduisait le statut inflammatoire des cellules épithéliales intestinales. Ces composés lipidiques pourraient être impliqués dans les effets probiotiques exercés par E. coli Nissle 1917 et représenter des agents thérapeutiques dans le traitement de la douleur viscérale et de l’inflammation intestinale / Numerous studies have highlighted the importance of intestinal microbiota in the physiology and physiopathology of the host. Bacteria, the most represented microorganisms of the microbiota, contribute to the maintenance of intestinal homeostasis by regulating several essential functions ranging from the protection of the intestinal barrier to the development of the immune system. Impairment in the composition and diversity of this microbiota have been observed in pathologies of digestive tract such as irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease. In order to restore intestinal homeostasis, therapies using probiotic bacteria were used. Among probiotic bacteria tested, Escherichia coli Nissle 1917 (E. coli Nissle 1917) has been used for its anti-diarrheal, analgesic and anti-inflammatory properties. Nevertheless, the mechanisms of action involved in these therapeutic effects remain unknown. In order to study them, we used two approaches in mass spectrometry to analyse bacterial lipids. A first untargeted approach, allowed us to highlight the production of lipopeptides including C12AsnGABAOH composed by a fatty acid of 12 carbons, an asparagine and GABA (gamma amino butyric acid), the main inhibitory neurotransmitter of the nervous system. This lipopeptide was produced by enzymes encoded by genes of a cluster call the pks island. In contrast to GABA alone, C12AsnGABAOH crosses the intestinal epithelial barrier (IEB) in vitro and in vivo. The addition of the aminolipid by the bacteria confer to the GABA the ability to reach sensory nerve endings. This lipopeptide decreased neuronal activation induced by activation of nociceptors in sensory neuron primary cultures via the GABAB receptor. In vivo, it inhibited visceral hypersensitivity induced by activation of nociceptors in mice. In a second study, we carried out a mass spectrometry targeted approaches looking for hydroxylated long chain fatty acids (LCFA) in different strains of E. coli. C18-3OH a LCFA of 18 carbons with a hydroxylation on its third position was produced in higher amounts by E. coli Nissle 1917 independently of the pks island. The C18-3OH was not able to cross the IEB and accumulated in cells in vitro, in tissues ex vivo and in colon in vivo. In tissues, C18-3OH modulated the expression of genes regulated by PPAR-γ receptor. Finally, in a DSS-induced colitis in mice, C18-3OH decreased paracellular permeability and inflammatory parameters. These thesis works allowed us to demonstrate for the first time that E. coli Nissle 1917 could signal to host cells by secreting lipopeptides and LCFAs. Two of them C12AsnGABAOH and C18-3OH were bioactive molecules. C12AsnGABAOH inhibited visceral hypersensitivity and C18-3OH reduced the inflammatory status of intestinal epithelial cells. These lipid compounds could be involved in the probiotic effects exerted by E. coli Nissle 1917 and represent therapeutic agents in the treatment of visceral pain and intestinal inflammation.

L'objectif de cette étude est d'examiner si les améliorations du profil inflammatoire induites par une perte de poids sont similaires entre les femmes ménopausées à haut risque de maladies chroniques âgées de plus 60 ans et à leurs homologues plus jeunes. Les résultats obtenus permettre de démontrer qu’un programme de perte de poids de 6 mois induit une diminution du TA viscéral et souscutané abdominal chez toutes les femmes ménopausées atteintes d'inflammation silencieuse alors que des améliorations du profil inflammatoire ne surviennent que chez les femmes ménopausées plus jeunes.

L'expression des facteurs de transcription C/EBPs est induite dans les cellules épithéliales intestinales lorsque celles-ci sont stimulées avec certaines cytokines. Cette famille de facteurs de transcription joue un rôle très important dans l'élaboration de la phase aiguë de la réponse inflammatoire (APR) dans plusieurs tissus en régularisant l'expression de certains gènes de réponse inflammatoire. Nous avons déjà démontré que différents domaines de l'isoforme C/EBP[minuscule delta] sont impliqués dans le contrôle de son activité transcriptionnelle, mais très peu de choses sont connues sur la régulation négative de C/EBP[minuscule delta]. L'objectif de notre recherche était de déterminer le rôle des histones désacétylases dans la régulation négative de C/EBP[minuscule delta]. Nous avons observé par essai d'interactions in vitro et in vivo, que deux histones désacétylases, HDAC1 et HDAC3, interagissent avec les domaines N et C-terminaux de C/EBP[minuscule delta]. L'intégrité du bZIP (région basique et leucine zipper) est nécessaire pour la liaison de HDAC1 et HDAC3 au domaine C-terminal de C/EBP[minuscule delta]. Les acides aminés 70 à 85 de C/EBP[minuscule delta] sont importants pour la liaison à HDAC1, ainsi que les acides aminés 50 à 60. Il y a un site de liaison de HDAC3 entre les acides aminés 60 à 70 de C/EBP[minuscule delta] et un autre entre les acides aminés 108 à 164. Nos résultats suggèrent que la liaison de HDAC1 à C/EBP[minuscule delta] est indirecte et pourrait être en partie médiée par la protéine mSin3A puisque ce co-répresseur lie le domaine C-terminal de C/EBP[minuscule delta]. Par ailleurs, nous avons également montré qu'une histone désacétylase de classe II, soit HDAC4, pouvait également interagir avec C/EBP[minuscule delta] par ces deux domaines. Nos observations suggèrent que l'interaction des histones désacétylases avec C/EBP[minuscule delta] pourrait impliquer d'autres protéines que celles jusqu'à maintenant identifiées. Nous montrons également par transfections transitoires et essai luciférase que HDAC1 et HDAC3 modulent négativement l'activité transcriptionnelle de C/EBP[minuscule delta] sur le promoteur de l'haptoglobine. Ces deux histones désacétylases de classe I pourraient donc jouer un rôle prépondérant dans la régulation négative de l'activité transcriptionnelle de C/EBP[minuscule delta] sur le promoteur de gènes cibles.

Ce projet de maîtrise a comme objectif d'évaluer, dans une cohorte de patients avec polyarthrite inflammatoire débutante, l'existence de différents sous-groupes de patients classifiables selon leurs caractéristiques cliniques lors de l'inclusion dans l'étude. Les patients sont recrutés au Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke (CHUS). Ils doivent être âgés de plus de 18 ans, se présenter avec au moins 3 articulations atteintes d'inflammation articulaire, et ce depuis plus d'un mois et moins de 12 mois. Les patients exclus de l'étude sont ceux atteints d'arthrite microcristalline (ex: Goutte), de collagénose (maladie du tissu conjonctif), ou d'arthrite septique, ainsi que les patients inaptes à consentir. De plus, les patients sont suivis sur une période de 5 ans et réévalués tous les ans. Nous sommes donc en présence d'un dispositif d'observation avec cohorte prospective longitudinale. Chacun des patients est traité selon les traitements disponibles cliniquement et adaptés à sa situation clinique. Une classification hiérarchique a été effectuée chez les 211 premiers patients consécutifs pour lesquels l'information clinique à l'inclusion et à 30 mois était complète. Les variables de l'inclusion qui ont été incorporées dans l'analyse statistique sont: les données démographiques (âge, sexe), certains autoanticorps, le décompte d'articulations gonflées, les paramètres d'inflammation systémique, les paramètres sanguins, si les patients remplissent au moins 4 des 7 critères de classification de la polyarthrite rhumatoïde (PR) selon l'American College of Rheumatology (ACR), la présence de traitements lors de l'inclusion et les dommages articulaires (érosions osseuses et pincements articulaires) sur les radiographies des mains et des pieds. L'analyse statistique a permis l'identification de 5 sous-groupes de patients: 2 avec une meilleure issue clinique (Groupes 1 et 4), 2 avec une issue intermédiaire (Groupes 2 et 3) et 1 avec une très mauvaise issue radiologique et clinique (Groupe 5). Les patients des groupes 1 et 4 ont très peu d'anticorps ou d'érosions, peu d'inflammation systémique, et sont plus jeunes (63% et 47%, âge [< ou =] 50 ans respectivement). Aucun des patients du groupe 4 ne remplit les critères de la classification de la PR, contrairement au groupe 1 (0% vs 100% respectivement). Les patients des groupes 2 et 3 ont généralement des dommages radiographiques à l'inclusion et leur nombre d'érosions osseuses augmente à 30 mois. Les patients du groupe 2 se distinguent par un très faible taux d'anticorps (entre 0% et 17%), tout en présentant fréquemment une inflammation très importante et de l'anémie. Le groupe 3 quant à lui a modérément d'anticorps (entre 40 à 50%), un taux élevé de globules blancs circulants et les patients sont généralement traités très tôt dans le développement de la maladie. Finalement, le groupe 5 est le groupe avec un nombre très important d'anticorps, beaucoup de dommages radiographiques à l'inclusion et à 30 mois, les critères de l'ACR sont généralement remplis et il y a présence d'inflammation systémique. Comme les résultats le suggèrent, cette analyse semble compatible avec d'autres observations qui suggèrent que l'arthrite débutante représente plus d'une maladie. Le groupe 3 ressemble au groupe 5 pour les caractéristiques de l'inclusion. Ceci pourrait indiquer que de traiter très tôt peut, dans certains cas, modifier l'expression des anticorps et l'évolution de la maladie. D'autres analyses plus approfondies seront nécessaires pour améliorer la classification des divers sous-groupes. Éventuellement, un modèle de régression multivarié pourra être utilisé pour prédire l'évolution de la maladie chez de nouveaux patients à partir de leurs caractéristiques initiales. Un tel modèle pourrait alors être très utile en clinique pour établir le bon traitement à administrer aux patients en considérant leurs caractéristiques cliniques lors de leur première visite avec le rhumatologue.

Des résultats obtenus antérieurement au laboratoire ont démontré l'induction des facteurs de transcription C/EBPs par l'IL-1? ainsi que leur implication dans la régulation de la transcription de gènes de réponse inflammatoire telle que l'haptoglobine au niveau de la cellule épithéliale intestinale. En outre, il a déjà été démontré que la phosphoiylation des C/EBPs peut moduler leur activité et des études au laboratoire ont démontré l'interaction in vitro entre l'isoforme C/EBP? et la kinase DNA-PK. Par l'utilisation de l'inhibiteur non spécifique de la famille PI(3)K, la wortmannine, il a été observé que la DNA-PK phosphoryle C/EBP?. La DNA-PK est une kinase qui répare les bris d'ADN double brin en participant au processus de jonction des extrémités non-homologues. Ainsi, nous avons étudié la modulation de la réponse inflammatoire intestinale par la DNA-PK, en s'attardant plus particulièrement à deux familles de facteurs de transcription, soit NF-?B et les C/EBPs. Par l'utilisation d'un inhibiteur sélectif de la DNA-PK, le IC60211, la phosphorylation in vitro de la région N-terminale de C/EBP? par la DNA-PK a d'abord été confirmé. Puisque la DNA-PK est activée par les bris d'ADN double brin, la doxorubicine, un agent génotoxique, a été utilisé pour la suite du projet. Nous avons montré que la doxorubicine engendre une hausse de la capacité de liaison à l'ADN de NF-?B induite par l'IL-1? et que les complexes formés comprenaient surtout la sousunité p65. Ceci s'accompagne d'une hausse des niveaux nucléaires de p65 ainsi que d'une baisse d'expression de l'inhibiteur cytoplasmique de NF-?B, I?B?. Par contre, par l'utilisation de l'inhibiteur sélectif de la DNA-PK, le NU7026, nos résultats suggèrent que ces effets sont DNA-PK indépendants. En effet, un rétablissement de la capacité de liaison à l'ADN de NF-?B n'est pas observé lors d'une préincubation avec cet inhibiteur avant de traiter à la doxorubicine puis à l'IL-1?. En ce qui concerne les C/EBPs, nos résultats démontrent que la doxorubicine diminue l'activité transcriptionnelle de l'isoforme C/EBP? sur le promoteur du gène haptoglobine. Alors qu'un traitement à l'IL-1? induit une augmentation de la liaison des C/EBPs à HaptoA, nos résultats montrent qu'un pré-traitement à la doxorubicine empêche cette induction. De plus, les niveaux protéiques de C/EBP? et C/EBP? induits par l'IL-1? sont abaissés par la doxorubicine. Également, les niveaux d'ARNm de C/EBP? induits par l'IL-1 p et de deux de ses gènes cibles inflammatoires, l'haptoglobine et lipocalin2, sont diminués par un prétraitement à la doxorubicine. Par l'utilisation du NU7026, nous démontrons un rétablissement partiel de la capacité de liaison à l'ADN de C/EB13? et de C/EBP? qui était réduite par un traitement à la doxorubicine, à des niveaux comparables à la condition sans traitement et à la condition IL-1?, respectivement. Cependant, cet inhibiteur permet le rétablissement des niveaux de protéine et d'ARNm de C/EBP? (induits par l'IL-1?) qui étaient réprimés par un prétraitement à la doxorubicine mais non des niveaux protéiques de C/EBP?. Nos résultats suggèrent que la DNA-PK régule, au moins partiellement, la transcription de l'isoforme C/EBP? ainsi que son activité transcriptionnelle sur le promoteur de l'haptoglobine. Par contre, nos résultats suggèrent aussi que la DNA-PK module la capacité de liaison à l'ADN de C/EBP? et que l'effondrement des niveaux protéiques de C/EBP? par la doxorubicine est DNA-PK indépendant. [Symboles non conformes]

La participation de HNF4[alpha] à la réponse inflammatoire se manifeste par différents rôles, notamment par la régulation transcriptionnelle du cytochrome P450, de l'oxyde nitrique synthase inductible, mais également par la protection face aux maladies inflammatoires de l'intestin (MII). En effet, la perte de HNF4[alpha] au niveau de l'épithélium intestinal de souris rend celles-ci plus sensibles face à l'induction d'une colite chimique. Également, l'expression de HNF4[alpha] est perdue au niveau des tissus coliques de patients atteints de maladies inflammatoires de l'intestin, dont la colite ulcéreuse. Les MII sont caractérisées par une activation chronique de la réponse immune et inflammatoire le long du tractus gastro-intestinal. L'agent causal est, dans la majorité des cas, la flore intestinale, laquelle peut activer plusieurs réponses inflammatoires, telle la sécrétion abondante de cytokines et d'interleukines pro-inflammatoires ainsi que le recrutement et l'infiltration de cellules immunitaires à l'épithélium, causant des dommages importants à la muqueuse intestinale et menant ainsi à une augmentation de la perméabilité de l'épithélium intestinal. La perte de HNF4[alpha] au niveau de l'épithélium colique de souris a mené à l'apparition spontanée d'inflammation, à l'infiltration massive de cellules leucocytaires et a révélé une augmentation de la production de plusieurs facteurs pro-inflammatoires, dont la chimiokine KC/CXCL1. Cette molécule est en fait un chimioattractant important pour les neutrophiles et autres cellules leucocytaires. Dans cette optique, nous avons évalué, par immunobuvardage et gel de rétention, l'impact d'un stress pro-inflammatoire sur l'expression et l'activité de HNF4[alpha]. Nous avons également déterminé l'effet de l'expression de HNF4[alpha] sur la production de KC/CXCL 1 ainsi que les mécanismes de régulation de HNF4[alpha] sur l'expression de la chimiokine. Nous avons quantifié, par qPCR et par ELISA, la production et la sécrétion de KC/CXCL1 par les différentes lignées de cellules épithéliales intestinales surexprimant le facteur de transcription HNF4[alpha]. Aussi, nous avons montré l'influence de HNF4[alpha] sur l'activation de NF[kappa]B, puisque ce facteur est responsable de la régulation transcriptionnelle de KC/CXCL1. Nous avons, en effet, montré que l'activation par phosphorylation, la translocation nucléaire et la capacité de liaison à l'ADN de NF[kappa]B sont diminuées dans les modèles cellulaires de surexpression de HNF4[alpha]. Nous avons finalement évalué l'effet de HNF4[alpha] sur la dégradation de l'inhibiteur de kappaB (I[kappa]B[alpha]). Dans cette étude, nous avons montré que le facteur de transcription HNF4[alpha] régule de façon négative la production de la chimiokine KC/CXCL1 en modulant l'activité transcriptionnelle de NF[kappa]B via la stabilisation de l'inhibiteur I[kappa]B.

La prise en charge de la douleur est un enjeu médical majeur car il existe toujours des douleurs réfractaires aux traitements antalgiques actuels. La détection de la douleur est assurée par les neurones nociceptifs dont l'excitabilité est majoritairement contrôlée par les canaux sodiques dépendants du potentiel (Nav). Parmi eux, le canal Nav1.9 se distingue par son expression restreinte dans les nocicepteurs et par ses caractéristiques électrophysiologiques qui lui confèrent un rôle particulier dans l'électrogenèse de ces neurones. Au cours de ce travail de thèse nous avons caractérisé le rôle du canal Nav1.9 dans trois modèles de douleurs inflammatoires : aigue, persistant et chronique. Nous avons mis en oeuvre un ensemble de techniques d'analyses comportementales, moléculaires et électrophysiologiques, qui nous ont permis de montrer le rôle du canal Nav1.9 dans ces trois modèles de douleur et de révéler plusieurs mécanismes de régulation potentiels.Par la suite, nous nous sommes attachés à décortiquer l'un de ces mécanismes. Nous avons montré que le canal Nav1.9 est présent dans des microdomaines membranaires riches en cholestérol. Nous avons mis en évidence que l'inflammation diminuait la quantité de cholestérol dans les tissus. Ce mécanisme est à l'origine de douleurs dues à l'activation des canaux Nav1.9 et à leur relocalisation en dehors des radeaux lipidiques. Enfin nos expériences montrent que l'application topique de cholestérol peut réduire les douleurs inflammatoires, ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques. / In mammals, perception of pain is initiated by signaling the occurrence of noxious stimuli through nociceptive neurons located in peripheral sensory ganglia. Nociceptive neurons play a pivotal role in pain perception as they transmit painful information to the central nervous system (CNS). They are largely responsible for the modifications of pain sensation caused by a lesion/inflammation or during the course of chronic diseases like rheumatoid arthritis. Unravelling the precise mechanism of ion channel activation during such pathophysiological conditions is one of the most challenging issues to design new therapeutic pain killer strategies.In this PhD thesis work, we will focus on one particular and promising sodium channel, named Nav1.9. We characterized Nav1.9 channel function in three inflammatory pain models: acute, persistent and chronic, using behavioural, molecular and electrophysiological analysis technics. This work allowed us to point out different putative mechanisms of regulation of this channel.We further decipher the regulation of Nav1.9 by cholesterol lipid in membrane microdomains. We showed that Nav1.9 channel is present in rafts specialized membrane microdomains enriched in cholesterol. We demonstrated that inflammation triggers a decrease in cholesterol level in inflamed territories and that cholesterol deletion induces mechanical allodynia in animals. In addition, we demonstrated that this pain was due to Nav1.9 channel activation and relocalization of this channel out of lipid rafts. Finally our experiments reported that exogenous cholesterol application reduces inflammatory pain. All these results provide a new insight in therapeutic perspectives.

Les plaquettes jouent un rôle central dans l’hémostase et dans la réponse immunitaire. Elles interviennent en effet à toutes les étapes des réactions inflammatoires. Nos objectifs ont été de : (i)caractériser les mécanismes plaquettaires responsables de la prévention des saignements inflammatoires, qui sont à différencier des saignements provoqués par un traumatisme et de (ii)caractériser les déterminants de la régulation des activités cytotoxiques des neutrophiles par les plaquettes. In vivo dans un modèle de réaction immuno-induite cutanée, nous avons mis en évidence le rôle de la glycoprotéine (GP) VI dans la prévention des saignements inflammatoires provoqués par les neutrophiles. Nos résultats suggèrent que GPVI exercerait son effet protecteur par une action mécanique associée à l’activation de sa voie de signalisation ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif) en absence d’une agrégation plaquettaire. En revanche, dans un modèle d’inflammation pulmonaire aigue les récepteurs à ITAM, GPVI et CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2), ne sont pas requis alors que l’absence de GPIb conduit à des saignements inflammatoires. In vitro, nous avons montré que la régulation par les plaquettes des activités cytotoxiques des neutrophiles est déterminée par l’interaction préalable des neutrophiles avec les cellules endothéliales. Ainsi, nos résultats contribuent à une meilleure compréhension des fonctions des plaquettes dans les réactions inflammatoires, une première étape nécessaire au développement de nouvelles applications thérapeutiques des médicaments antiplaquettaires. / Platelets are crucial players in hemostasis and immune responses. They intervene at various stages of inflammatory reactions. Our objectives were : (i)to characterize platelet mechanisms responsible for the prevention of inflammatory bleeding, which differs from trauma-induced bleeding, and (ii)to characterize the determinants of the regulation of neutrophil cytotoxic activities by platelets. In vivo, in an immune complex-mediated cutaneous inflammation, we demonstrated the role of glycoprotein (GP) VI in the prevention of inflammatory bleeding caused by neutrophils. Our results suggest that GPVI has a protective effect, independent of platelet aggregation, by a mechanical action associated to an activation of the ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)-based signaling pathway. In contrast, in an acute pulmonary inflammatory model, the ITAM receptors GPVI and CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2) were not required while the absence of platelet GPIb led to inflammatory bleeding. In vitro, we showed that physical interactions between neutrophils and endothelial cells are major determinants that guide the regulatory action of platelets towards neutrophil cytotoxic activities. In conclusion, our results contribute to a better understanding of platelet functions in inflammatory reactions, a necessary first step for future therapeutic applications of antiplatelet agents.

Introduction<br>Le nerf vague est un nerf mixte composé de 20% de fibres efférentes et 80% de fibres afférentes. La stimulation électrique du nerf vague (VNS) est actuellement employée comme thérapie de certaines formes d'épilepsies et de dépressions chez l'Homme. Le nerf vague a également un double rôle anti-inflammatoire : i) d'une part via la voie classique faisant intervenir les fibres vagales afférentes centripètes qui peuvent activer l'axe corticotrope, ii) d'autre part via la voie cholinergique anti-inflammatoire, plus récemment décrite. L'effet anti-inflammatoire est dans ce cas lié à l'activation des efférences vagales centrifuges. En effet, les terminaisons de ces fibres libèrent, en périphérie, de l'acétylcholine qui, en se liant au récepteur alpha 7-nicotinique exprimé en particulier par les macrophages, inhibe la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (TNFalpha notamment). Bien que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) aient une incidence en augmentation, leur origine exacte reste méconnue et semble liée à de nombreux facteurs. Les patients atteints de MICI présentent des troubles au niveau de l'activation du système immunitaire qui vont engendrer l'apparition de lésions au niveau intestinal. Les traitements des MICI disponibles actuellement ne permettent pas une guérison totale, mais ont uniquement un rôle suspensif. <br> But <br>Les travaux réalisés ont eu pour objectif d'utiliser la VNS afin de diminuer l'inflammation dans un modèle de colite expérimentale chez le rat. Des études complémentaires ont été réalisées pour étudier les mécanismes de cet effet anti-inflammatoire ainsi que les effets centraux et digestifs moteurs de la VNS.<br> Matériels et Méthodes <br>La colite a été induite par l'instillation intra-colique d'acide trinitrobenzène sulfonique (TNBS). La VNS a été réalisée grâce à une électrode bipolaire implantée de manière chronique au niveau du nerf vague gauche (paramètres de stimulation : 1mA, 5Hz, 500µs, 10s ON, 90s OFF) ; l'animal a été stimulé pendant 3 heures le jour de l'injection du TNBS et pendant les 4 jours suivants. Les paramètres physiologiques de température corporelle et d'activité locomotrice ont été suivis en continu par télémétrie pendant cette période. L'animal a été sacrifié 5 jours après l'instillation, le côlon a été prélevé et deux zones tissulaires ont été distinguées : la partie lésée et la partie adjacente. Ces prélèvements ont ensuite été utilisés pour une analyse histologique, une quantification de la myéloperoxydase et une quantification des ARNm des cytokines par la technique de RT-PCR. L'inflammation globale induite par la colite a été étudiée par l'intermédiaire d'un index multiparamétrique global comprenant des paramètres physiologiques intégrés (température corporelle, activité locomotrice), tissulaires (surface des lésions) et moléculaires (ARNm des marqueurs d'inflammation). L'approfondissement des connaissances mécanistiques de l'effet anti-inflammatoire obtenu a été réalisé par une étude par western blot et immunohistochimie de l'expression des protéines impliquées dans les voies intracellulaires d'activation des cellules immunitaires (protéines STAT). Enfin les effets latéraux de la VNS ont été étudiés au niveau central par la technique d'immunohistochimie du c-fos et par l'analyse des électromyogrammes du jéjunum au niveau périphérique.<br>Les résultats mettent en évidence chez les animaux stimulés : une amélioration clinique significative avec une perte pondérale réduite, une tendance à la réduction des lésions intestinales, de l'expression de la myéloperoxidase et du taux d'ARNm de cytokines dans le tissu colique, ainsi qu'une diminution significative de l'index global d'inflammation. Au niveau mécanistique, la VNS induit des changements dans la signalisation intracellulaire, au niveau de la lésion et juste au-dessus de celle-ci. Enfin la VNS semble induire aussi des changements modérés au niveau de l'activation neuronale centrale et de la motricité digestive. <br> Conclusion <br>Ces données expérimentales montrent l'intérêt d'activer la voie cholinergique par la VNS pour obtenir un effet anti-inflammatoire ciblé au niveau du tube digestif. La VNS pourrait être envisagée dans le traitement des poussées ou le maintien en phase de rémission des patients atteints de MICI.