Im Unterschied zu anderen RNA Viren vervielfältigen Influenzaviren ihr Genom im Zellkern infizierter Zellen. Für die erfolgreiche Vermehrung müssen neu gebildete Genomsegmente (virale Ribonukleoproteine, vRNPs) wieder aus dem Zellkern exportiert werden. Dafür nutzt Influenza einen Exportkomplex, der sich aus dem viralen Matrixprotein 1 (M1) und Nukleusexportprotein (NEP) zusammensetzt und vRNPs unter Verwendung des zellulären Exportproteins CRM1 aus dem Zellkern transportiert. Zahlreiche Fragen im Zusammenhang mit dem Exportkomplex sind noch unbeantwortet: Wie viele Exportkomplexe werden pro vRNP gebunden? Wie interagieren die Proteine innerhalb des Komplexes mit vRNPs? Wie wird die zeitliche und räumliche Präsenz der beteiligten Proteine im Verlauf der Infektion reguliert? Um zu einem besseren Verständnis beizutragen, wurden in der vorliegenden Arbeit Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie und molecular brightness-Analysen genutzt, um die Oligomerisierung der beteiligten Exportkomplexproteine zu quantifizieren. Werden Fluoreszenzproteine für solche Untersuchungen verwendet, treten häufig nicht-fluoreszente Zustände auf, die die Bestimmung des Oligomerzustandes beeinflussen. Daher wurde in dieser Arbeit ein einfaches Korrekturmodel vorgestellt, das die Population an nicht-fluoreszenten Zuständen berücksichtigt, und somit die genaue Bestimmung des Oligomerzustandes erlaubt. Dadurch konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass NEP Homodimere im Zytoplasma ausbildet, wohingegen eine um das 2,5-fach geringere Homodimerpopulation im Zellkern vorhanden war. Durch die Integration von Informationen über den Lokalisationsphänotyp und den Oligomerzustand von NEP sowie mehrerer Mutanten, konnte ein Modell abgeleitet werden, dass den Regulationsmechanismus beschreibt: Durch vorrübergehendes Maskieren und Demaskieren der beiden Nukleusexportsignale wird der Transport von NEP reguliert. Die Dimerisierung im Zytoplasma und Monomerisierung im Zellkern unterstützen diesen Mechanismus. / Influenza viruses are the causative agent of severe epidemics and pandemics, causing up to 650,000 deaths annually. Unlike other RNA viruses, Influenza viruses replicate their genome within the nucleus of cells. Hence, progeny genome segments - viral ribonucleoproteins (vRNPs) - need to be exported from the nucleus to complete the replication cycle. To fulfil this task, Influenza relies on a viral nuclear export complex built from M1 and NEP, that mediates export by hijacking the cellular CRM1-dependent export machinery. In this context a number of questions remain unanswered, such as how many export complexes bind to a single vRNP, what is the exact interaction pattern of vRNPs with export complex proteins, and how translocation of nuclear export relevant proteins such as NEP are regulated and optimally timed during the course of infection? In the present study, the potential of NEP to form homo-dimers in situ was shown for the first time by applying fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) and molecular brightness analysis, that allows determination of protein oligomerization in living cells. However, when using fluorescent proteins in FFS studies non-fluorescent states are observed, which strongly affect molecular brightness analysis. Therefore, in this study a simple correction model was described, taking into account quantified non-fluorescent state fractions, to finally allow accurate and unbiased determination of oligomerization. This way it was shown, that NEP forms homo-dimers within the cytoplasm of cells, whereas a 2.5-fold lower homo-dimer population was observed in the nucleus. Combining the subcellular localization dependent oligomeric state of NEP and several NEP mutants with their localization phenotypes, a regulation mechanism was proposed in which the translocation of NEP is regulated by transient masking and unmasking of its two NESs, which is supported by dimerization in the cytoplasm and monomerization in the nucleus of cells, respectively.

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Dependent on the excretion pattern, wastewater monitoring of viruses can be a valuable approach to characterizing their circulation in the human population. Using polyethylene glycol precipitation and reverse transcription-quantitative PCR, the occurrence of RNA of SARS-CoV-2 and influenza viruses A/B in the raw wastewater of two treatment plants in Germany between January and May 2022 was investigated. Due to the relatively high incidence in both exposal areas (plant 1 and plant 2), SARS-CoV-2-specific RNA was determined in all 273 composite samples analyzed (concentration of E gene: 1.3 × 10⁴ to 3.2 × 10⁶ gc/L). Despite a nation-wide low number of confirmed infections, influenza virus A was demonstrated in 5.2% (concentration: 9.8 × 10² to 8.4 × 10⁴ gc/L; plant 1) and in 41.6% (3.6 × 10³ to 3.0 × 10⁵ gc/L; plant 2) of samples. Influenza virus B was detected in 36.0% (7.2 × 10² to 8.5 × 10⁶ gc/L; plant 1) and 57.7% (9.6 × 10³ to 2.1 × 10⁷ gc/L; plant 2) of wastewater samples. The results of the study demonstrate the frequent detection of two primary respiratory viruses in wastewater and offer the possibility to track the epidemiology of influenza by wastewater-based monitoring.

Les méthodes de vaccination actuelles contre l’influenza, axées sur la réponse à anticorps dirigée contre des antigènes hautement variables, nécessitent la production d’un vaccin pour chaque nouvelle souche. Le défi est maintenant de stimuler simultanément une réponse cellulaire pan-spécifique ciblant des antigènes conservés du virus, tel que la protéine de la matrice (M1) ou la nucléoprotéine (NP). Or, la présentation antigénique de ces protéines est peu définie chez l’humain. Nous avons analysé la présentation endogène par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classes (CMH)-I et -II de M1 et de NP. Ainsi, les protéines M1 et NP ont été exprimées dans des cellules présentatrices d’antigènes (CPAs). Notamment, des épitopes de M1 et de NP endogènes peuvent être présentées par CMH-I et -II, ce qui résulte en une activation respectivement de lymphocytes T CD8+ et CD4+ précédemment isolés. Étant donné l’importance des lymphocytes T CD4+ dans la réponse cellulaire, nous avons cloné M1 ou NP en fusion avec des séquences de la protéine gp100 permettant la mobilisation vers les compartiments du CMH-II sans affecter la présentation par CMH-I. Des CPAs exprimant de façon endogène ces constructions modifiées ou sauvages ont ensuite été utilisées pour stimuler in vitro des lymphocytes T humains dont la qualité a été évaluée selon la production de cytokines et la présence de molécules de surface (ELISA ou marquage de cytokines intracellulaire). Nous avons observé une expansion de lymphocytes T CD8+ et CD4+ effecteurs spécifiques sécrétant diverses cytokines pro-inflammatoires (IFN-γ, TNF, MIP-1β) dans des proportions comparables avec une présentation par CMH-II basale ou améliorée. Cette qualité indépendante du niveau de présentation endogène par CMH-II de M1 et de NP des lymphocytes T CD4+ et CD8+ suggère que cette présentation est suffisante à court terme. En outre, la présentation endogène de M1 et NP a permis de stimuler des lymphocytes T spécifiques à des épitopes conservés du virus, tel qu’identifié à l’aide une méthode d’identification originale basée sur des segments d’ARNm, « mRNA PCR-based epitope chase (mPEC) ». Ensemble, ces nouvelles connaissances sur la présentation antigénique de M1 et de NP pourraient servir à établir de nouvelles stratégies vaccinales pan-spécifiques contre l’influenza. / New vaccines targeting hyper-variable influenza determinants must be prepared against every new strain. The challenge is now to develop influenza vaccines also eliciting a strong and sustained cytotoxic response against highly-conserved determinants such as the matrix (M1) and nuclear (NP) proteins. However, their antigenic presentation properties in humans are less defined. We, therefore, analyzed major histocompatibility complex class (MHC)-I and -II presentation of endogenously processed M1 and NP in human antigen presenting cells (APCs). To do so, we used APCs endogenously-expressing the M1 and NP proteins. M1 and NP epitopes can be presented by MHC-I and -II, which results in the activation of previously-isolated antigen-specific CD8+ and CD4+ T lymphocytes. Considering the importance of CD4+ T lymphocytes in the cellular immune response, we cloned M1 and NP proteins in fusion with gp100 MHC-II enhancing sequences, which do not disrupt MHC-I presentation. APCs expressing MHC-II-enhanced or wild type constructs were used to stimulate human T lymphocytes in vitro and quality of antigen presentation was evaluated on the basis of cytokine production and cell surface molecule expression (ELISA or intracellular cytokine staining). We expanded antigen-specific effector CD8+ and CD4+ T lymphocytes which secreted pro-inflammatory cytokines (IFN-γ, TNF and MIP-1β) to similar extents both with and without MHC-II enhancement. The quality of CD4+ and CD8+ T lymphocytes generated independent of the level of M1 and NP endogenous MHCII presentation suggests that this presentation is sufficient for short-term T lymphocyte stimulation. Thus, endogenous expression of M1 and NP have stimulated T lymphocytes specific to conserved influenza epitopes, as determined by an original identification technique based on mRNA segments called mRNA PCR-based epitope chase (mPEC). Overall, these new insights about T lymphocytes expanded following MHC-I and -II presentation of endogenous M1 and NP could prove useful for new complementary heterosubtypic vaccination strategies.

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Les pneumonies chez l’enfant de moins de 5 ans restent à l’heure actuelle un enjeu majeur de santé publique. Afin d’étudier les agents étiologiques des pneumonies chez les enfants de moins de 5 ans dans les pays à revenu faible ou intermédiaire, une étude cas-témoins a été réalisée entre 2010 et 2014 dans cette population par le réseau Global Approach for Biological Research on Infectious Epidemics in Low Income Countries (GABRIEL). Notre travail s’est attaché à décrire la distribution des sérotypes de Streptococcus pneumoniae retrouvés dans la population de l’étude, d’évaluer la prévalence du virus infuenza et d’évaluer l’effet du virus sur la gravité de la pneumonie, et enfin d’étudier la fréquence des co-détections bactériennes et virales au niveau nasopharyngé ainsi que leur effet sur le risque de pneumonie. Les résultats montraient que la majorité des sérotypes pneumococciques retrouvés étaient inclus dans le vaccin pneumococcique conjugué 13-valent (PCV13) et suggèraient que les souches de S. pneumoniae retrouvées au niveau nasopharyngé et au niveau sanguin étaient identiques chez un même individu atteint de pneumonie. L’importance du virus influenza, et particulièrement d’influenza A H1N1 a été soulignée. Enfin, de nombreuses co-détections nasopharyngées de microorganismes étaient observées chez les cas mais aussi chez les témoins. Leur pathogénicité semblait différer selon les espèces et pourrait dépendre des interactions avec le microbiome du tractus respiratoire. Les résultats suggèraient que la mise en œuvre de campagnes de vaccination par PCV13 pourrait être efficace dans les pays étudiés. Néanmoins, de nouvelles études précisant le rôle des co-détections entre bactéries et virus dans la physiopathologie de la pneumonie sont nécessaires pour guider les décisions de santé publique de façon optimale / Pneumonia remains a public health issue in children under 5 years old. In order to study the etiological agents of pneumonia in this population, a case-control study was carried out between 2010 and 2014 by the Global Approach for Biological Research on Infectious Epidemics in Low Income Countries (GABRIEL) Network in 9 study sites located in 8 low or middle-income countries. The objectives of the present work were to describe the distribution of Streptococcus pneumoniae serotypes, to assess the burden of influenza virus and its effect on the severity of pneumonia, and to study bacterial/viral co-detection in nasopharyngeal samples and their effect on the risk of pneumonia. Results showed that most of S. pneumoniae serotypes detected were included in the pneumococcal 13-Valent conjugate vaccine (PCV13) and confirmed the assumption that the isolate carrying or causing disease in an individual were of the same serotype. The importance of the burden of influenza virus in pneumonia cases, and particularly A H1N1 influenza, was highlighted. Finally, numerous nasopharyngeal co-detections were found both in pneumonia cases and in control subjects. Pathogenicity of microorganisms differs between species and might depend of the interactions with the microbiome of the respiratory tract. Results suggested that the implementation of PCV13 vaccination policies might be effective in the study population. Nevertheless, further studies focused on the most important co-detections of micro-organisms are needed to improve the understanding of their role in the pathogenesis of pneumonia and to guide appropriate public health interventions