La viande de volaille et les oeufs constituent une source de protéines bon marché mais la production avicole est menacée par deux maladies virales, la grippe aviaire hautement pathogène et la maladie de Newcastle, ayant des implications économiques et de santé publique à travers le monde. L'introduction du virus de l'influenza aviaire (AIV) hautement pathogène H5N1 en Afrique en 2006 a souligné la nécessité d'une meilleure compréhension d'AIV en Afrique. Grâce à des études de surveillance, nous avons constaté que le virus H5N1 ne circulait plus après 2008 en Afrique subsaharienne. Toutefois, les analyses phylogénétiques réalisées sur le génome de virus faiblement pathogènes H5N2 trouvés chez des oiseaux sauvages au Nigeria ont révélé des caractéristiques de virus réassortants. La similitude d'un gène avec ceux trouvés dans d'autres virus d'Afrique australe renforce l'idée qu'AIV est capable de persister et circuler en Afrique. Nous avons également montré que de nouvelles souches virulentes du virus de la maladie de Newcastle (NDV) constituent la majorité des souches détectées. Leur distance génétique par rapport aux autres souches de NDV connues, leur diversité génétique et leur dispersion géographique suggèrent que ces souches ont probablement évolué localement, circulent depuis un certain temps dans la région et que le commerce et le mouvement d'animaux ont contribué à leur propagation. Nos résultats suggèrent également que la contribution des oiseaux sauvages à la dispersion des souches virulentes du NDV est probablement limitée. Au Luxembourg cependant, les oiseaux sauvages pourraient être un acteur important pour l'introduction du NDV / Poultry meat and eggs constitute one of the cheap sources of protein around the world but poultry production is threatened by two main viral diseases, highly pathogenic avian influenza and Newcastle disease, with economic and public health implications worldwide. The introduction of highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in Africa in 2006 highlighted the necessity of a better understanding of avian influenza virus (AIV) in Africa. Through surveillance studies, we found that H5N1 virus was not circulating anymore in sub-Saharan Africa after 2008. However, phylogenetic analyses performed on the genome of low pathogenic H5N2 viruses found in wild birds in Nigeria revealed that they were reassortants. The similarity of one gene to those found in other AIV viruses from Southern Africa strengthened the hypothesis that AIV may actually persist and circulate in Africa. We have shown that new virulent strains of Newcastle disease virus (NDV) constituted the majority of the strains detected. Their genetic distance compared to other NDV strains, their genetic diversity and their geographic dispersion in West and Central Africa suggested that these strains probably evolved locally, that they circulated for some time in the region and that trade and movement of animals likely contributed to their spread. Our findings also suggested that the contribution of wild birds to the dispersion of virulent strains of NDV was probably limited. In Luxembourg however, wild birds may be an important player for the introduction of NDV strains

Dans le contexte de la menace pandémique liée au virus influenza A(H5N1), un projet «GRIPPE AVIAIRE ET GRIPPE PANDÉMIQUE » a émergé au sein de LyonBioPôle avec comme objectif le développement d’outils de caractérisation des virus influenza pour la production de vaccins. Pour étudier le réassortiment génétique entre virus influenza, nous avons développé 3 systèmes de génétique inverse : virus humain A(H3N2) et aviaires A(H5N2) et A(H5N1) et produit des virus réassortants de composition déterminée. Leurs capacités réplicatives ont été évaluées par cinétiques de croissance virale sur MDCK avec quantification de la production virale par qRT-PCR temps réel. L’émergence du virus influenza A(H1N1)2009 pose deux questions sur l’acquisition par réassortiment génétique, d’une résistance à l’oseltamivir d’une part ou de facteurs de virulence d’autre part. Nous avons donc développé un protocole de co-infection virale de cellules MDCK pour étudier les constellations de gènes des réassortants entre différents virus: A(H1N1)2009-A(H1N1) H275Y et A(H1N1)2009-A(H5N1). Nous montrons par deux approches différentes, génétique inverse et co-infections virales, que le réassortiment génétique entre souches aviaires et humaines et surtout aviaires et porcines est possible, en privilégiant certaines constellations. Nous rapportons que le virus pandémique peut acquérir la NA H275Y des virus A(H1N1) Brisbane-like résistants à l’oseltamivir sans que ses capacités de réplication ne soient altérées. De même nous montrons que son réassortiment avec un virus hautement pathogène A(H5N1) est possible. Ces observations renforcent la nécessité de promouvoir la vaccination afin de limiter les risques de co-infection virale chez un même individu. / In the context of A(H5N1) pandemics threat, an « avian flu and flu pandemics » project was proposed by LyonBioPole to develop influenza viruses characterization tools for vaccine production. To study genetic reassortment between influenza viruses, 3 reverse genetic systems of A(H3N2) human virus and A(H5N2) and A(H5N1) avian viruses were developed and reassortant viruses were produced. Their replicative capacities were evaluated using growth kinetics on MDCK cells with viral production quantification by real-time qRT-PCR. The A(H1N1)2009 emergence raises two questions about the acquisition by genetic reassortment of oseltamivir resistance and/or pathogenicity determinants. A co-infection protocol on MDCK cells was developed to study gene constellations of reassortant viruses like A(H1N1)2009-A(H1N1) H275Y and A(H1N1)2009-A(H5N1). We report here that genetic reassortment is possible between avian, human and swine strains using reverse genetic and viral co-infection and that some specific constellations emerged. We also report, that pandemic A(H1N1)2009 can acquire the H275Y mutated NA from seasonal oseltamivir resistant A(H1N1) viruses without any modifications on replicative capacities. This genetic reassortment is also possible with A(H5N1) viruses. These observations strenght the importance of vaccination against all these influenza strains to reduce the risk of one-individual viral co-infection.

Das Influenza A Virus (IAV) stellt weltweit eine ernstzunehmende Bedrohung für Gesundheit und Wirtschaft der Menschheit dar. Ein universeller und langanhaltender Impfstoff konnte noch nicht entwickelt werden und klinisch zugelassene Medikamente verlieren durch die rasante Entstehung von resistenten Stämmen zunehmend ihre Wirkung. Aus diesem Grund gewinnt die Erforschung neuer antiviraler Strategien zur Bekämpfung des Influenzavirus an Bedeutung zum Schutze unserer Gesellschaft. Eine vielversprechende Zielstruktur für die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente stellt das virale Hämagglutinin (HA) dar. Das HA liegt in hoher Dichte auf Influenzaviren vor und ermöglicht die Bindung an Sialinsäuren (SA) auf Wirtszellen und die Verschmelzung mit deren Lipidmembran. HA-bindende Moleküle entfalten eine hemmende Wirkung bereits bei dem ersten Kontakt mit Zellen, sodass eine Infektion erst gar nicht stattfinden kann. Aufgrund einer hohen HA-Dichte auf der Virusoberfläche eignen sich besonders multivalente SA tragende Nanopartikel für die Hemmung einer viralen Infektion. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, wurden in der vorliegenden Arbeit neue multivalente Binder gegenüber dem viralen Hämagglutinin (HA) entwickelt und studiert. Im Gegensatz zu bereits bekannten multivalenten Sialosiden, die in einer undefinierten räumlichen Orientierung auf Polymergerüsten präsentiert wurden, konnten in der vorliegenden Arbeit strukturelle Aspekte identifiziert werden, um Gerüstsysteme mit optimaler Rezeptorpräsentation gegenüber der Influenza A Virusoberfläche zu generieren. Neben SA-basierten Polymersystemen wurde auch ein gegen HA gerichtetes Peptid aus einem Antikörper identifiziert, welches sich auch für eine multivalente Interaktion mit IAV eignet. Diese Arbeit ermöglicht neue Einblicke in die Auswahl geeigneter Trägersysteme, eines optimalen Rezeptorabstandes und der Verwendung alternativer Rezeptoren mit dem Ziel einer Infektionshemmung von IAV. / Influenza A virus (IAV) still poses a serious threat to global health and economy of mankind. So far, a universal, long-lasting vaccine could not be developed, and clinically approved drugs are prone to lose activity due to the fast development of resistant strains. Because of this, research on new antiviral compounds and strategies to combat influenza viruses is of great importance for the protection of our society. A promising candidate for the development of novel antiviral drugs is the viral hemagglutinin (HA) protein. HA is present at high density on the viral envelope, which allows binding to sialic acid (SA) molecules on host cells and fusion with their membrane. Following, HA binding molecules have an inhibitory effect at the very first step of the infection cycle, leading to the inability of an infection. Based on a high HA density on the viral surface, SA carrying nanoparticles qualify for the inhibition of a viral infection. Based on this knowledge the study at hand demonstrates the development of new multivalent binders against viral HA and discusses them critically. In contrast to published multivalent sialosides, which are displayed in an undefined fashion on polymer scaffolds, the results of this thesis support the identification of structural requirements for the design of new scaffold systems with an optimal match to the viral surface. Beside sialoside based polymer systems, completely new peptide based systems, based on an HA binding antibody, were developed. Similar to polyglycerolsialosides, such multivalent peptide-decorated polymers were able to achieve nanomolar binding inhibition constants, too. In summary, this thesis enables new insights into the choice of a suitable carrier system, the optimal receptor spacing, and the use of alternative receptors with the ultimate goal of virus neutralization.

Mechanismen, die zur unterschiedlichen Pathogenität niedrig- und hochpathogener aviärer und humanpathogener Influenzaviren im Menschen beitragen, sind bisher nur ansatzweise verstanden. Auch sind Pathomechanismen, die der Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-CoV-Infektion zu Grunde liegen, bisher weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde ein humanes ex vivo Lungenkulturmodell für die Untersuchung der Influenzavirus- und der MERS-CoV-Infektion etabliert. Dabei wurde die Replikationsfähigkeit und der Zelltropismus der Viren systematisch verglichen. Während hochpathogene aviäre, saisonale und pandemische Influenzaviren effizient in der humanen Lunge replizierten, konnten sich niedrigpathogene aviäre Viren und ein porcines Virus kaum vermehren. Alle Viren zeigten jedoch den gleichen Zelltropismus und infizierten im Alveolarepithel ausschließlich Typ II Zellen. Die unterschiedliche Pathogenität dieser Viren lässt sich daher nicht durch Unterschiede im Zelltropismus erklären. Gleichwohl konnte der humane und der aviäre Influenzavirusrezeptor sowohl auf Typ II als auch auf Typ I Zellen nachgewiesen werden. Niedrigpathogene aviäre Influenzaviren sind in der humanen Lunge durch die Freisetzung von zum größten Teil nicht infektiösen Viruspartikeln restringiert. MERS-CoV replizierte in humanem Lungengewebe mit ähnlicher Kinetik wie ein hochpathogenes H5N1 Virus. MERS-CoV Antigen war sowohl im Bronchialepithel, Alveolarepithel sowie im Endothel nachweisbar. Der funktionelle Rezeptors des MERS-CoV, die Dipeptidylpeptidase 4, wurde in allen infizierten Zelltypen sowie in Alveolarmakrophagen nachgewiesen. Die mikroskopische Analyse infizierter Gewebeproben weist zudem auf einen infektionsbedingten Alveolarschaden hin. Die Studie trägt wesentlich zum pathophysiologischen Verständnis pulmonaler Influenzavirus- und MERS-CoV-Infektionen bei. Das humane ex vivo Lungenkulturmodell stellt ein klinisch relevantes Modell zur Untersuchung respiratorischer Infektionen im Menschen dar. / Mechanisms contributing to the different pathogenicity of low and highly pathogenic avian and seasonal influenza viruses in humans are currently only partially understood. Furthermore, underlying pathological mechanisms of the Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-CoV infection in humans are widely unknown. In this study a human ex vivo lung culture model was established, which allowed investigating influenza virus and MERS-CoV infection. Replication and cellular tropism of the different viruses were compared systematically. While highly pathogenic avian, seasonal and pandemic influenza viruses replicated efficiently, low pathogenic avian viruses and a porcine virus propagated poorly. However, all viruses showed the same cellular tropism and infected only type II cells within the alveolar epithelium. Therefore, the different pathogenicity of these viruses cannot be attributed to different cellular tropisms. Nevertheless, the human and the avian influenza virus receptor could be detected on type II and type I cells. Low pathogenic avian influenza viruses are restricted in the human lung by the release of mostly non-infectious progeny virus particles. The MERS-CoV replicated with similar kinetics to a highly pathogenic H5N1 virus in the human lung. MERS-CoV antigen was detected in the bronchial epithelium, alveolar epithelium and endothelium. The functional receptor of MERS-CoV, dipeptidylpeptidase 4, was found in all infected cell types and in alveolar macrophages. Microscopic analysis of infected tissue samples indicated an alveolar damage provoked by MERS-CoV infection. This study contributes substantially to the pathophysiological understanding of the pulmonary influenza virus and MERS-CoV infection. The human ex vivo lung culture model represents a clinically relevant model to investigate human respiratory infections.

Les virus influenza A ont suscité à partir de l’année 1997 un intérêtsanitaire et économique mondial considérable après l’émergence d’une formehautement pathogène d’un virus influenza aviaire H5N1. Cette épizootie a misen évidence le danger majeur que constitue la proximité entre espècessensibles sauvages et domestiques. En effet, pouvant présenter lescaractéristiques de réservoirs de ces virus, les canards étaient les plussoupçonnés de transmettre l’infection, grâce à une pratique migratoireimportante et d’un portage asymptomatique fréquent. Ce portage associe dans la plupart des cas des virus faiblement pathogènesde sous-types multiples. Ces virus peuvent se transmettre aux volaillesdomestiques et émerger en épizootie à virus hautement pathogène dans le casparticulier des sous-types H5 et H7. Ces épizooties peuvent avoir desconséquences économiques considérables, avec une mortalité avoisinant les100%, et sanitaire avec un possible passage à l’homme. Notre projet vise à caractériser l’infection et la transmission des virusinfluenza faiblement pathogènes, après inoculation expérimentale à unepopulation de canards de surface et plongeurs. Il répond également à lanécessité d’établir des méthodes de surveillance des virus influenzaaviaires à l’arrivé des oiseaux migrateurs dans des zones humides à richepatrimoine ornithologique, et situées à proximité de régions à fortpotentiel en matière de production avicole (La Dombes comme exemple). / Since 1997, influenza A viruses has given rise to great sanitary andeconomic interest after the emergence of a highly pathogenic subtype ofavian influenza virus H5N1. This epizooty underlined the threat that couldbe the closeness of wild and domestic birds. Ducks which were actuallyshowing reservoirs characteristics were suspected to pass on the virusthanks to their migratory habits and asymptomatic porterage.This porterage mostly involves low pathogenic viruses of numerous subtypes.Those viruses could be transmitted to domestic poultries and emerge, in thecase of H5 and H7 subtypes, in a viral highly pathogenic epizooty. Thoseepizooties may have major economic (average 100% mortality) and sanitary(possible transmission to humans) consequences.Our study aims to characterize the infection and the transmission of lowpathogenic avian influenza viruses, after experimental inoculation tosurface and diving ducks. It suggests setting up epidemiologic surveillancemethods of avian influenza viruses after the arrival of migratory birds inmost important wetlands, which are close to major poultry breeding regions(The Dombes for instance).

Der Viruspartikelzusammenbau hängt von der Anreicherung viraler Untereinheiten in spezifischen Domänen der PM ab. Es wird vorgeschlagen, dass Membran-Rafts – geordnete, sphingomyelin- und cholesterinreiche Mikrodomänen in der PM – als lokale Rekrutierungsstellen dienen. Hämagglutinin (HA) ist ein homotrimeres Glykoprotein in der Hülle des Influenzavirus. Es dient der Bindung an die Wirtszelle und der Fusion mit dem Endosom. Es wird angenommen, dass HA bei der Abschnürung der Viruspartikel von der Zelle mitwirkt. Zwei Hauptbeobachtungen führten zu der Hypothese, dass sich HA in Lipid-Mikrodomänen einlagert: HA wurde biochemisch in Detergens-resistenten Membranen nachgewiesen und die Virushülle ist mit raftbildenden Lipiden angereichert. Um die Rolle der HA-Transmembrandomäne für die Lipid-Raft-Inkorporation aufzuklären, wurde ein Konstrukt entwickelt, das den C-Terminus von HA mit dem gelb fluoreszierenden Protein YFP fusioniert, und die Transmembrandomäne, nicht aber die N-terminale Ektodomäne von HA enthält. In transfizierten Säugetierzellen wurde der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zwischen diesem Konstrukt und einem GPI-verankerten cyan fluoreszierenden Protein CFP (Raft-Marker) durch Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich HA-Konstrukte in Cholesterin-abhängigen Lipiddomänen anreichern, was durch eine erhöhte FRET-Effizienz nachgewiesen wurde. Zudem führen ein Cholesterinentzug aus der PM und die Deletion hochkonservierter Palmitylierungsstellen zu einer signifikanten Verringerung selbiger; sehr gering war diese zwischen dem HA-Konstrukt und einem Nicht-Raft-Marker. Darüberhinaus konnte durch ortsspezifische Mutagenese gezeigt werden, dass die verwendeten Konstrukte disulfidbrückenverbundene Oligomere bilden, welche Voraussetzung für den Transport der Konstrukte an die PM sind. Zeitaufgelöste Anisotropiemessungen ergaben für diese ein starkes Homo-FRET-Signal, welches die Oligomerisierungshypothese bestätigt. / Numerous enveloped viruses bud from the host cell plasma membrane (PM). Assembly of the new viral particles depends on the accumulation of the viral subunits at specific sites of the cell membrane. Lipid domains or rafts enriched of sphingomyelin and cholesterol were suggested as sites for local recruitment of viral components. Hemagglutinin (HA), a homotrimeric glycoprotein embedded in the envelope of influenza virus, mediates binding of the virus to the host cell and fusion between the viral envelope and the endosomal membrane. HA might play an important role in budding of the viral particles from the host cell. Two observations led to the suggestion that HA entraps in lipid microdomains. First, HA was rescued in DRM fractions, second the viral envelope was found to be enriched in lipids generally forming rafts. To elucidate the role of the HA transmembrane domain in lipid raft localization we expressed constructs harboring the transmembrane domain and the cytoplasmic tail but lacking the N-terminal ectodomain of HA in the PM of mammalian cells. We studied energy transfer (FRET) between these constructs and a GPI anchored CFP as a raft marker by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Our results suggest that HA constructs are indeed sorted into cholesterol-dependent lipid domains since cholesterol depletion of the PM caused a significant decrease of FRET efficiency. Likewise, deletion of the three highly conserved palmitoylation sites of HA is also accompanied by a reduction of FRET efficiency. Site directed mutagenesis demonstrated that TMD-HA constructs form disulfide linked oligomers and that oligomerization is fundamental for the transport to the PM. This result was corroborated by time resolved anisotropy measurements that revealed strong homoFRET between TMD-HA-YFP molecules, thus indicating protein clustering. Accordingly, trimerization of full length HA is fundamental for stability and the subsequent delivery of the protein to the cell surface.

Das Hüllglykoprotein Hämagglutinin (HA) von Influenzavirus ist verantwortlich sowohl für die Bindung als auch für die nachfolgende Fusion der viralen Hülle mit der endosomalen Membran. Eine Analyse der 3D Struktur der HA-Ektodomaine zeigt, dass die Stabilität des Proteins sowohl durch kovalente als auch durch nicht-kovalente Wechselwirkungen bedingt ist. Die Konformationsänderung von HA bei saurem pH-Wert weißt auf eine mögliche Rolle von Protonierungseffekten auf ionisierbare Aminosäuren hin. Untersuchungen zur Bedeutung geladener Aminosäuren und Salzbrücken für die Struktur des HA wurden auf der Grundlage von ‚site directed mutagenesis’ durchgeführt. Der Einfluss der Mutationen auf die Konformationsänderung und die Fusionsaktivität von HA wurden durch einen Proteinase K-Assay bzw. Fluoreszenzmikroskopie erfasst. Die Ergebnisse beider Methoden wurden miteinander korreliert. Abgesehen von der Mutante R109E zeigten Wildtyp-HA und alle anderen Mutanten eine vergleichbare Oberflächenexpression. Die beobachteten Unterschiede in der pH-Abhängigkeit der Konformationumwandlung zwischen Wildtyp-HA und HA-Mutanten zeigen, daß eine Zerstörung von Salzbrücken und ggf. eine Erhöhung der elektrostatischen Abstoßung an den betrachteten Kontakstellen sehr wahrscheinlich eine Herabsetzung der energetischen Barriere der Konformationsumwandlung verursacht. Dieser Ergebnisse erklären die molekularen Grundlagen des erhöhten pH-Schwellwertes der HA-Konformationsumwandlung von Amantadin-resistenten Influenzaviren. Im Gegensatz wurde für Mutanten, die die Stabilität von HA erhöhten, keine Konformationsumwandlung bei einem pH-Wert beobachtet, der typisch für die Konformationumwandlung von Wildtyp-HA war. Aminosäuren, die denen dieser stabiliserenden Mutationen entsprachen, wurden in einer natürlichen Influenzavirusvariante – A/JPN/305/57 – gefunden. Die Bedeutung von Ladungen für die Stabilität der HA-Ektodomaine wird dadurch unterstrichen, dass eine Konservierung einer positiven Ladung und insbesondere eines Argininrestes in der Position 109 (Nummerierung auf der Basis von HA X31) für alle Influenzaviren A und B gefunden wurde. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass sehr wahrscheinlich eine komplexe Salzbrücke an der Kontaktfläche zwischen HA1 und HA2 für alle Influenzaviren A evolutionär konserviert ist. / Hemagglutinin (HA), a major envelope glycoprotein is responsible for fusing viral and endosomal membranes during influenza virus entry. The analysis of 3D crystal structure of the HA ectodomain shows that the stability of protein is maintained by both non-covalent and covalent interactions. The conformational change of HA at low pH indicates a role for protonation effects of the ionisable amino acids. Structural investigations were done using “site directed mutagenesis” in order to conceive the importance of charged amino acids and more emphatically the involvement of salt bridges. The effect of mutations on the conformational change and fusion activity was probed by proteinase K assay and fluorescence microscopy respectively. It was observed that HA-wt and all the mutants except R109E showed comparable surface expression. The difference in pH threshold between the HA-wt and the mutants showed that breakage of salt bridge and further incorporation of repulsion at the considered interfaces would lower the energy barrier requirements for the conformational change. The results explain the molecular basis of the higher pH threshold for naturally occurring amantadine resistant mutants. On the other hand, mutants designed to stabilise the HA were resistant to conformational changes at those pH values which typically trigger the conformational change of HA-wt. Coincidentally these mutations were found to be existing in the natural variant of H2 Japan subtype (A/JPN/305/57). Interestingly, the study shows that a positive charge and, more specifically, an Arg residue at position 109 (numbering based on X-31 strain) is conserved in all of the influenza A and B viruses underlining the relevance of electrostatic interactions for the HA stability. Aptly a complex salt bridge at the interface of HA1 and HA2 is probably conserved evolutionarily in all the members of influenza A virus.

Das Auftreten des pandemischen H1N1-Influenzavirus 2009 und die kontinuierliche Übertragung hochpathogener H5N1-Viren (HPAIV) auf den Menschen verdeutlichen die Wichtigkeit zoonotischer Übertragungen. Bis heute sind die Restriktion tierpathogener Influenzaviren und die hohe Virulenz der HPAIV im Menschen nicht vollständig geklärt. Verschiedene Modelle wurden zur Studie von Influenzaviren verwendet, u. a. Zelllinien, die jedoch die Komplexität und Zelltypen der humanen Lunge nur unzureichend wiedergeben. Daher wurde ein humanes ex vivo Lungenkulturmodell etabliert in welchem die komplexe Struktur und die verschiedenen Zelltypen der humanen Lunge erhalten bleiben. Mit Hilfe dieses Modells und primären und permanenten humanen Zellen wurden saisonale, pandemische, porzine, HPAIV und niedrigpathogene aviäre Influenzaviren (LPAIV) systematisch hinsichtlich Replikation, Cytokininduktion und Zelltropismus verglichen. HPAIV replizierten wie auch saisonale und pandemische Viren zu hohen Titern, während sich LPAIV und ein porzines Virus kaum vermehrten. Einhergehend mit dem Vorhandensein aviärer Rezeptoren waren LPAIV dennoch fähig Lungenkulturen und Zellen zu infizieren und es fanden sich keine Unterschiede im Vorhandensein und in der Lokalisation viraler Proteine. Die Infektion mit HPAIV und LPAIV führten im Lungenmodell zu einer erhöhten Induktion von IP10, MIP1β, IFNβ und IL1β, während saisonale und pandemische H1N1-Viren nur geringe Cytokinspiegel hervorriefen. Trotz der hier beobachteten Unterschiede in der Replikation und Cytokininduktion infizierten alle Viren überwiegend Typ II Pneumozyten. Dies impliziert, dass sich die gezeigten Unterschiede zwischen saisonalen und aviären Viren nicht durch Unterschiede im Zelltropismus erklären lassen. Die im Rahmen dieser Studie erzielten Ergebnisse korrelieren gut mit klinischen Beobachtungen. Dies verdeutlicht den Wert humaner ex vivo Kulturen um weitere Einblicke in das pathophysiologische Verhalten von Pathogenen zu bekommen. / The emergence of the pandemic H1N1 influenza A virus in 2009 and the continuous threat by highly pathogenic avian H5N1 human infections underlines the importance of zoonotic transmissions. The inability of most animal influenza viruses to replicate efficiently in the human respiratory tract and the high virulence of highly pathogenic avian H5N1 viruses (HPAIV) are still not fully understood. Several models have been used to study influenza virus infections including human cell lines that lack the complexity and cell diversity of the human lung. Therefore, a human lung explant model in which the three-dimensional structure of the human lung is preserved along with the different cell-cell interactions was established. Using this model and commonly used primary and permanent respiratory cells, replication, cytokine induction and cell tropism of human, avian, swine and pandemic 2009 virus was systematically compared. It was shown that HPAIV as well as seasonal and pandemic 2009 viruses replicated to high titers while a low pathogenic avian (LPAIV) or a classical swine virus only replicated inefficiently. However, along with the presence of avian receptors, LPAIV was able to infect human lung explants and cells and there were no differences in abundance and localization of proteins. Infection of human lung explants with the HPAIV and LPAIV lead to a pronounced induction of IP10, MIP1β, IFNβ and IL1β while seasonal and pandemic 2009 viruses caused only a low cytokine response. Despite their differences in replication and cytokine induction, LPAIV and the seasonal virus both primarily targeted type II pneumocytes suggesting that the observed differences between the two viruses are not due to differences in cell tropism in the human lower respiratory tract. The experimental findings obtained in this study are compatible with clinical observations highlighting the value of ex vivo human lung explants to provide insights into viral pathophysiological behavior in humans.

Le virus de la grippe est un virus à ARN négatif appartenant à la famille des Orthomyxoviridae qui se compose de 7 membres dont les virus influenza A, B, C et D. Le génome viral comprend 7 à 8 particules ribonucléoprotéiques (RNP) au sein desquelles l’ARN viral (ARNv) est recouvert de multiples copies de nucléoprotéines (NP) et est associé à l’ARN polymérase virale via ses extrémités 3’ et 5’. Au cours de ce travail de thèse, nous nous sommes tout d’abord focalisés sur l’étude biochimique de NP A et NP B et avons pu mettre en évidence des comportements différents en ce qui concerne leurs propriétés d’oligomérisation en présence ou en absence d’ARN et en fonction de la concentration en sel. Pour la première fois nous avons pu observer une structure similaire aux RNP mais reconstituée uniquement à partir de NP A et d’un ARN de 12 nucléotides. Nous avons pu formuler l’hypothèse que 12 nucléotides de l’ARN serait fixés à la NP avec une forte affinité tandis que le reste de l’ARN fixerait la NP avec une affinité beaucoup plus faible. En parallèle nous avons résolu la structure cristallographique de la nucléoprotéine de la grippe de type D et réaliser la caractérisation de son interaction avec l’importine-α7 humaine. Enfin nous avons étudié la fixation de l’ARN sur NP D et mis en évidence l’importance de l’extrémité C-terminale dans le processus de fixation à l’ARN. Ces informations ont permis de formuler de nouvelles hypothèses quant au fonctionnement du virus de la grippe et permettre d’inscrire ce projet de thèse dans une dynamique globale de lutte contre ce virus. / Influenza virus is a negative RNA virus belongs to the Orthomyxoviridae family which consists of 7 members including influenza viruses A, B, C and D. The viral genome comprises 7 to 8 ribonucleoprotein particles (RNP) in which the viral RNA (vRNA) is coated with multiple copies of nucleoproteins (NP) and is associated with the viral RNA polymerase by its 3 'and 5' ends. In this thesis, we first focused on the biochemical study of NP A and NP B and we demonstrate that there are different behaviors with regard to their oligomerization properties in the presence or absence of RNA and as a function of the salt concentration. For the first time we were able to observe a structure very similar to RNP which was reconstituted only from NP A and a 12 nucleotide RNA. Thus, we formulate the hypothesis that 12 nucleotides of the RNA would bind NP with a very strong affinity while the rest of the RNA would bind NP with a lower affinity. In parallel, we solved the crystallographic structure of the nucleoprotein of influenza D virus and we characterized its interaction with human importin-α7. Finally, we studied the binding of RNA on NP D and we demonstrated the importance of the C-terminal end in the RNA binding process. This thesis project made it possible to formulate new hypotheses concerning the functioning of the influenza virus and to include this thesis project in a global dynamic of combating the influenza virus.

Influenza virus is one of the major respiratory pathogens of humans as well as animals, including equines. There is an increasing evidence that bacterial infections are the most common cause of the death during influenza. In horses also, secondary bacterial pneumonia can lead to death, and surviving horses may take up to six months for the complete recovery resulting in heavy economic loss to the equine industry. Interleukin (IL)-23 mediated innate immune response has been shown to protect the host from various respiratory bacterial infections. However, studies to investigate the role of host and viral factors in the regulation of IL-23 are limited. Endoplasmic reticulum (ER) stress-induced transcription factor CHOP-10 and IFN-β has been shown to participate in the regulation of IL-23. Primary hypothesis for the current study was that influenza A virus (IAV) NS1 protein downregulates the IL-23 expression via inhibition of CHOP-10. In order to test our hypothesis, we infected the RAW264.7 cells - a murine macrophage cell line, and primary murine alveolar macrophage cells either with the wild type Influenza A virus (PR/8/34, PR8) or isogenic mutant virus lacking NS1 (delNS1). Quantitative analysis of mRNA expression revealed a significantly higher mRNA expression of IL23p19, IFN-β and CHOP-10 in delNS1 virus infected cells as compared the PR8 virus infected cells. Additionally, overexpression of CHOP-10 partially restored the expression of IL-23p19 in PR8 virus infected cells and knockdown of CHOP-10 resulted in downregulated expression of IL-23p19 in delNS1 infected cells. Taken together, these results suggest that IAV NS1 protein mediated inhibition of CHOP-10 expression leads to downregulation of IL-23 expression in macrophage cells in-vitro. Similar results were also observed in-vivo using IAV and Streptococcus zoooepidemicus (S. ze) co-infection model. In a co-infection mouse model delNS1 virus co-infection resulted in significantly higher expression of the IL-23 and IL-17. Considering the role of IL-23 in protection against respiratory bacterial pathogens, effect of exogenous supplementation of IL-23 was also investigated in the influenza and S. ze co-infection mouse model. We found that a single intranasal dose of recombinant murine IL-23 significantly improved the survival of mice co-infected with PR8 and S .ze. Overall, our study suggests that IAV infection subverts the IL-23 mediated respiratory innate immune response and restoration of IL-23 could protect from influenza-associated respiratory bacterial infections.