O presente trabalho teve por objetivo estudar a herança genética, determinar o melhor protocolo de extração de DNA para esta espécie, e identificar marcadores moleculares associados à resistência de leiteiro (Euphorbia heterophylla L.) aos herbicidas inibidores da ALS e da PROTOX. A herança genética da resistência foi determinada a partir de cruzamentos entre os biótipos de E. heterophylla suscetível (S) e resistente (R), retrocruzamentos e avanço de geração para F2. A dominância completa da resistência foi comprovada com curvas de dose resposta. Foram testados dez protocolos de extrações de DNA adaptados de métodos descritos na literatura. Os iniciadores específicos para os genes ALS e PROTOX foram desenhados a partir da sequência de DNA consenso destes genes, obtida pelo alinhamento das espécies Manihot esculenta e Ricinus communis. Adicionalmente, foi testada a transferibilidade de vinte marcadores SSRs (sequências simples repetidas) desenhados para o genoma de Manihot esculenta, pois dentre espécies de Euphorbiaceae com maior número de marcadores SSRs desenvolvidos, é a espécie filogeneticamente mais próxima de E. heterophylla. Em relação à herança genética, as frequências observadas nas gerações F1, F2, RCs e RCr não diferiram estatisticamente das frequências esperadas para característica controlada por dois genes dominantes para resistência múltipla e um gene dominante para resistência simples aos inibidores da ALS e PROTOX. Os níveis similares de resistência observados para o heterozigoto F1 e o biótipo homozigoto R, para doses de até 2000 g i.a. ha-1 de fomesafen e doses de até 800 g i.a. ha-1 de imazethapyr, confirmam a dominância completa da resistência aos inibidores da PROTOX e ALS, respectivamente. O protocolo 0,2%BME possibilitou a extração de 7,083 ng μL-1 de DNA, sendo estatisticamente (P=0,05) superior aos demais protocolos. Os compostos fenólicos contaminaram o DNA extraído pelos protocolos FENOL e 3%BME+TB, mas a adição de polivinilpirrolidona (PVP40) no tampão de extração do protocolo 3%BME+TA solucionou este problema. Os iniciadores desenhados para os genes ALS e PROTOX não amplificaram ou não apresentaram polimorfismo visível em gel de agarose entre os biótipos S e R de E. heterophylla. Dez marcadores SSR foram transferidos para E. heterophylla e destes, seis iniciadores apresentaram polimorfismo entre os biótipos S e R. / This study aimed to assess the genetic inheritance, determine the better DNA isolation protocol for this species and to identify molecular markers associated with the Wild Poinsettia (Euphorbia heterophylla L.) resistance ALS- and PROTOX- inhibiting herbicides and. The genetic inheritance of resistance was determined from crosses between E. heterophylla biotypes susceptible (S) and resistant (R), backcrosses and F2 generation. The complete dominance of resistance was confirmed with dose response curves. Ten adjusted methods for DNA isolation described in the literature were tested. The specific primers for ALS and PROTOX genes were designed from the consensus DNA sequence of these genes, obtained by aligning the gene sequences of the species Manihot esculenta and Ricinus communis L. Additionally, it was assessed the transferability of twenty SSR (simple sequence repeat) markers designed for Manihot esculenta, because among the species of Euphorbiaceae with more developed SSRs markers, because it is the closest relative phylogenetic species of E. heterophylla. Regarding genetic inheritance, the frequencies observed in the F1, F2, RCs and RCr did not differ significantly from the expected frequencies for a trait controlled by two dominant genes for multiple resistance and a single dominant gene for simple resistance to ALS- and PROTOX-inhibiting herbicides. The similar levels of resistance to dosage up to 2000 g i.a. ha-1 of fomesafen and dosage up to 800 g i.a. ha-1 of imazethapyr observed in F1 (heterozygous) and homozygous R biotype confirm the complete dominance of resistance to PROTOX- and ALS-inhibiting herbicides, respectively. The 0.2%BME protocol allowed the isolation of 7,083 ng μL-1 DNA, significantly (P=0.05) higher than other methods. Co-isolation of phenolic compounds was observed in FENOL and 3%BME+TB methods, but the addition of polyvinylpyrrolidone (PVP40) in the protocol extraction buffer 3%BME+TA solved this problem. The primers designed for ALS and PROTOX genes amplified but not showed no visible polymorphism in agarose gel between the S and R biotypes of E. heterophylla. Regarding the SSR transferability, ten markers were transferred to E. heterophylla, however, these six primers showed polymorphism among S and R biotypes.

O presente trabalho teve por objetivo estudar a herança genética, determinar o melhor protocolo de extração de DNA para esta espécie, e identificar marcadores moleculares associados à resistência de leiteiro (Euphorbia heterophylla L.) aos herbicidas inibidores da ALS e da PROTOX. A herança genética da resistência foi determinada a partir de cruzamentos entre os biótipos de E. heterophylla suscetível (S) e resistente (R), retrocruzamentos e avanço de geração para F2. A dominância completa da resistência foi comprovada com curvas de dose resposta. Foram testados dez protocolos de extrações de DNA adaptados de métodos descritos na literatura. Os iniciadores específicos para os genes ALS e PROTOX foram desenhados a partir da sequência de DNA consenso destes genes, obtida pelo alinhamento das espécies Manihot esculenta e Ricinus communis. Adicionalmente, foi testada a transferibilidade de vinte marcadores SSRs (sequências simples repetidas) desenhados para o genoma de Manihot esculenta, pois dentre espécies de Euphorbiaceae com maior número de marcadores SSRs desenvolvidos, é a espécie filogeneticamente mais próxima de E. heterophylla. Em relação à herança genética, as frequências observadas nas gerações F1, F2, RCs e RCr não diferiram estatisticamente das frequências esperadas para característica controlada por dois genes dominantes para resistência múltipla e um gene dominante para resistência simples aos inibidores da ALS e PROTOX. Os níveis similares de resistência observados para o heterozigoto F1 e o biótipo homozigoto R, para doses de até 2000 g i.a. ha-1 de fomesafen e doses de até 800 g i.a. ha-1 de imazethapyr, confirmam a dominância completa da resistência aos inibidores da PROTOX e ALS, respectivamente. O protocolo 0,2%BME possibilitou a extração de 7,083 ng μL-1 de DNA, sendo estatisticamente (P=0,05) superior aos demais protocolos. Os compostos fenólicos contaminaram o DNA extraído pelos protocolos FENOL e 3%BME+TB, mas a adição de polivinilpirrolidona (PVP40) no tampão de extração do protocolo 3%BME+TA solucionou este problema. Os iniciadores desenhados para os genes ALS e PROTOX não amplificaram ou não apresentaram polimorfismo visível em gel de agarose entre os biótipos S e R de E. heterophylla. Dez marcadores SSR foram transferidos para E. heterophylla e destes, seis iniciadores apresentaram polimorfismo entre os biótipos S e R. / This study aimed to assess the genetic inheritance, determine the better DNA isolation protocol for this species and to identify molecular markers associated with the Wild Poinsettia (Euphorbia heterophylla L.) resistance ALS- and PROTOX- inhibiting herbicides and. The genetic inheritance of resistance was determined from crosses between E. heterophylla biotypes susceptible (S) and resistant (R), backcrosses and F2 generation. The complete dominance of resistance was confirmed with dose response curves. Ten adjusted methods for DNA isolation described in the literature were tested. The specific primers for ALS and PROTOX genes were designed from the consensus DNA sequence of these genes, obtained by aligning the gene sequences of the species Manihot esculenta and Ricinus communis L. Additionally, it was assessed the transferability of twenty SSR (simple sequence repeat) markers designed for Manihot esculenta, because among the species of Euphorbiaceae with more developed SSRs markers, because it is the closest relative phylogenetic species of E. heterophylla. Regarding genetic inheritance, the frequencies observed in the F1, F2, RCs and RCr did not differ significantly from the expected frequencies for a trait controlled by two dominant genes for multiple resistance and a single dominant gene for simple resistance to ALS- and PROTOX-inhibiting herbicides. The similar levels of resistance to dosage up to 2000 g i.a. ha-1 of fomesafen and dosage up to 800 g i.a. ha-1 of imazethapyr observed in F1 (heterozygous) and homozygous R biotype confirm the complete dominance of resistance to PROTOX- and ALS-inhibiting herbicides, respectively. The 0.2%BME protocol allowed the isolation of 7,083 ng μL-1 DNA, significantly (P=0.05) higher than other methods. Co-isolation of phenolic compounds was observed in FENOL and 3%BME+TB methods, but the addition of polyvinylpyrrolidone (PVP40) in the protocol extraction buffer 3%BME+TA solved this problem. The primers designed for ALS and PROTOX genes amplified but not showed no visible polymorphism in agarose gel between the S and R biotypes of E. heterophylla. Regarding the SSR transferability, ten markers were transferred to E. heterophylla, however, these six primers showed polymorphism among S and R biotypes.

Made available in DSpace on 2018-06-27T18:56:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Luciana dos Santos Lopes.pdf: 903442 bytes, checksum: 9241c2c46a0d205e6d9e1b049687e5f7 (MD5) Luciana dos Santos Lopes.pdf.jpg: 3030 bytes, checksum: 0c80e97bb571acad00dbccdd7ce7c921 (MD5) Previous issue date: 2009-01-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The NTPDase (apirase-ect, ect-difosfoidrolase, CD39, EC 3.6.1.5) hydrolyses tri nucleotides and/or diphosphate. It is an ectonucleotidase, identified as the antigen surface of lymphoid cells, whose greatest expression leads to an increase in activity of ATPase and ADPase and these cells through the hydrolysis of ATP and ADP. The inhibitor of ecto-nucleotidases may represent valuable therapeutic tools to amplify the biological effects of extracellular nucleotides, since they induce apoptosis in lymphocytes, causing a state of immunosuppression. It is known through the literature that sodium azide produces a significant inhibition in the hydrolysis of ATP and ADP, caused this enzyme when it is used in concentrations around 20mM. The azides are chemical components widely used in organic synthesis, and remarkably stable in biological environment. The aim of this study was to determine the inhibitory effects of an organic azide derived from acetic acid in the hydrolysis of ATP and ADP, which is the activity of NTPDase of human lymphocytes. Since changes in distribution and activity of this enzyme have been reported in various pathological conditions, demonstrating its participation in the activation of lymphocyte, it is believed that the identification of new compounds inhibiting NTPDase will contribute to treatment of diseases where there is a need for immunosuppression, as allergies and autoimmune diseases. After incubation of lymphocytes in medium containing different concentrations of azide organic, there was a significant inhibition of ADP in the hydrolysis when used concentrations of 10 and 20 mM, and this of 50 and 77% respectively. Unverified inhibitory effects on the ATP hydrolysis with organic azide. A changed the hydrolysis of nucleotide adenine diphosphate, indicating that the substance could be used as an inhibitor of mixed NTPDase. / A NTPDase (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase, CD39, EC 3.6.1.5) hidrolisa nucleotídeos tri e/ou difosfatados. É uma ectonucleotidase, identificada como antígeno de superfície de células linfóides, cuja maior expressão leva a um aumento das atividades de ATPase e ADPase nestas células. Os inibidores de ecto-nucleotidases podem representar valiosas ferramentas terapêuticas para amplificar os efeitos biológicos dos nucleotídeos liberados no meio extracelular, uma vez que estes induzem apoptose nos linfócitos, causando um estado de imunodepressão. Sabe-se através da literatura que azida sódica, quando utilizada em concentrações em torno de 20mM, produz uma significativa inibição na hidrólise de ATP e ADP causada por esta enzima. As azidas são componentes químicos muito usados em sínteses orgânicas, sendo notavelmente estáveis em ambiente biológico. Este trabalho, procurou determinar os efeitos inibitórios de uma azida orgânica derivada do ácido acético na hidrólise de ATP e ADP, ou seja, na atividade da NTPDase de linfócitos humanos. Uma vez que alterações na atividade e distribuição desta enzima têm sido relatadas em várias condições patológicas, demonstrando sua participação na ativação do linfócito, acredita-se que a identificação de novos compostos inibidores da enzima NTPDase venha a contribuir em patologias onde há necessidade de uma imunossupressão, como em alergias e doenças autoimunes. Após incubação dos linfócitos em meio contendo diferentes concentrações de azida orgânica, verificou-se uma inibição significativa na hidrólise do ADP quando utilizadas as concentrações de 10 e 20 mM, sendo esta de 50 e 77%, respectivamente. Não foram verificados efeitos inibitórios sobre a hidrólise do ATP. A azida orgânica alterou a hidrólise dos nucleotídeos da adenina difosfatados, indicando que esta substância poderia ser utilizada como um inibidor da NTPDase, cujo tipo de inibição causada seria mista.

O estabelecimento de uma camada híbrida adequada no canal radicular representa um dos principais desafios clínicos devido à dificuldade de acesso. Dessa forma, o uso de inibidores proteolíticos poderia tornar-se um recurso favorável. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de inibidores proteolíticos na união de pino de fibra de vidro fixado com cimento adesivo, considerando os terços radiculares e tempos distintos, por meio da resistência de união (RU). Cento e quarenta e quatro raízes bovinas foram selecionadas e divididas em 6 grupos de tratamento, e redivididas em 3 subgrupos de acordo com os tempos de avaliação de 24 horas, 6 e 12 meses (n=8). Após o tratamento endodôntico e desobturação padronizados, as raízes foram cimentadas com pinos de fibra de vidro cônicos (Exacto/Angelus). As raízes foram tratadas com sistema adesivo convencional de três passos, Adper Scotchbond Multipurpose/ 3M ESPE (SBMP) e cimento dual RelyX ARC/ 3M ESPE. Após prévia divisão, foram alocadas em grupos CN (Controle Negativo- sem pré tratamento associado), CP (Controle Positivo- com agentes ativador e catalisador), EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético a 17%), CHX (digluconato de clorexidina a 2%), E-5 (E- 64 a 5 M) e E-10 (E-64 a 10 M). Após 24 horas, as raízes foram seccionadas perpendicularmente ao longo eixo e identificadas quanto à região, obtendo-se fatias de 1 mm de espessura (cervical, médio e apical), que foram armazenadas em saliva artificial para serem testadas. Todas as fatias foram submetidas ao teste de extrusão (push-out) na máquina de teste universal (Instron) com célula de carga de 50 N a 0,5 mm/min. Os dados foram analisados pelo teste de ANOVA a três critérios e comparações múltiplas com Tukey, ambos com p<0,05. Após 24 horas, não se observou diferenças entre os tratamentos. Após 6 meses, a CHX demonstrou melhor desempenho, cujo efeito não se prorrogou até os 12 meses. O uso de inibidores proteolíticos não foram capazes de preservar a resistência de união dos pinos intrarradiculares até o tempo de 12 meses. / The adequate establishment of hybrid layer in the root canal on bonding process is still a clinical challenge due to its hard access. Thus, the use of proteolytic inhibitors could become a favorable tool. The aim of this study was to evaluate the effect of proteolytic inhibitors in the bonding of a glass- fiber post fixed with a luting cement, regarding the root thirds and different times through the bond strength. One hundred and forty four bovine roots were selected and divided into 6 treatment groups, and subdivided according to the time of evaluation of 24 hours, 6 and 12 months (n=8). After endodontic treatment and standardized removal procedure, the roots were cemented with tapered glass fiber posts (Exacto/ Angelus). The roots were treated with three-step etch-and-rinse adhesive system Adper Scotchbond Multipurpose/ 3M ESPE (SBMP) and dual cement RelyX ARC/ 3M ESPE. After previous division, CN (negative- control without pre associated treatment), CP (Control positive- with activator and catalyst agents) EDTA (17% ethylenediaminetetraacetic acid) CHX (2% chlorhexidine digluconate) E-5 (5M E-64) and E-10 (10M E-64). After 24h, the roots were sectioned perpendicular to the long axis and identified according to third in 1mm thick slices (cervical, middle and apical), which were stored in artificial saliva to be tested. All slices were subjected to extrusion tests (push-out) in the universal test machine (Instron) at 50 N load cell at 0.5 mm/min. Data were analyzed with three-way ANOVA and multiple comparisons with Tukey test, both with p <0.05. After 24 hours, no differences were observed between treatments. After 6 months, CHX showed better performance, which did not last up 12 months. The proteolytic inhibitors performed differently in the bonding process over time; only CHX promoted inhibition at 6 months. The use of proteolytic inhibitors were not able to maintain the bond strength of intraradicular posts up time of 12 months.

Realizamos uma caracterização estrutural e eletrônica dos inibidores enzimáticos E-64 e CA030 utilizando técnicas de química quântica. Otimizações de geometria são realizadas em nível ab initio com os métodos Hartree-Fock e Teoria do Funcional da Densidade e estas estruturas são então comparadas com os resultados cristalográficos obtidos do Protein Data Bank. O cálculo do espectro de vibração infravermelho foi realizado para assegurar que as estruturas eram pontos de mínimo. Nós também fizemos a atribuição das freqüências vibracionais aos grupos funcionais das moléculas. A caracterização eletrônica é obtida com o cálculo do espectro de absorção ultravioleta-visível. Efeitos de solvente são contabilizados através da teoria de Campo de Reação Auto-Consistente. Uma análise detalhada das excitações do espectro calculado do E-64 e do CA030 é realizada e nós estudamos particularmente as transições características em torno de 200 nm. Tanto para o E-64 como para o CA030 nós identificamos o cromóforo responsável pela transição característica dos inibidores. Adicionalmente, nós levamos em consideração a influência da interação do CA030 com a catepsina B através do cálculo do espectro ultravioleta-visível do inibidor com o aminoácido cisteína. / We have made a structural and electronic characterization of the enzyme inhibitors E-64 and CA030 using quantum chemistry techniques. Geometry optimizations are performed in the ab initio level with the Hartree-Fock and Density Functional Theory methods and these structures are then compared with crystallographic results obtained from the Protein Data Bank. The infrared vibration spectrum calculation has been carried out to assure that the theoretical structures are true minima. We also have made an assignment of the vibrational frequencies to the functional groups of the molecules. The electronic characterization is performed with the calculation of the ultraviolet-visible absorption spectrum. Solvent effects are taken into account the Self Consistent Reaction Field theory. A detailed analysis of the calculated spectra of E-64 and CA030 excitations is given and we have particularly studied the characteristic transitions around 200 nm. For both the E-64 and the CA030 we have identified the chromophore responsible for the characteristic transition of the inhibitors. In addition, we have considered the influence of the interaction of the CA030 with the enzyme cathepsin B by calculating the ultraviolet-visible spectrum of the inhibitor with the cysteine amino acid.

A cruzaína é a principal cisteíno protease encontrada no parasito Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da Doença de Chagas. A enzima é essencial para o desenvolvimento e sobrevivência do parasito dentro do hospedeiro e possui uma excelente validação pré-clínica como alvo susceptível à ação de fármacos. Várias classes de inibidores peptídicos reversíveis e irreversíveis, baseados no estado de transição, inibem efetivamente a cruzaína. No entanto, a maioria destes inibidores ainda não apresenta perfis farmacodinâmicos/farmacocinéticos adequados e/ou estão relacionados com potenciais efeitos fora do alvo (do inglês, off-target). Com o objetivo de encontrar inibidores mais eficientes e seletivos, foi aplicado uma abordagem de planejamento de ligantes baseada em hipótese, combinando quiminformática, síntese orgânica, ensaios bioquímicos e determinação do modo de interação para validar os compostos planejados como inibidores de cruzaína. Neste trabalho, é mostrado um conjunto de dipeptidil-nitrilas que foram sintetizadas e avaliadas com base nestes métodos para investigar as interações nos subsítios S1, S2 e S3 de cruzaína. Nossos resultados demonstram o sucesso da abordagem aplicada que resultou na identificação de vários inibidores da cruzaína em concentrações que chegam a sub-micromolar. Alguns dos compostos dessa classe de dipeptidil-nitrilas também são agentes tripanossomicidas por apresentar concentrações efetivas com formas infectivas do T. cruzi em baixo micromolar. / Cruzain is the major cysteine protease found in the parasite Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The enzyme is essential for the development and survival of the parasite within host cells, having excellent pre-clinical validation evidence as a druggable target. Several classes of peptide inhibitors including transition state-based reversible and irreversible ones effectively inhibit cruzain. However, most of these inhibitors still have poor PK/PD profiles and are related with potential off target effects. In order to find more efficient and selective inhibitors, we have applied the hypothesis driven ligand design approach, combining cheminformatics, organic synthesis, biochemical assays and mode of binding determination to validate the designed compounds as cruzain inhibitors. Here, we show a set of dipeptidyl nitriles that were synthetized and evaluated based on these methods to probe interactions at S1, S2 and S3 pockets of cruzain binding site. Our results unveil the success of the applied approach that yielded in the identification of several cruzain inhibitors at sub-micromolar concentrations. Some of the compounds of this class of dipeptidyl nitriles are also trypanocidal agents with effective concentrations in the low micromolar range against infective forms of T. cruzi.

A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de morte por infecção no mundo, sendo que, em 2015, registraram-se 10,4 milhões de novos casos. O agente etiológico da doença, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), apresenta altos níveis de resistência frente aos quimioterápicos disponíveis para o tratamento da TB. Além disso, a terapia atual da doença explora poucos alvos essenciais ao Mtb. Neste sentido, explorar novos alvos, essenciais ao crescimento e sobrevivência da micobactéria é de grande interesse e poderia gerar fármacos mais efetivos, eficazes contra cepas resistentes e a forma latente da TB. Para este fim, o presente trabalho propôs o desenvolvimento de inibidores da enzima fosfopanteteína adenililtransferase (PPAT), a qual possui caráter regulatório na via de biossíntese da Coenzima A (CoA) da micobactéria. Inicialmente, propuseram-se 50 estruturas de potenciais inibidores da PPAT de M. tuberculosis (MtPPAT), baseando-se na estrutura de seu substrato, a fosfopanteteína, e na estrutura do sítio ativo da enzima. Em seguida, propuseram-se outros 28 ligantes. A fim de se prever as potenciais complementaridades entre os 78 inibidores propostos e o sítio ativo da MtPPAT, empregou-se a estratégia de docking. Posteriormente, realizaram-se cálculos semi-empíricos, com os complexos dos ligantes que se mostraram mais interessantes nas simulações de docking, a fim de se obter informações sobre a entalpia de interação dos ligantes com o sítio ativo da MtPPAT. A partir dos resultados obtidos nos estudos computacionais, selecionaram-se os inibidores que se mostraram mais promissores. A síntese destes ligantes e a de seus fragmentos foi realizada. Avaliaram-se a atividade microbiológica in vitro, bem como a citotoxicidade dos ligantes sintetizados. Alguns dos compostos sintetizados apresentaram atividade frente às cepas sensíveis e resistentes do Mtb na casa de micromolar. Todos os compostos ativos não foram considerados citotóxicos. A fim de validar o planejamento e o alvo dos possíveis inibidores, verificando a atividade inibitória desses frente à enzima MtPPAT, realizou-se a produção e purificação da enzima. Por fim, realizaram-se ensaios de inibição enzimática frente à MtPPAT, os quais permitiram a identificação dos primeiros inibidores da enzima já descritos, com atividade na casa de micromolar, validando-se o alvo em questão. / Tuberculosis is one of the major causes of death by infection worldwide. In 2015, 10.4 thousand new cases of the disease were registered. The tuberculosis\' causing agent Mycobacterium tuberculosis presents high levels of resistance for the available chemotherapy. Thereof, exploit new M. tuberculosis targets is of utmost importance to overcome drug resistant tuberculosis. In this sense, the enzyme phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT) generates scientific interest since it displays a regulatory role in the M. tuberculosis coenzyme A (CoA) biosynthesis. Therefore, the purpose of the present study was the development of M. tuberculosis PPAT (MtPPAT) inhibitors. Initially, 50 potentially MtPPAT inhibitors were designed based on MtPPAT\'s substrate and the enzyme\'s active site. After preliminary results, more 28 compounds were designed. Docking simulations were performed with the 78 compounds synthesized, leading to the prediction of the interaction between the proposed inhibitors and MtPPAT active site. Latelly, semi-empirical calculations were performed with the most promising compounds. These calculations were carried out to obtain information about the enthalpy interactions between compounds and MtPPAT active site. Computational studies led to the selection of the most promising inhibitors. Those compounds and some of their fragments were synthesized, purified, and characterized. The synthesized compounds had their in vitro microbiological activity and cytotoxicity evaluated. Some of the synthesized compounds showed activity against the Mtb sensitive and resistant strains in micromolar range. Besides that, the active compounds were not considered cytotoxic. To validate the potential inhibitors\' design and evaluate their capacity to inhibit MtPPAT, the enzyme was produced and purified. MtPPAT inhibitory assays were performed, leading to the first inhibitors of the enzyme, with activity in micromolar range, validating the target.

A longevidade da interação estabelecida entre a união do material restaurador e substrato tem sido o foco principal da Odontologia Adesiva. Se por um lado, a dentina é alterada por desafios como a erosão e a cárie dentária, por outro lado, tecnologias que atendam às condições distintas do substrato e que possibilitem união química tem sido desenvolvidas. O objetivo desde trabalho foi avaliar o desempenho de um sistema adesivo restaurador universal (modo convencional) na resistência de união (RU) à dentina em diferentes condições (artificialmente erodida ou cariada) e pré-tratadas com inibidores proteolíticos. Noventa molares hígidos foram selecionados e preparados, obtendo-se superfícies planas que foram tratadas com lixa 600 por 1 minuto. Os espécimes foram aleatoriamente divididos em três grupos iniciais, de acordo com o substrato: N- sem simulação de desafio ácido (mantidos em saliva artificial); ERO- simulação de erosão (3x5min/5dias com suco de laranja) e CA- simulação de cárie artificial (6h desmineralizante+ 18hremineralizante/ 5 dias + 48 remineralizante). Em seguida, cada um desses grupos foi redividido em três subgrupos, de acordo com o pré-tratamento da dentina: Atratado com água; CHX- tratado com clorexidina a 2%e E-64- tratado com o inibidor E-64 a 5 &#x3BC;M. No total, formaram-se, 9 grupos (n=10): N-A, N-CHX, N-E-64, ERO-A, ERO-CHX, ERO-E-64, CA-A, CA-CHX, CA-E-64. Todos os espécimes foram restaurados com adesivo Adper Single Bond Universal® e com resina composta Filtek Z250. Os dentes foram cortados para a obtenção dos palitos (área de 0,64mm2 aproximadamente), que foram submetidos ao ensaio de microtração em máquina de teste a 0,5mm/min em 7 dias e 6 meses. O modo de fratura foi classificado de acordo com a análise das interfaces com microscopia ótica 40X. Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade e analisados por ANOVA a três critérios e teste de Tukey (p<0,05). Os resultados demonstraram que houve interação entre o substrato x tratamento (p=0,0011) e substrato x tempo (p=0,0003). A dentina alterada por erosão e cárie artificialmente contribuíram negativamente na RU do sistema adesivo. O uso de clorexidina afetou negativamente a RU em todas as condições testadas. O E-64 mostrou-se efetiva em manter a estabilidade da união aos 6 meses para os substratos alterados. O sistema adesivo universal apresenta-se promissor para ser utilizado na dentina alterada, mantendo a resistência de união ao longo do tempo. O uso de E-64 não comprometeu a união à dentina, ao contrário do impacto no uso da solução de clorexidina. / The longevity of the interaction established between restorative material and substrate has been the main focus of Adhesive Dentistry. Dentin is altered through challenges as dental erosion and caries and, on the other hand, technologies that attend for particular conditions of the substrate and favors for the chemical bonding has been developed. The aim of this study was to evaluate the performance of a universal adhesive system (etch-and-rinse mode) on bonding strength (BS) to dentin in different conditions (artificial caries or erosion) and pretreated with proteolytic inhibitors. Ninety molars were selected and prepared, obtaining flat surfaces treated with 600 sandspaper for 1 minute. The specimens were randomly divided into three groups according to the substrate: N- with no challenges (stored in artificial saliva), ERO-artificial erosion simulation (3x5min/5days with orange juice) and CA- artificial caries simulation (6h demineralizing+ 18h-remineralizing/ 5 days + 48 remineralizing). Then, each of these groups was redivided into three subgroups according to the pretreatment of dentin: A- treated with water; CHX-treated with 2% chlorhexidine and E-64- treated with 5 &#x3BC;M E-64 inhibitor. Therefore, they constituted 9 groups (n = 10): N-A, N-CHX, N-E-64, ERO-A, ERO-CHX, ERO-E-64, CA-A, CACHX, CA-E-64. All specimens were restored with Adper Single Bond ® Universal and composite resin Filtek Z250. The teeth were cut to obtain sticks (area of approximately 0.64 mm2), which were subjected to the microtensile bond test in the testing machine at 0.5 mm/min after 7 days and 6 months. The failure mode was classified according to the analysis of interfaces by optical microscopy 40X. Data was tested to verify normal distribution and homogeneity to be analyzed with three-way ANOVA and Tukey tests (p <0.05). Data revealed interaction between substrate x treatment (p=0.0011) and between substrate x time (p=0.0003). Dentin affected by artificial erosion and caries negatively contributed to the BS. The use of chlorhexidine negatively affected the RU for all tested conditions. E-64 showed to be effective to maintain the bonding stability to affected dentin for 6 months. The universal bonding system seems to be promissory to be employed to affected dentin, maintaining the BS overtime. The use of E-64 did not affect the bonding to dentin, controversial to the use of chlorhexidine.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência & Tecnologia - Química, 2014. / Serpina é o nome dado a uma superfamília de proteínas com grande diversidade de funções biológicas, e que tem como principal característica a inibição de serino proteases. Até meados do ano de 2002, acreditava-se que as serpinas eram exclusivas de organismos eucarióticos. No entanto, com o desenvolvimento das técnicas de sequenciamento de genomas, essas proteínas passaram a ser identificadas também em organismos procariotos. Assim com o objetivo de avaliar a capacidade de duas serpinas bacterianas (G. violaceus e M. xanthus) em inibir serino proteases foi realizado nesse trabalho a clonagem, expressão e caracterização bioquímica da atividade inibitória de duas serpinas bacterianas descritas no banco de dados de genoma "genbank". As serpinas que foram alvo de nosso estudo possuem diferentes sequências de aminoácidos na sua RCL (alça do centro reativo), visando produzir serpinas com diferentes especificidades para serino proteases. Os genes codificadores das duas serpinas foram clonados em vetor de expressão pET-28a(+). As serpinas S1 (Gloeobacter violaceus) e S2 (Myxococcus xanthus) foram expressas na cepa bacteriana E. coli Bl21 (D3), purificadas pela técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel Ni-NTA e obtidas na forma solúvel. Foram realizados ensaios para determinar a atividade inibitória das serpinas S1 (G. violaceus) e S2 (M. xanthus) contra as enzimas tripsina, quimotripsina, elastase, subtilisina, NS3 (dengue) e ainda da serpina S1 frente as calicreínas teciduais humanas 1, 3 e 5. A eficiência da reação de inibição da serpina S1 contra essas enzimas também foi testada na presença de glicosaminoglicanos (GAG¿s): heparina, sulfato de dermatan e sulfato de condroitina. A serpina S1 (G. violaceus) apresentou atividade inibitória frente à tripsina na ausência e também na presença dos GAG¿s heparina, sulfato de dermatan e sulfato de condroitina, sendo que na presença de heparina foi possível observar o menor valor de constante de velocidade de segunda ordem (k¿) em relação aos demais GAG¿s testados, sugerindo que a heparina atua de alguma forma na diminuição da velocidade na reação de inibição da tripsina pela serpina S1. Foi possível visualizar a formação do complexo covalente entre a serpina S1 (G. violaceus) e a tripsina por análise em SDS-PAGE 10%. Também analisamos a ação inibitória de compostos sintéticos derivados do isomanídeo frente às calicreínas teciduais humanas 1, 3, 5, 6 e 7. Nesse estudo foi possível obter inibidores seletivos para as calicreínas humanas teciduais 5 e 7, a partir dos compostos sintéticos derivados do isomanídeo e através dos estudos de docking, juntamente com a análise das estruturas das KLK5 e KLK7, foram fornecidas informações sobre as diferenças observadas entre as afinidades de ligação dos diferentes compostos derivados do isomanídeo refletidos nos resultados dos testes de inibição. / Serpin is the name given to the superfamily of proteins with wide range of biological functions, and that has as main feature the inhibition of serine proteases. Until mid-year 2002 it was believed that the serpins were unique to eukaryotic organisms. However, with the development of genome sequencing techniques, these proteins are now also been identified in prokaryotic organisms. Thus, with the objective of evaluate the ability of two bacterial serpins (G. violaceus and M. xanthus) to inhibit serine proteases was performed in this work the cloning, expression and biochemical characterization of the inhibitory activity of two bacterial serpins described in the database of genome "genbank". Serpins that have been the target of our study have different sequences of amino acids in RCL (the reactive center loop), to produce serpins with different specificities for serine proteases. The genes encoding the two serpins were cloned into the expression vector pET-28a (+). S1 (Gloeobacter violaceus) and S2 (Myxococcus xanthus) serpins were expressed in the bacterial strain E. coli BL21 (D3), purified by the technique of affinity chromatography on nickel Ni-NTA resin and obtained in soluble form. Assays were performed to determine the inhibitory activity of serpins S1 (G. violaceus) and S2 (M. xanthus) against the enzymes trypsin, chymotrypsin, elastase, subtilisin, NS3 (dengue) and also the serpin S1 against human tissue kallikrein 1, 3 and 5. The efficiency of the inhibition reaction against these enzymes serpin S1 was also tested in the presence of glycosaminoglycans (GAG's) heparin, dermatan sulfate and chondroitin sulfate. S1 serpin (G. violaceus) had inhibitory activity against trypsin in the absence and presence of GAGs heparin, dermatan sulfate and chondroitin sulfate, and in the presence of heparin was observed the lowest value of the rate constant of the second order (k') compared to the other GAG's tested, suggesting that heparin acts in some way in reducing the speed in inhibiting reaction of trypsin by serpin S1. It was possible to visualize the formation of a covalent complex between S1 (G. violaceus) serpin and trypsin by SDS-PAGE 10% analysis. We also analyzed the inhibitory activity of synthetic compounds derived from isomannide against human tissue kallikrein 1, 3, 5, 6 and 7. In this study it was possible to obtain specific inhibitors for human tissue kallikrein 5 and 7 from synthetic compound derived from the isomannide and through docking studies, together with the analysis of the structures of KLK5 and KLK7, were provided information about the differences between the various binding affinities of compounds derived from isomannide and reflected in the results of the inhibition tests.

Orientador: Lima Giuseppina Pace Pereira Lima / Coorientador: Denise Laschi / Banca: Glaucia Moraes Dias / Banca: Armando dos Reis Tavares / Resumo: Devido à expansão da floricultura brasileira nas últimas duas décadas, a crescente demanda deste setor por produtos de alta qualidade e durabilidade e à carência de estudos relacionados à fisiologia pós-colheita de flores, esse trabalho teve como objetivo estudar a durabilidade pós-colheita de hastes de lisianthus (Eustoma grandiflorum) submetidas ao tratamento com inibidores de etileno (1-Metilciclopropeno -1-MCP e Ácido Salicílico - SA) e diferentes temperaturas de armazenamentos (ambiente a 24 ± 2°C e pré-exposição à câmara fria a 9 ± 2°C por 24 horas). A longevidade foi acompanhada a partir de análises não destrutivas (escala de notas, perda de massa fresca e teor de água absorvido pela haste) e destrutivas (teor de carboidratos solúveis totais, fenóis e proteínas solúveis, e atividade das enzimas peroxidase - POD e polifenoloxidase - PPO). A aplicação de 1000 mg L-1 de ácido salicílico mostrou-se ineficiente, pois as hastes apresentaram sintomas de fitotoxidade, elevada taxa de inclinação do pedúnculo e amarelecimento de pétalas, e redução na turgescência e longevidade das hastes tanto em temperatura ambiente quanto na pré-exposição a câmara fria, além de propiciarem o surgimento de patógenos. A associação entre 1-MCP e câmara fria foi um bom tratamento para aumentar a durabilidade das hastes, que apresentaram melhores características de inclinação do pedúnculo e turgescência. Os teores de carboidratos presente nas hastes sofreram redução durante todo o período experimental independente dos tratamentos pós-colheita e da temperatura de armazenamento, assim como a absorção de água pelas mesmas. Durante o período de avaliações, a atividade enzimática aumentou com a senescência do material, relação direta com a concentração de fenóis que se acumulam nos tecido lesionados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Due to the expansion of the Brazilian floriculture in the last two decades, the growing demand in this sector for high quality products and durability and the lack of studies on postharvest physiology of flowers, this work aimed to study the postharvest longevity stems of lisianthus (Eustoma grandiflorum) subjected to treatment with inhibitors of ethylene (1-methylcyclopropene 1-MCP and Salicylic Acid - SA) and different storage temperatures (ambient to 24 ± 2° C and pre-exposure chamber at 9 ± 2° C for 24 hours). Longevity was accompanied from non-destructive analysis (grading scale, weight loss and water content absorbed by the stem) and destructive (total soluble carbohydrates, phenols and soluble proteins, and activity of peroxidase - POD and polyphenoloxidase - PPO). The application of 1000 mg L-1 of salicylic acid proved to be inefficient, because the rods showed symptoms of phytotoxicity high rate of bent neck and yellowing of petals, and reduction in swelling and longevity of the rods both in room temperature and in pre-exposure to cold chamber, in addition to propitiate the appearance of pathogens. The association between 1-MCP and cold chamber was a good treatment to increase the durability of... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre