Les protéines impliquées dans les voies de signalisation sont souvent activées et inactivées par des interactions de faible affinité. En particulier, les domaines protéiques liant spécifiquement de courts fragments protéiques permettent une régulation intra- et inter-moléculaire efficace des domaines catalytiques auxquels ils sont associés. Citons par exemple les domaines FHA ou des tandems BRCT fréquemment impliqués dans les réponses aux dommages de l'ADN. Etant donnée leur importance dans les réseaux d'interactions et dans la signalisation cellulaire, la prédiction par bioinformatique des propriétés de liaison de ces petits domaines constitue un enjeu majeur. Toutefois, les stratégies bioinformatiques sont jusqu'à présent limitées par des difficultés méthodologiques associées aux caractéristiques intrinsèques de ces domaines. Leurs séquences sont souvent très divergentes et les affinités pour leurs cibles physiologiques sont généralement faibles malgré une excellente spécificité. Le travail présenté dans cette thèse a donc pour objectif de dépasser les limites actuelles des outils de prédictions pour développer de nouvelles méthodologies bioinformatiques performantes. Trois points ont été plus particulièrement abordés : (i) la prédiction de la structure tridimensionnelle de ces domaines ; (ii) la prédiction des sites reconnus par ces domaines lorsque les partenaires sont connus ; (iii) la prédiction des motifs spécifiquement reconnus par ces domaines sur la base de leur structure tridimensionnelle.

Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d'ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d'acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l'aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d'association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d'un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d'entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d'intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d'une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales.

Longtemps considéré comme un composé toxique, le sélénium est maintenant<br />largement reconnu comme oligo-élément essentiel. Des carences alimentaires ont été<br />associées à de nombreuses pathologies.<br />La sélénocystéine est la forme biologique principale du sélénium. Cet acide aminé particulier<br />est spécifiquement incorporé dans les sélénoprotéines grâce à une machinerie traductionnelle<br />dédiée en réponse à un codon UGA, traditionnellement reconnu comme un codon stop.<br />A ce jour, la fonction moléculaire de la plupart des sélénoprotéines demeure inconnue. Parmi<br />celles-ci figure la sélénoprotéine N (SePN), une nouvelle protéine à sélénium identifiée en<br />1999 dans notre laboratoire par une approche bioinformatique.<br />En 2001, il a été démontré que des mutations dans le gène SEPN1 codant pour SePN étaient<br />responsables de différentes pathologies musculaires regroupées dorénavant sous le terme de<br />myopathies apparentées à la sélénoprotéine N.<br />Au début de ma thèse, peu de choses étaient connues sur la fonction de SePN. Pour<br />comprendre son rôle, nous avons entrepris son étude selon différentes approches.<br />Dans un premier temps, j'ai contribué à montrer que SePN est une glycoprotéine de 65kDa,<br />associée aux membranes du réticulum endoplasmique. Ensuite, des approches biochimiques<br />successives ont permis de mettre en évidence son interaction avec différentes protéines de la<br />membrane, et dont l'identification est en cours.<br />Dans un deuxième temps, nous avons mis au point deux modèles animaux des pathologies<br />musculaires associées à un dysfonctionnement de SePN. Par une approche antisens, il a été<br />observé que l'inhibition de l'expression de SePN au cours du développement embryonnaire<br />chez le poisson zèbre entraînait une altération de l'organisation du tissu musculaire.<br />Parallèlement, tirant avantage du système Cre-Lox, nous avons obtenu des souris invalidées<br />pour SEPN1 dans tout l'organisme ou de façon tissu spécifique dans le muscle. De façon<br />surprenante, les animaux ainsi obtenus ne présentent pas de phénotype apparent, même si les<br />analyses histologiques préliminaires permettent d'observer un profil dystrophique classique<br />des fibres musculaires. En outre, les animaux semblent présenter une sensibilité accrue au<br />stress oxydatif induit. L'exploration fonctionnelle de ce modèle est poursuivie au laboratoire<br />et fait l'objet de plusieurs collaborations.<br />Enfin, une autre étude entreprise au cours de ma thèse concerne une mutation pathologique du<br />gène SEPN1 conduisant à l'apparition de myopathies chez l'homme. Par une approche<br />originale déduite du mécanisme atypique de traduction des sélénoprotéines, une stratégie qui<br />pourrait aboutir à terme à une thérapie génique pour certains patients a été mise au point.<br />L'ensemble de ces travaux va permettre d'augmenter nos connaissances sur le rôle de<br />la sélénoprotéine N dans le muscle ainsi que sur la fonction biologique de l'oligo-élément<br />sélénium dans ce tissu. Le but ultime de l'ensemble de ces travaux est de développer des<br />outils de diagnostic ainsi que des approches thérapeutiques ciblées.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les hélicases à ARN de la famille DEAH/RHA sont impliquées dans la plupart des processus essentiels à la vie tels que l'épissage, la biogenèse des ribosomes, la réplication, la transcription ou encore la détection d’ARN viraux. Ces enzymes sont capables de catalyser la dissociation de duplexes d'ARN, la réorganisation de structures secondaires ou de remodeler des complexes ARN-protéines. L'hélicase DEAH/RHA Prp43 présente la particularité d'être bifonctionnelle. Prp43 est impliquée dans l'épissage des Pré-ARNm, où elle assure le recyclage du spliceosome et du lasso, mais aussi dans la biogenèse des ribosomes où elle est impliquée dans la maturation des deux sous-unités. Prp43 est activée et régulée par cinq partenaires protéiques : Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 et GPATCH2. Ces partenaires protéiques présentent tous un domaine G-patch et sont capables de stimuler les activités hélicase et ATPase de Prp43. La structure cristallographique de Prp43 en complexe avec l'ADP a été résolue au laboratoire. Cette structure a mis en évidence un mode de fixation du nucléotide inédit chez les autres hélicases, notamment au niveau de la base qui s'empile entre la phénylalanine 357 (F357) du domaine RecA2 et l'arginine 159 (R159) du domaine RecA1. Les déterminants de l'activation de Prp43 par les protéines à domaine G-patch demeurent méconnus. Dans ce travail, nous avons cherché à déterminer quel était le rôle de l’empilement de la base dans l’activation de Prp43. Nous présentons ici plusieurs structures cristallographiques de Prp43 en complexe avec tous les nucléotides diphosphates(NDP) et les désoxynucléotides triphosphates (dNDP). Ces structures ont permis de conclure qu'il y avait des différences dans l’empilement de la base selon le (d)NDP considéré. Des dosages d'activité NTPase de Prp43 avec et sans son partenaire protéique Pfa1 montrent que lorsque la base ne s'empile pas avec la F357 et la R159, l'activité de l'enzyme n'est pas correctement régulée par son partenaire protéique. Les dosages d’activité enzymatique sur les mutants ponctuels F357A et R159A révèlent que le résidu F357 permet de moduler l’activité de Prp43. Tous ces résultats nous ont permis de mettre en évidence un modèle de la régulation de Prp43 par les protéines à domaines G-patch et d'expliquer l'importance du mode de fixation de la base à l'enzyme dans cette régulation. / RNA helicases from the DEAH/RHA family are involved in most of essential processes of life such as pre-mRNA splicing, ribosome biogenesis, replication, transcription or viral RNA sensing. These enzymes are able to catalyze RNA unwinding, secondary structures reorganization or RNA-protein complexes remodeling. The DEAH/RHA helicase Prp43 is remarkable because it is bifunctional, as it is involved both in pre-mRNA splicing, where it is responsible of spliceosome and lariat recycling and in the biogenesis of the two ribosomal subunits. Prp43 is activated by five protein partners: Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 and GPATCH2. These protein partners all possess a G-patch domain and are able to stimulate helicase and ATPase activity of Prp43. The structure of Prp43 in complex with ADP has been solved by X-ray crystallography. The structure reveals that the nucleotide is bound to the enzyme in a novel mode that has never been observed in other known helicase structures. The specific feature of this binding mode is the base, stacked between phenylalanine (F357) from RecA2 domain and an arginine (R159) from RecA1 domain. Features of the activation of Prp43 by G-patch proteins are unclear. In this work, we investigated the role of base stacking in the activation of Prp43. We present several structures of Prp43 bound to all the nucleotide diphosphates (NDP) and deoxynucleotide diphosphates (dNTP). These results indicate that there are differences in stacking according to the (d)NDP bound to the enzyme. NTPase activity assays revealed that when stacking is weakened, Prp43 activity cannot be properly regulated by its protein partner Pfa1. Moreover, point mutations F357A and R159A show that stacking of F357 permits to modulate Prp43 activity. All these results allow us to propose a model of NTPase activity activation of Prp43 by G-patch proteins and to highlight the importance of base stacking in this regulation.

Spiroplasma citri est un mollicute phytopathogène transmis de plante à plante par des cicadelles du genre Circulifer selon un mode persistant circulant-multipliant. Les franchissements de l’épithélium intestinal et des glandes salivaires sont basés sur un mécanisme d’endocytose/exocytose. Ce processus d’invasion met en jeu, au sein de complexes protéiques, des protéines bactériennes spécifiques qui reconnaissent des motifs déterminés présents à la surface des cellules eucaryotes. La recherche de protéines de l’insecte vecteur interagissant avec S. citri a notamment conduit à l’identification de l’actine. Cette interaction a pu être confirmée à la fois in vitro et in vivo. L’interaction de l’actine avec son partenaire chez S. citri, qui s’est avéré être la phosphoglycérate kinase (PGK), est impliquée dans l’internalisation du spiroplasme dans les cellules de l’insecte. La région minimale de liaison à l’actine de la PGK a également été déterminée.La réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de PGK a été entreprise avec le plasmide navette pGOT mais n’a pas permis la sélection de spiroplasmes mutés dans ce gène essentiel. Néanmoins, la recherche de l’évènement de recombinaison chez les clones obtenus a permis de mettre en évidence la mutation de deux gènes chez ces derniers.L'ensemble des protéines impliquées dans la transmission du spiroplasme, identifiées au préalable chez ce dernier, n’étant pas essentielle au cours de ce processus, une étude préliminaire des complexes multi-protéiques contenant plusieurs de ces protéines a été réalisée. L’identification de complexes impliquant à la fois la PGK, la P32 et les ScARPs pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes régissant la vection de S. citri par son insecte. / Spiroplasma citri is a phytopathogenic mollicute transmitted from plant to plant by leafhoppers of the genus Circulifer in a persistent and propagative manner on condition to cross the intestinal and salivary glands barriers of the insect. These crossings are based on a endocytosis/exocytosis mechanism which involves bacterial protein complexes in order to recognize specific patterns on the surface of eukaryotic cells.Specific molecular interactions between S. citri proteins and those of C. haematoceps were investigated using far Western technology and had notably led to the identification of actin. This interaction has been confirmed both in vitro and in vivo. The interaction of actin with his partner in S. citri, which has been identified as the phosphoglycerate kinase (PGK), is involved in the internalization of spiroplasma into the insect cells. The minimal actin-binding region of PGK was also determined.The realization of a S. citri PGK mutant was carried out using the shuttle plasmid pGOT but the selection of spiroplasmas mutated in this essential gene failed. Nevertheless, findings in the localization of recombination events in S. citri chromosome, allowed us to identify mutations in two genes that could be tested in our experimental transmission system.The set of proteins involved in the spiroplasmal transmission, previously identified as non essential proteins in the invasion process, prompted us to study the role of multi-protein complexes containing several of these proteins. Identification of complexes involving both the PGK, the P32 and ScARPs should enable us to better understand mechanisms governing the transmission of S. citri by its insect.

Les récepteurs nucléaires sont membres d'une famille de protéines activées par des ligands et qui régulent la transcription de nombreux gènes. Le récepteur nucléaire RevErbα est constitutivement inhibiteur de la transcription de gènes cibles via le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor et Histone DeAcetylase 3). Ce complexe joue un rôle important dans le contrôle de l'horloge circadienne et de la glucogenèse via la régulation de la transcription des gènes codant pour les enzymes G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) et PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase). Ces deux enzymes sont impliquées dans la glucogénèse qui est dérégulée en cas de diabète de type 2. Ce travail est basé sur l'investigation de l'interaction du récepteur nucléaire RevErbα avec deux corépresseurs: son partenaire établit NCor et SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Malgré ce qui est rapporté dans la littérature, c'est à dire que SMRT et RevErbα n'interagissent pas fonctionnellement in vivo, nous avons choisis d'étudier cette interaction à cause de la similarité de séquence entre les deux corépresseurs, mais également parce que les peptides des deux corépresseurs ont été rapportés comme interagissant avec d'autre récepteurs nucléaire. Afin d'étudier ces interactions, nous avons utilisé deux techniques complémentaires basées sur l'émission de fluorescence: Une technique in vitro qui est l'anisotropie de fluorescence et une technique de microscopie de fluorescence in cellulo appelée Number & Brightness. En plus de cette étude de l'interaction entre le récepteur nucléaire et les corépresseurs, nous nous sommes intéressé à déterminer l'effet de plusieurs ligands sur cette interaction. Trois ligands ont été testés: l'hème qui est rapporté comme étant le ligand naturel de RevErbα et deux ligands synthétiques et non naturels de RevErbα (SGN et SD7). Grâce à l'anisotropie de fluorescence (in vitro), nous avons confirmé et quantifié l'interaction entre le domaine de liaison au ligand (LBD) de RevErbα et un peptide NCor contenant le domaine d'interaction majeur (ID1 pour RevErbα et nous avons déterminé l'effet des trois ligands sur cette interaction. Nous avons également quantifié l'interaction entre RevErbα et d'autres peptides provenant de NCor et correspondant aux autres domaines d'interaction (ID2 et ID3) pour sa liaison à RevErbα. Nous avons déterminé que l'hème et le SD7 ont un effet déstabilisateur de la liaison de RevErbα à NCor in vitro, alors que le ligand SGN améliore la stabilité de complexe. Nous avons également confirmé une interaction entre RevErbα et un peptide corépresseur issu de SMRT. Afin d'étudier l'interactions des protéines pleine taille dans un contexte plus fonctionnel, nous avons utilisé le 2 photons-2 couleurs Number & Brightness. C'est une technique de microscopie à fluorescence basée sur la fluctuation de l'intensité de fluorescence pour étudier les interactions spécifiques de RevErbα avec NCor et SMRT pleine taille in cellulo ainsi que l'effet des ligands, précédemment mentionné, sur ces interactions. Dans les conditions choisies pour notre étude, nous avons déterminé que RevErbα interagit fortement avec NCor in cellulo et que cette interaction est améliorée par le ligand SGN. En revanche, l'hème et le SD7 n'ont pas d'effet observable sur ce complexe. Nous avons également montré pour la première fois que RevErbα forme des complexes avec le corépresseur SMRT pleine taille in cellulo. La continuité de ce travail pourrait être ciblée sur l'identification de ligands qui augmenterait le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 sur RevErbα, menant ainsi à la diminution de l'expression des gènes cibles. En définitive, un ligand tel que celui-ci pourrait être d'un grand intérêt dans la recherche de la diminution de glucose dans le sang dans les cas de diabètes de type 2. / Nuclear receptors are members of ligand-inducible factors that regulate the transcription of many genes. Nuclear receptor RevErbα constitutively inhibits the transcription of target genes via the recruitment of the corepressor complex NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor and Histone DeAcetylase 3). This complex plays an important role in controlling the circadian clock and glucogenesis via regulation of the transcription of the G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) and PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase) genes, both coding for proteins involved in glucogenesis, which is central to type 2 diabetes. Here we have investigated the interaction of the nuclear receptor RevErbα with two corepressors: its establish partner, NCor and SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Despite literature reports that SMRT and RevErbα do not interact functionally in vivo, we choose to study this interaction because of sequence similarity between the two corepressors, because peptides of both corepressors were reported to interact with other nuclear receptors. To investigate these interactions, we used two complementary fluorescence techniques: In vitro assays based on fluorescence anisotropy and an in cellulo fluorescence microscopy technique called Number & Brightness. In addition to the interactions between the CoRs and the RN, we were interested in determining the effects of several ligands on these interaction. Three ligands were tested: heme, which is reported to be the natural ligand of RevErbα and two synthetic and non-naturals ligands of RevErbα (SGN and SD7). By fluorescence anisotropy (in vitro) we confirmed and quantitated the interaction between purified RevErbα Ligand Binding Domain (LBD) and an NCoR peptide containing the major interaction domains (ID1) for RevErbα and revealed the effect of the three ligands on this interaction. We quantitated as well, the interaction between RevErbα and other peptides from NCor corresponding to the other interaction domains (ID2 and ID3) for it binding to RevErbα. We found a destabilizing effect of heme and SD7 binding to RevErbα on it interaction with NCor in vitro, whereas the ligand SGN enhanced the complex stability. We also confirmed an interaction between RevErbα and a SMRT peptide corepressor in vitro. In order to examine these interactions in a more functionally relevant context using full length proteins, we used 2 photon 2 colors Cross Number and Brightness (N&B), an fluorescence microscopy technique based on fluorescence intensity fluctuations to study specific interactions of full length RevErbα with NCor and SMRT in cellulo as well as the effect of several ligands above mentioned. Under the conditions of our studies, we find that RevErbα and NCor interact strongly in cellulo, and we observed a slight enhancement of this interaction by the SGN ligand. No effect of heme or SD7 was observed on the complex. We show as well for the first time that RevErbα forms complexes with the full length SMRT corepressor in cellulo. Future extensions of these studies could be aimed at identifying ligands that enhance the recruitment of the corepressor complex NCor/HDAC3 by RevErbα, thus leading to a decrease expression of the target genes. Ultimately such a ligand could be of interest in the quest to decrease blood glucose levels in type 2 diabetes.

Le paludisme et le sepsis sont des maladies infectieuses très répandues causant plusieurs centaines de milliers de morts tous les ans. Elles sont toutes deux multifactorielles. Les devenirs de ces infections sont influencés par des facteurs environnementaux, par des facteurs sociaux-économiques, politiques et comportementaux mais aussi par des variables dépendant du patient comme son âge. De nombreux arguments existent en faveur d'un contrôle génétique de la résistance au paludisme et au sepsis. Ces deux maladies sont considérées comme proches par les spécialistes car leur physiopathologie est liée notamment à une inflammation systémique non contrôlée responsable des formes les plus graves. Afin d'identifier de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la résistance à ces deux maladies, nous avons effectué des études génétiques pangénomiques dans deux populations vivant en zone endémique pour le paludisme à Plasmodium falciparum au Burkina-Faso et dans une cohorte de patients atteints de sepsis.Enfin nous avons réalisé les deux premières études d'association pangénomiques identifiant des associations significatives avec la mortalité suite à un choc septique. Nous avons obtenu 32 SNPs significativement associés à la mortalité précoce et 108 significativement associés à la mortalité tardive. Le réseau des interactions protéine-protéine impliquant les protéines codées par les gènes associés a permis d'établir une liste non exhaustive des fonctions altérées durant le choc septique, notamment liées à la réponse immune, et a révélé, malgré les différences au niveau des gènes impliqués, un mécanisme commun participant à la susceptibilité précoce et tardive au choc septique. / Malaria and sepsis are widespread infectious diseases causing hundreds of thousands deaths each year. There is a growing body of evidence for a genetic control of malaria and sepsis resistance. Both diseases are considered close because they are characterized by a systemic inflammation, some common organ dysfunctions, and disorders of coagulation. In order to identify new genes potentially involved in disease resistance, we performed genomewide genetic studies in two populations living in endemic regions for Plasmodium falciparum malaria in Burkina-Faso and in a cohort of septic shock patients. Genetic linkage studies revealed significant genetic linkages on chromosome 6p21.3 and 17p12 with, respectively, mild malaria and asymptomatic parasitaemia. We also performed the first genetic linkage studies concerning immunoglobulin G and their sub-classes against Plasmodium falciparum antigens. We detected significant linkages of IgG3 sub-class with chromosomes 8p22-p21 and 20q13 and between IgG4 sub-class and chromosome 9q34. Finally we performed the first two genomewide association studies identifying significant associations with all-causes mortality after a septic shock. We identified 32 SNPs significantly associated with early mortality and 108 SNPs significantly associated with late mortality. We identified a protein-protein network containing proteins associated with both early and late mortality. Furthermore, the network of protein-protein interactions involving proteins encoded by associated genes allowed us to establish a list of some altered functions during septic shock, most of them being related to the immune responses or the renin-angiotensin-aldosterone system.

Il existe de nombreux mécanismes impliqués dans le développement des tissus qui nécessitent que des cellules ou des groupes de cellules s’orientent et se polarisent. Les protéines de la voie de la polarité planaire (PP) s’associent pour former des complexes à la membrane et créer des asymétries proximo-distale. Vangl2 et Scrib1 ont été identifiés comme les deux premiers gènes impliqués dans la PP chez les mammifères. Lors de ma thèse, je me suis intéressé à ces deux protéines et à certains des complexes dans lesquelles elles sont impliquées. Dans un premier temps, nous avons montré l’implication directe de Scribble1 dans le trafic après endocytose des récepteurs NMDA. Scrib1 interagit avec les récepteurs NMDA grâce à ses domaines PDZ. Scribble1 peut interagir avec le complexe AP2 qui intervient dans l’endocytose des récepteurs. Cette étude a permis de définir un nouveau mécanisme dans lequel Scrib1 régule la quantité de récepteurs NMDA à la membrane et donc participe à la plasticité synaptique. Vangl2 est l’une des protéines transmembranaires les plus en amont de la voie de la PP. Nous avons identifié un nouveau partenaire nommé "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). Nous avons montré, par double hybride en levure et pull down, l’interaction de Vangl2 avec les deux isoformes de AIDA et leur colocalisation en COS7 et neurones. Ensemble, ces données présentent AIDA comme un très bon candidat pour le maintien de Vangl2 aux jonctions adhérentes et/ou pour son adressage à la membrane. Ces études nous ont permis d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliquant les protéines de la polarité planaire. / There are many mechanisms involved in the development of tissues that require cells or groups of cells orient and polarize. The proteins of the planar cell polarity (PCP) combine to form complexes with the membrane and create proximal-distal asymmetries. Vangl2 and Scrib1 have been identified as the first two genes involved in the PCP in mammals. In this study, I am interested in these two proteins and some of the complex in which they are involved. At first, using techniques of biochemistry, cell biology and biophysics, we showed the direct involvement of Scribble1 in traffic after endocytosis of NMDA receptors. Scrib1 interacts with NMDA receptors through its PDZ domains. Due to this binding motif between PDZ1 and PDZ2 of Scrib1, it can interact with the AP2 complex which is involved in receptor endocytosis. This study has identified a new mechanism in which Scrib1 regulates the amount of NMDA receptors on the membrane and is therefore involved in synaptic plasticity. Vangl2 is a transmembrane protein of the most upstream of the PCP pathway. We have identified a new partner named "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). We have shown, by yeast two-hybrid and pull down the interaction of Vangl2 with two isoforms of AIDA and collocation in COS7 and neurons. Together, these data show AIDA as a very good candidate for maintaining Vangl2 to adherens junctions and/or its membrane targeting. These studies have allowed us to improve our understanding of the mechanisms involving the planar polarity proteins.

L'analyse cinétique d'interactions de protéines offre une multitude d'informations sur les fonctions physiologiques de ces molécules au sein de l'activité cellulaire, et peut donc contribuer à l'amélioration des diagnostics médicaux ainsi qu'à la découverte de nouveaux traitements thérapeutiques. La résonance plasmonique de surface (SPR) est la technique de biodétection optique de référence pour les études cinétiques d'interaction de molécules biologiques. Si la SPR offre une détection en temps réel et sans marquage, elle nécessite en revanche des équipements coûteux et sophistiqués ainsi que du personnel qualifié, limitant ainsi son utilisation au sein de laboratoires de recherche académiques. Dans ces travaux de thèse, nous avons développé une plateforme de biodétection basée sur l'utilisation de nanofentes biofonctionnalisées combinées avec une détection par microscopie à fluorescence. Ce système permet l'observation en temps réel d'interactions protéines-protéines et la détermination des constantes cinétiques associées, avec des temps de réponse optimisés et une excellente efficacité de capture. La fonctionnalité du système a été démontrée par l'étude des cinétiques d'interaction de deux couples modèles de différentes affinités : le couple streptavidine/biotine et le couple IgG de souris/anti-IgG de souris. Une très bonne cohérence entre les constantes cinétiques extraites, celles obtenues par des expériences similaires réalisées en SPR et les valeurs rapportées dans la littérature montre que notre approche pourrait être facilement applicable pour l'étude cinétique d'interactions de protéines avec une sensibilité allant jusqu'au pM, sur une large gamme de constantes de dissociation. De plus, nous avons intégré un générateur de gradient de concentrations microfluidique en amont de nos nanofentes, permettant ainsi des mesures simultanées de cinétiques d'interactions à différentes concentrations d'analyte en une seule expérience. Ce système intégré offre de nombreux avantages, tels qu'une réduction de la consommation des réactifs et des temps d'analyse par rapport aux approches séquentielles classiques. Cette technologie innovante pourrait ainsi être un outil précieux non seulement pour les domaines du biomédical et de la médecine personnalisée mais aussi pour la recherche fondamentale en chimie et biologie. / Kinetic monitoring of protein-protein interactions offers fundamental insights of their cellular functions and is a vital key for the improvement of diagnostic tests as well as the discovery of novel therapeutic drugs. Surface plasmon resonance (SPR) is an established biosensor technology routinely used for kinetic studies of biomolecular interactions. While SPR offers the benefits of real-time and label-free detection, it requires expensive and sophisticated optical apparatus and highly trained personnel, thus limiting the accessibility of standard laboratories. In this PhD project, we have developed an alternative and cost-effective biosensor platform exploiting biofunctionalized nanofluidic slits, or nanoslits, combined with a bench-top fluorescence microscope. Our approach enables the visualization of protein interactions in real-time with the possibility to determine associated kinetic parameters along with optimized response times and enhanced binding efficiency. We have demonstrated the effectiveness of our devices through kinetic studies of two representative protein-receptor pairs with different binding affinities: streptavidin-biotin and mouse IgG/anti-mouse IgG interactions. Good agreement of extracted kinetic parameters between our device, SPR measurements and literature values indicated that this approach could be readily applicable to study kinetics of protein interactions with sensitivity down to 1 pM on a large scale of dissociation constants. In addition, we have incorporated a microfluidic gradient generator to our validated nanoslit device, which has allowed one-shot parallel kinetic measurements to be realized in a single-experiment. This integrated system provides advantages of diminished material consumption and analysis time over the conventional kinetic assays. We believe that this innovative technology will drive future advancements not only in the discipline of biomedical and personalized medicine, but also in basic chemical/biological research.