O fósforo é um dos minerais mais abundantes no corpo além de ser essencial para muitos processos biológicos. A homeostase do fósforo depende da absorção no intestino, da excreção renal, da remodelação óssea e de hormônios como o paratormônio, calcitriol e FGF-23. Nos pacientes com doença renal crônica, a excreção urinária de fósforo está comprometida levando à hiperfosfatemia, que contribui para o aumento da morbidade e mortalidade desses pacientes. A absorção intestinal de fósforo no intestino delgado, particularmente via cotransportadores NaP-IIb e PiT-1, é pouco estudada. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos de dietas com diferentes concentrações de fósforo na expressão proteica e gênica dos cotransportadores NaP-IIb e PiT-1, bem como na apoptose dos enterócitos dos diferentes segmentos do intestino delgado de animais controles e urêmicos. Estudamos setenta e seis ratos Wistar machos, inicialmente divididos em dois grupos: controles (C) e urêmicos (Nx). Cada grupo foi subdividido em outros três, de acordo com a concentração de fósforo (P) na dieta: dieta Baixa (0,2%), dieta Padrão (0,54%) e dieta Alta (0,9%). Analisamos parâmetros bioquímicos (creatinina, P, Cai, PTH e FGF-23), a expressão proteica dos cotransportadores, através de Western Blotting, ELISA e imunofluorescência, a expressão gênica por PCR em tempo real e a apoptose dos enterócitos pela técnica TUNEL. Os resultados mostraram que os níveis séricos de creatinina, P, PTH e FGF-23 foram significativamente mais elevados nos animais Nx. Nos animais C com dieta baixa em P observamos aumento da expressão proteica do cotransportador NaP-IIb em todos os segmentos do intestino enquanto, no Nx Baixo, a expressão desse cotransportador foi menor somente no jejuno. Quanto ao PiT-1, sua expressão foi menor no íleo do grupo Nx Alto comparado ao seu respectivo controle. A expressão gênica do cotransportador NaP-IIb foi menor no jejuno do Nx Alto e maior no íleo desse mesmo grupo em relação aos seus respectivos controles. A expressão gênica do PiT-1 foi maior em todos os segmentos do grupo Nx Baixo em relação aos seus controles. Detectamos uma correlação direta entre a expressão gênica do NaP-IIb no jejuno com o fósforo sérico. A expressão gênica do PiT-1 no jejuno correlacionou-se com o fósforo sérico e no duodeno e jejuno, com os níveis séricos de FGF-23. No duodeno e no jejuno, a porcentagem de enterócitos apoptóticos foi maior nos animais Nx Alto comparados aos controles, particularmente no duodeno a porcentagem dessas células também foi maior no grupo Nx Baixo e controle padrão. Já no jejuno, tanto o grupo Nx baixo quanto no Nx Padrão observamos menos células apoptóticas que nos seus respectivos controles. Quando analisamos conjuntamente todos os segmentos intestinais o grupo Nx alto apresentou mais células apoptóticas que o controle e o oposto foi observado nos grupos Nx Baixo e Nx Padrão. Em conclusão, dietas com distintas concentrações de fósforo promovem modificações na expressão proteica e gênica dos cotransportadores NaP-IIb e PiT-1 no intestino delgado que não seguem um padrão uniforme. A sobrecarga de fósforo aumenta a porcentagem de enterócitos apoptóticos nos animais urêmicos / Phosphorus is one of the most abundant minerals in the body besides being essential for many biological processes. Phosphorus homeostasis depends on absorption in the small intestine, renal excretion, bone remodeling and hormones such as parathyroid hormone, calcitriol and FGF-23. In patients with chronic kidney disease phosphorus urinary excretion is compromised leading to hyperphosphatemia, which contributes to increased morbidity and mortality of these patients. Intestinal absorption of phosphorus in the small intestine, particularly of NaP-IIb and PiT-1 cotransporters is poorly studied. The aim of this study was to evaluate the effects of diets with different concentrations of phosphorus in protein expression and gene of NaP-IIb and PiT-1 cotransporters as well as in apoptosis of enterocytes of different segments of intestine in control and uremic animals. We studied seventy-six male Wistar rats initially divided into two groups: controls (C) and uremic (Nx). Each group was subdivided into three others, according to the phosphorus concentration in the diet: Low diet (0.2% P), Standard diet (0.54% P) and High diet (0.9% P). We analyzed biochemical parameters (creatinine, P, iCa, PTH and FGF-23), protein expression of cotransporters, using Western Blot, ELISA, immunofluorescence, real-time PCR and apoptosis of enterocytes using the TUNEL technique. Results showed that serum creatinine, P, PTH and FGF-23 were significantly higher in Nx animals. In C animals with a diet low in P we observed increase in protein expression of NaP-IIb cotransporter in all segments of the intestine while in low Nx expression of this cotransporter was lower only in jejunum. As for PiT-1 expression was lower in the ileum of the high Nx group compared to their respective control. Gene expression of NaP-IIb cotransporter was lower in the jejunum of high Nx and higher in the ileum of the same group as compared to their respective controls. PiT-1 gene expression was higher in all segments of the low Nx group compared to their controls. We detected a direct correlation between the gene expression of NaP-IIb in jejunum and serum phosphorus. Gene expression of PiT-1 correlated with serum phosphorus in the jejunum, and correlated with the serum levels of FGF-23 in the jejunum and duodenum. In the duodenum and jejunum the percentage of apoptotic enterocytes was higher in high Nx animals compared to controls; particularly in the duodenum the percentage of these cells was also higher in low Nx group and standard control. In the jejunum in both low Nx group and standard Nx we observed fewer apoptotic cells than in their respective controls. When we analyze all intestinal segments together the high Nx group had more apoptotic cells than the control, and the opposite was observed in the low Nx group and standard Nx group. In conclusion, diets with different phosphorus concentrations promote changes in protein expression and gene of NaP-IIb and PiT-1 cotransporters in the small intestine that do not follow a uniform pattern. Phosphorus overhead increases the percentage of apoptotic enterocytes in uremic animals

A doença do enxerto versus hospedeiro (DEVH) é uma grave complicação do transplante de órgãos sólidos, com alta mortalidade. Seu estudo tem sido limitado pela carência de modelos experimentais apropriados. Descreve-se um modelo de DEVH baseado no aumento do quimerismo, sua evolução clínica, histopatológica, do número das células quiméricas, do perfil das citocinas e da tolerância imunológica. Ratos Lewis (LEW) foram submetidos a transplante simultâneo de intestino delgado e medula óssea provenientes de ratos ACI (grupo de estudo - E) ou LEW (grupo controle - C), tratados com FK-506 (1 mg/Kg/dia) entre o 0 e 13o PO, e uma dose semanal daí por diante. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos: E1- 6 ratos sacrificados no 120o PO. E2- 8 ratos após apresentarem sinais clínicos graves de DEVH entre o 189o e o 271o PO. Como controle, ratos LEW foram receptores dos mesmos tipos de enxertos provenientes de ratos LEW, submetidos à mesma imunossupressão e foram assim divididos: C1- 6 ratos sacrificados no 120o PO, C2- 5 ratos sacrificados entre o 223o e o 270o PO. A citometria de fluxo foi realizada para quantificar a porcentagem das células linfóides de ACI doadores no sangue periférico nos E1, E2 em 6 períodos: 30o PO, 65o PO, 95o PO, 120o PO, 160o PO, 200o PO. Os animais foram examinados 2 vezes por semana à procura de sinais de DEVH (rash cutâneo, perda de peso, de pelo e hiperqueratose). No sacrifício dos animais do grupo E1 e C1, foram colhidas amostras de língua (LI), de linfonodos cervicais (LC), intestino delgado do receptor e do enxerto para análise das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa por meio da reação em cadeia da polimerase. Em todos os grupos foram também colhidas amostras destes órgãos para histopatologia e nos animais do grupo E2 linfonodos cervicais foram processados para análise da reatividade celular por meio da reação mista dos linfócitos (MLR). A evolução clínica e histopatológica foi graduada de 0 a 3 de acordo com a severidade dos sintomas e do infiltrado mononuclear das amostras. Os ratos dos grupos E1 e E2 iniciaram sinais da DEVH entre o 84o e 115o PO. Os ratos dos grupos C1 e C2 não apresentaram evidência de DEVH. Amostras de LI e LC dos ratos do grupo E1 apresentaram alterações histopatológicas grau 2 e do grupo E2 apresentaram alterações histopatológicas grau 3, respectivamente. Nenhuma alteração histopatológica foi encontrada nos ratos do grupo controle e em amostras do ID. Nenhuma alteração histopatológica foi encontrada no intestino delgado do receptor e do enxerto. O aumento da porcentagem de células do doador no sangue periférico do receptor foi progressivo chegando a 5,4±2.3% no 10o período, 21±4,6% no 3o período e 39,3±4% no 6o período. IL-2, IL-6, IL-10, IFN-gma e TNF-alfa estiveram aumentados em língua e IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa em linfonodos cervicais. Os linfócitos de ratos do grupo E2 mostraram hiporreatividade aos de ratos ACI e hiperreatividade aos de ratos PVG (terceira parte) denotando tolerância imunológica. Neste modelo experimental há uma inexorável evolução imunológica para DEVH; existe correlação direta entre o aumento do quimerismo em sangue periférico e da expressão de citocinas em língua e linfonodos cervicais e a severidade da DEVH, além da indução de tolerância imunológica do rato do grupo E2 quimérico ao rato ACI normal. / Graft-versus-host disease (GVHD) has been a major concern after small bowel transplantation (SBTX) and the lack of suitable experimental models has limited the study of GVHD after solid organ transplantation. Here we describe a re1evant experimental model of GVHD after fully allogeneic SBTX based on chimerism augmentation, its clinical and histophatological evolution, cytokine involvement, responsible donor cell and immunologic tolerance analysis. LEW rat recipients received orthotopic SBTX and simultaneous donor bone marrow cell infusion (250x106), from ACI rats (experimental group - E) or LEW (control group C). FK-506 was administered dayly at a dose of 1 mg/kg on day 0 to 13, then continued as a weekly injection of same dose until the experimental end point. The recipients were divided in the following groups: E1 - 6 rats sacrificed at 120° POD. E2 - 8 rats sacrificed with critical GVHD between DPO 189 to 271. LEW recipient of LEW grafts, under the same immunossupression were used as control and divided as: C1 - 6 rats sacrificed at POD 120; C2- 5 rats sacrificed between 223 and 270 POD the number of donor cell in the recipient circulation was determined by flowcytometry in 6 pos-operative time: 30, 65, 95, 120, 160, 200. The rats were analyzed twice a week for body weigh and searching for signs of GVHD (cutaneous rush, hiperkeratosis and loss of hair and body weigh). At the sacrificed, samples from tongue (TG), cervical lymph node (CLN), donor (SBD) and recipient (SBR) small bowel were taken from all animals for histophatology and from E1 and C1l animals for IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa cytokines analysis using reverse transcription polymerase chain reaction. Samples from cervical lynph nodes of 5 animals from group E2 were used for mixed lymphocyte reaction for tolerance analysis. The clinical and histophatological evolution of the disease were evaluated from degree 0 to 3 according to the severity. GVHD in E1 and E2 animals started between 84 and 115 POD. Histophatological analysis of TG and CLN showed that E1 animals present GVHD grade 2 and E2 animals grade 3. The increase of donors cells in the recipient circulation was progressive and account for 5.4± 2.3% at POD 30, 21.4±4.6% at POD 95 and 39.3±4% at POD 200. IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa were upregulated in CLN and IL-2, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa were upregulated in TG when compared with the respective controls. The lymphocytes from E2 group showed hyporeactivety to lymphocytes of normal ACI and hypereactivety to those of PVG, meaning tolerance. No cytokines alteration was noted in SBD neither SBR. Animals from group C1 and C2 did not present any sign of disease. This result show that GVHD is a inexoravel evolution under the experimental conditions of this study and the evolution of the disease is near correlated with the augmentation of the donor cells in the recipient circulation and upregulation of cytokines gene expression in target organs. Tolerance to the same donor strain lynphocytes was also noted.

[ES] Las bacterias resistentes a múltiples antibióticos, como el Enterococo resistente a vancomicina (ERV), son un problema creciente en los pacientes hospitalizados, por lo que se necesita estrategias alternativas para combatir estos patógenos. Las infecciones causadas por ERV suelen comenzar con la colonización del tracto intestinal, un paso crucial que se afectado por la presencia de la microbiota. Sin embargo, los antibióticos alteran la microbiota y esto promueve la colonización de ERV. Una vez que el patógeno ha colonizado el intestino, alcanza niveles muy altos pudiendo diseminar a otros órganos y pacientes. A pesar de su importancia, se sabe muy poco sobre los genes que codifica para colonizar el intestino y sobre el mecanismo por el cual la microbiota suprime su colonización intestinal, siendo los dos objetivos principales. En primer lugar hemos utilizado una metodología previamente descrita (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), basada en la generación de una librería de mutantes por transposición junto a secuenciación masiva, con el fin de identificar los genes codificados por ERV necesarios para la colonización del intestino en ratones. Además, hemos realizado análisis metatranscriptómicos para identificar aquellos genes más expresados. El análisis ha identificado genes cuya interrupción reduce significativamente la colonización intestinal en el intestino grueso. Los genes que más afectaron a la colonización codifican proteínas relacionadas con la absorción o el transporte de diversos nutrientes como los carbohidratos (subunidad EIIAB del transportador PTS de manosa, el regulador transcripcional de la familia LacI, ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa) o iones (proteína transportadora dependiente de ATP (ABC) y proteínas del grupo [Fe-S]). El papel de estos genes en la colonización se ha confirmado mediante experimentos de mutagénesis directa y de competición con la cepa salvaje. Además, estos genes afectan a la colonización intestinal con diferentes antibióticos (clindamicina y vancomicina). Para identificar el mecanismo molecular por el cual cada gen afecta a la colonización, hemos realizado experimentos in vitro y ex vivo además del análisis transcriptómico. Los experimentos in vitro confirman que las proteínas del grupo [Fe-S] están involucradas en el transporte iones de hierro, principalmente Fe3+. Por otra parte, los genes de la subunidad EIIAB del transportador de manosa y del ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa son necesarios para la utilización de la manosa y el ácido N-acetilmurámico, respectivamente, azúcares que suelen estar presentes en el intestino. También confirmamos que el regulador transcripcional de la familia LacI es un represor que afecta a proteínas transportadoras ABC, probablemente implicadas en la absorción de carbohidratos. Además, algunos de estos genes están codificados principalmente por cepas clínicas de E. faecium y en menor medida por cepas comensales. En segundo lugar, estudiamos los mecanismos de protección de un consorcio de cinco bacterias comensales, que anteriormente se había demostrado que disminuían la colonización intestinal por ERV en ratones. Mediante transcriptómica, metabolómica y los ensayos in vivo observamos que el consorcio bacteriano inhibe el crecimiento de ERV mediante la reducción de nutrientes, concretamente fructosa. Por último, el análisis ARN-Seq in vivo de cada aislado en combinación con los ensayos ex vivo e in vivo demostraron que una sola bacteria (Olsenella sp.) proporciona protección. En conjunto, los resultados obtenidos han identificado la función de genes específicos requeridos por ERV para colonizar el intestino. Además, hemos identificado un mecanismo mediante el cual la microbiota confiere protección. Estos resultados podrían conducir a nuevos enfoques terapéuticos para prevenir las infecciones causadas por este patógeno multiresistente a los antibióticos. / [CA] Els bacteris resistents a múltiples antibiòtics, com el Enterococo resistent a vancomicina (ERV), són un problema creixent en els pacients hospitalitzats, que són resistents a la majoria d'antibiòtics disponibles per la qual cosa es necessita estratègies alternatives per a combatre aquests patògens. Les infeccions causades per ERV solen començar amb la colonització del tracte intestinal, un pas crucial que es veu afectat per la presència de la microbiota. No obstant això, els antibiòtics alteren la microbiota i això promou la colonització de ERV. Una vegada que el patogen ha colonitzat l'intestí, aconsegueix nivells molt alts podent disseminar a altres òrgans i pacients. Malgrat la seua importància, se sap molt poc sobre els gens que codifica ERV per a colonitzar l'intestí i sobre el mecanisme pel qual la microbiota suprimeix la seua colonització intestinal. En primer lloc hem utilitzat una metodologia prèviament descrita (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), basada en la generació d'una llibreria de mutants per transposició junt amb seqüenciació massiva, amb la finalitat d'identificar els gens codificats per ERV necessaris per a la colonització de l'intestí en ratolins. A més a més, hem realitzat anàlisi metatranscriptòmics per a identificar aquells gens més expressats. L'anàlisi ha identificat gens quina interrupció redueix significativament la colonització intestinal en l'intestí gros. Els gens que més van afectar la colonització codifiquen proteïnes relacionades amb l'absorció o el transport de diversos nutrients com els carbohidrats (subunitat EIIAB del transportador PTS de manosa, el regulador transcripcional de la família LacI, àcid N-acetilmuràmic 6-fosfat eterasa) o ions (proteïna transportadora dependent d'ATP (ABC) i proteïnes del grup [Fe-S]). El paper d'aquests gens en la colonització s'ha confirmat mitjançant experiments de mutagènesis directa i de competició amb el cep salvatge. A més, aquests gens afecten la colonització intestinal amb diferents antibiòtics (clindamicina i vancomicina). Per a identificar el mecanisme molecular pel qual cada gen afecta a la colonització, hem realitzat experiments in vitro i ex viu a més de l'anàlisi transcriptòmic. Els experiments in vitro confirmen que les proteïnes del grup [Fe-S] estan involucrades en el transport d'ions de ferro, principalment Fe3+. D'altra banda, els gens de la subunitat EIIAB del transportador PTS de manosa i de l'àcid N-acetilmuràmic 6-fosfat eterasa són necessaris per a la utilització de la manosa i l'àcid N-acetilmuràmic, respectivament, sucres que solen estar presents en l'intestí. També confirmem que el regulador transcripcional de la família LacI és un repressor que afecta proteïnes transportadores ABC, probablement implicades en l'absorció de carbohidrats. A més a més, alguns d'aquests gens estan codificats principalment per ceps clínics de E. faecium i en menor mesura per ceps comensals. En segon lloc, estudiem els mecanismes de protecció d'un consorci de cinc bacteris comensals, que adès s'havia demostrat que disminuïen la colonització intestinal per ERV en ratolins. Amb l'ús de transcriptòmica, metabolòmica i els assajos in vivo observem que el consorci bacterià inhibeix el creixement de ERV mitjançant la reducció de nutrients, concretament fructosa. Finalment, l'anàlisi ARN-Seq in vivo de cada aïllat en combinació amb els assajos ex viu i in vivo van demostrar que un sol bacteri (Olsenella sp.) proporciona protecció. En conjunt, els resultats obtinguts han identificat la funció de gens específics requerits per ERV per a colonitzar l'intestí. A més, hem identificat un mecanisme mitjançant el qual la microbiota confereix protecció. Aquests resultats podrien conduir a nous enfocaments terapèutics per a previndre les infeccions causades per aquest patogen multiresistent als antibiòtics. / [EN] Multidrug-resistant bacteria, such as vancomycin-resistant-Enterococcus (VRE), are an increasing problem in hospitalized patients. Some VRE strains can be resistant to most available antibiotics, thus, alternative strategies to antibiotics are urgently needed to combat these challenging pathogens. Infections caused by VRE frequently start by colonization of the intestinal tract, a crucial step that is impaired by the presence of the intestinal microbiota. Administration of antibiotics disrupts the microbiota, which promotes VRE intestinal colonization. Once VRE has colonized the gut, it reaches very high levels, which promotes its dissemination to other organs and its transfer to other patients. Despite the relevance of VRE gut colonization, very little is known about the genes encoded by this pathogen to colonize the gut and about the mechanisms by which the microbiota suppresses VRE gut colonization. In this thesis, we have utilized a previously described methodology (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), based on the generation of a transposon mutant library coupled with high-throughput sequencing, in order to identify VRE encoded genes required for colonization of the mouse intestinal tract. In addition, we have performed metatranscriptomic analysis in mice to identify VRE genes specifically expressed in the gut. Our analysis has identified genes whose disruption significantly reduces VRE gut colonization in the large intestine. The genes that most affected VRE gut colonization encoded for proteins related to the uptake or transport of diverse nutrients such as carbohydrates (PTS mannose transporter subunit EIIAB, LacI family DNA-binding transcriptional regulator, N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase) or ions (phosphate ABC transporter ATP-binding protein and proteins from [Fe-S] cluster). The role of these genes in gut colonization has been confirmed through targeted mutagenesis and competition experiments against a wild type strain. Moreover, these genes affect gut colonization under different antibiotic treatments (clindamycin and vancomycin). To elucidate the mechanism by which each gene influences gut colonization, we have performed in vitro and ex vivo experiments besides transcriptomic analysis. In vitro experiments confirm that proteins from [Fe-S] cluster are involved in the transport of different forms of iron ions, mostly Fe3+. On the other hand, the PTS mannose transporter subunit EIIAB and N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase genes are required for the utilization of mannose and N-acetyl-muramic acid, respectively, sugars that are usually present in the intestinal environment. We have also confirmed that LacI family DNA-binding transcriptional regulator is a repressor that affects the expression of genes encoding for an ABC transporter probably involved in the uptake of carbohydrates. Furthermore, we have confirmed that some of these genes are encoded mainly by E. faecium clinical strains but not or to a lower extent by commensal strains. Secondly, we studied the mechanisms of protection of a consortium of five commensals bacteria, previously shown to restrict VRE gut colonization in mice. Functional transcriptomics in combination with targeted metabolomics and in vivo assays performed in this thesis indicated that the bacterial consortium inhibits VRE growth through nutrient depletion, specifically by reducing the levels of fructose. Finally, in vivo RNA-Seq analysis of each bacterial isolate of the consortium in combination with ex vivo and in vivo assays demonstrated that a single bacterium (Olsenella sp.) could recapitulate the protective effect. Altogether, the results obtained have identified the function of specific genes required by VRE to colonize the gut. In addition, we have identified a specific mechanism by which the microbiota confers protection against VRE colonization. These results could lead to novel therapeutic approaches to prevent infections caused by this pathogen. / Flor Duro, A. (2021). Characterization of Genes and Functions Required by Multidrug-resistant Enterococci to Colonize the Intestine [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/166494

Tesis por compendio / [ES] La obesidad es un gran reto de salud pública que ha alcanzado proporciones epidémicas. El entorno "occidentalizado" en el que vivimos, caracterizado por la accesibilidad a alimentos hipercalóricos, contribuye al desequilibrio crónico entre energía ingerida y gasto energético que causan la obesidad. Las intervenciones conductuales diseñadas para la pérdida de peso tienen limitada efectividad a largo plazo, por lo que existe una urgente necesidad de desarrollar estrategias más eficaces y seguras para prevenir y tratar la obesidad y sus comorbilidades. El desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas al intestino para mejorar la salud metabólica requiere un conocimiento en profundidad de las vías de señalización neuroendocrina intestinal que regulan el la ingesta y el equilibrio energético. El objetivo de esta tesis ha sido profundizar en las interacciones intestino-cerebro implicadas en el control de la homeostasis energética, incluyendo los componentes endocrinos, neurales y la microbiota intestinal, en el contexto del desarrollo de la obesidad inducida por una dieta hipercalórica. En los Capítulos 1 y 2 hemos explorado nuevas funciones de las neuronas sensoriales aferentes que expresan el canal de sodio Nav1.8 en el control de la homeostasis energética, considerando las diferencias entre sexos. Hemos generado un modelo de ratón carente de las neuronas Nav1.8+ mediante ablación con toxina diftérica. En el Capítulo 1 hemos demostrado que las neuronas Nav1.8+ son indispensables para regular específicamente según el sexo las vías neurales y endocrinas implicadas en la homeostasis energética. En hembras, la ablación de estas neuronas mejora la regulación de la glucosa postprandial potenciando la señalización enteroendocrina de GLP-1 y acelera el tránsito intestinal, mientras que en machos induce resistencia al aumento de peso inducido por una dieta obesogénica. En el Capítulo 2 hemos demostrado que, en machos, la ablación de las neuronas Nav1.8+ altera el control coordinado de la ingesta i las variaciones de peso diarias, además de alterar la señalización enteroendocrina y las oscilaciones diarias de la microbiota intestinal en respuesta al estado nutricional (ayuno/ingesta), y perturbar la homeostasis del sistema inmune intestinal. En el capítulo 3, hemos usado un modelo de ratón con obesidad inducida por dieta para explorar los mecanismos por los cuales Phascolarctobacterium faecium DSM 32890, una cepa bacteriana intestinal aislada de humanos metabólicamente sanos, previene la obesidad modulando la ingesta. La administración de P. faecium reduce la ingesta calórica gracias a la hipersecreción de la hormona gastrointestinal saciante el PYY. Independientemente de sus efectos anorexigénicos, la bacteria ejerce sus beneficios metabólicos estimulando el tránsito intestinal y reduciendo la absorción intestinal de lípidos, evitando la acumulación de grasa corporal. En conclusión, esta tesis doctoral proporciona evidencia preclínica que contribuye a una comprensión más precisa de las vías neuroendocrinas que comunican el intestino y el cerebro, y del papel que tiene la microbiota intestinal en la regulación de la ingesta y el gasto energético. Destacamos la importancia de las neuronas sensoriales aferentes Nav1.8+ en la detección de estímulos intestinales por quimiorreceptores para regular el balance energético en ambos sexos, lo cual abre una nueva línea de investigación para diseñar herramientas de neuromodulación de las neuronas Nav1.8+ con el fin de prevenir y tratar los trastornos metabólicos inducidos por la dieta, de forma específica para cada sexo. También destacamos que P. faecium es una bacteria candidata como probiótico de nueva generación, ya que modula el sistema enteroendocrino del hospedador y previene la obesidad en un modelo preclínico. En conjunto, estos hallazgos proporcionan una base para el desarrollo de estrategias terapéuticas basadas en el intestino dirigidas a combatir la obesidad y comorbilidades asociadas. / [CA] L'obesitat és un gran repte de salut pública que ha assolit proporcions epidèmiques. L'entorn "occidentalitzat" en el que vivim, caracteritzat per l'accessibilitat a aliments hipercalòrics, contribueix al desequilibri crònic entre energia ingerida i despesa energètica que causen l'obesitat. Les intervencions conductuals dissenyades per a la pèrdua de pes tenen una eficàcia limitada a llarg termini, per la qual cosa hi ha una necessitat urgent de desenvolupar estratègies més eficaces i segures per a prevenir i tractar l'obesitat i les seues comorbiditats. El desenvolupament d'estratègies terapèutiques dirigides a l'intestí per a millorar la salut metabòlica requereix un coneixement en profunditat de les vies de senyalització neuroendocrina intestinal que regulen la ingesta i l'equilibri energètic. L'objectiu d'aquesta tesi ha sigut aprofundir en les interaccions intestí-cervell implicades en el control de l'homeòstasi energètica, incloent els components endocrins, neurals i la microbiota intestinal, en el context del desenvolupament de l'obesitat induïda per una dieta hipercalòrica. En els Capítols 1 i 2 hem explorat noves funcions de les neurones sensorials aferents que expressen el canal de sodi Nav1.8 en el control de l'homeòstasi energètica, considerant les diferències entre sexes. Hem generat un model de ratolí mancat de les neurones Nav1.8+ mitjançant ablació amb toxina diftèrica. En el Capítol 1 hem demostrat que les neurones Nav1.8+ són indispensables per a regular, específicament segons el sexe, les vies neurals i endocrines implicades en l'homeòstasi energètica. En femelles, l'ablació d'aquestes neurones millora la regulació de la glucosa postprandial potenciant la senyalització enteroendocrina de GLP-1 i accelera el trànsit intestinal, mentre que en mascles indueix resistència a l'augment de pes induït per una dieta obesogènica. En el Capítol 2 hem demostrat que, en mascles, l'ablació de les neurones Nav1.8+ altera el control coordinat de la ingesta i les variacions de pes diàries, a més d'alterar la senyalització enteroendocrina i les oscil·lacions diàries de la microbiota intestinal en resposta a l'estat nutricional (dejuni/ingesta), i pertorbar l'homeòstasi del sistema immunitari intestinal. En el capítol 3, hem utilitzat un model de ratolí amb obesitat induïda per dieta per explorar els mecanismes pels quals Phascolarctobacterium faecium DSM 32890, una soca bacteriana intestinal aïllada d'humans metabòlicament sans, prevé l'obesitat modulant la ingesta. L'administració de P. faecium redueix la ingesta calòrica gràcies a la hipersecreció de l'hormona gastrointestinal saciant PYY. Independentment dels seus efectes anorexigènics, el bacteri exerceix els seus beneficis metabòlics estimulant el trànsit intestinal i reduint l'absorció intestinal de lípids, evitant l'acumulació de greix corporal. En conclusió, aquesta tesi doctoral proporciona evidència preclínica que contribueix a una comprensió més precisa de les vies neuroendocrines que comuniquen l'intestí i el cervell, i del paper que té la microbiota intestinal en la regulació de la ingesta i la despesa energètica. Destaquem la importància de les neurones sensorials aferents Nav1.8+ en la detecció d'estímuls intestinals per quimioreceptors per a regular l'equilibri energètic en ambdós sexes, que obri una nova línia d'investigació per a dissenyar ferramentes de neuromodulació de les neurones Nav1.8+ amb la finalitat de prevenir i tractar els trastorns metabòlics induïts per la dieta, de forma específica per a cada sexe. També destaquem que P. faecium és un bacteri candidat com a probiòtic de nova generació, ja que modula el sistema enteroendocrí de l'hoste i prevé l'obesitat en un model preclínic. En conjunt, aquests troballes proporcionen una base per al desenvolupament d'estratègies terapèutiques basades en l'intestí dirigides a combatre l'obesitat i comorbiditats associades. / [EN] Obesity is a major global public health challenge that has reached epidemic proportions. Besides its profound impact on health and well-being, this metabolic disorder represents a significant economic burden to society. Our westernized environment where high-calorie foods are readily available, represents a major driver of the chronic imbalance between energy intake and energy expenditure that cause obesity. The limited effectiveness of behavioral interventions to manage long-term weight loss highlights the urgent need to develop more effective and minimally invasive approaches to prevent and treat obesity and its comorbidities. The development of gut-targeted therapeutic strategies to improve metabolic health requires a comprehensive understanding of the gut neuroendocrine signaling pathways that, in interaction with the gut microbiota, control feeding behavior to ultimately maintain energy balance. The aim of this thesis has been to gain insight into gut-brain interactions, including those mediated by endocrine, neural and gut microbial components, involved in the control of energy homeostasis, with a focus on obesogenic diet-related dysfunctions that increase susceptibility to develop obesity. In Chapters 1 and 2, we have investigated novel functions of sensory afferent neurons expressing the sodium channel Nav1.8 in the control of energy homeostasis, considering sex-specificities, by generating a mouse model lacking Nav1.8+ neurons through a diphtheria toxin ablation strategy. In Chapter 1, we show that Nav1.8+ neurons are required to control neural and endocrine pathways involved in energy homeostasis in a sex-specific manner. Specifically, ablation of Nav1.8+ neurons in females improves postprandial glucose regulation by enhancing glucagon-like peptide-1 enteroendocrine signaling and accelerating intestinal transit, whereas in males it induces resistance to weight gain in response to an obesogenic diet. To further explore the role of Nav1.8+ neurons in controlling food intake and pre- and post-prandial daily rhythms that influence metabolic phenotype, in Chapter 2 we show in males that ablation of Nav1.8+ sensory neurons impairs the coordinated control of food intake and body weight fluctuations throughout the day. The loss of these neurons also alters the physiological enteroendocrine signaling and daily gut microbiota oscillations in response to the nutritional status (fasting/refeeding cycles) and disrupts intestinal immune homeostasis. In Chapter 3, we used a diet-induced obese mouse model to investigate the mechanisms by which Phascolarctobacterium faecium DSM 32890, a gut bacterial strain isolated from metabolically healthy humans, prevents obesity by modulating food intake. We show that administration of P. faecium reduces caloric intake by promoting hypersecretion of a satiating gastrointestinal hormone, the peptide YY (PYY). Independently of its anorexigenic effects, the bacterium exerts its metabolic benefits via complementary mechanisms, specifically by stimulating intestinal transit and reducing intestinal lipid absorption, thereby preventing body fat accumulation. In conclusion, this doctoral thesis provides preclinical evidence for a better understanding of gut-to-brain neuroendocrine pathways and the role of gut microbiota in the regulation of food intake and energy expenditure. We highlight the importance of Nav1.8+ sensory afferent neurons in gut chemosensing for maintaining energy balance in both sexes, which prompts novel research lines and opportunities to design of sex-specific neuromodulation tools targeting Nav1.8+ neurons for prevention and treatment of diet-induced metabolic disorders. We also highlight that P. faecium is a promising next-generation probiotic candidate, as it modulates the host enteroendocrine system and prevents obesity in a preclinical model. Overall, our findings contribute to the development of gut-based therapeutic strategies to combat obesity and associated comorbidities. / This study has been funded by the European Union 7th Framework Program through the MyNewGut project (Grant agreement No. 613979) and Horizon 2020 research and innovation program under the Marie Sklodowska-Curie grant agreement No. 797297 (MRP), the Spanish Ministry of Science and Innovation (Grant PID2020-119536RB-I00), the European Commission – NextGenerationEU, through the CSIC Interdisciplinary Thematic Platform (PTI+) NEURO- AGING+ (PTI-NEURO-AGING+)”. The grant of the Spanish Ministry of Science and Innovation (MCIN/AEI) to IATA-CSIC as Accredited Center of Excellence (CEX2021-001189-S/ MCIN/AEI / 10.13039/501100011033) is acknowledged. / Bullich Vilarrubias, C. (2024). Influence of gut-to-brain neuroendocrine pathways and intestinal microbiota on energy homeostasis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/207342 / Compendio