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Mitochondrial dysfunction has been implicated for a wide range of human diseases. One of the major biosynthetic processes in human mitochondria is the biogenesis of Iron-Sulfur (Fe-S) clusters which primarily involves in electron transfer reactions during oxidative phosphorylation (OXPHOS). Defects in Fe-S cluster biogenesis process leads to mitochondrial dysfunction and that eventually results in various human mitochondrial disorders. One of the major mitochondrial disorders associated with Fe-S cluster biogenesis impairment is exercise intolerance disorder ISCU myopathy, which is a result of loss of function of Fe-S cluster scaffold protein ISCU. Our biochemical results using yeast model system and HeLa cells lines suggests that ISCU Myopathy results in defective Fe-S cluster biogenesis in mitochondrial compartment. As a result, electron transport chain (ETC) complexes demonstrate significant reduction in their redox properties, leading to loss of cellular respiration. Furthermore, in ISCU Myopathy, mitochondria display enhancement in iron levels and reactive oxygen species, thereby causing oxidative stress leading to impairment in the mitochondrial functions. On the other hand, in mammalian mitochondria, the initial step of Fe-S cluster assembly process is assisted by NFS1-ISD11 complex, which delivers sulfur to the scaffold protein ISCU during Fe-S cluster synthesis. In humans, loss of ISD11 function leads to development of respiratory distress disorder, Combined Oxidative Phosphorylation Deficiency 19 (COXPD19). Our study maps the important ISD11 amino acid residues critical for in vivo Fe-S cluster biogenesis. Importantly, mutation of these critical ISD11 residues to alanine leads to its compromised interaction with NFS1, which results in reduced stability and enhanced aggregation of NFS1 in the mitochondria. Moreover, our findings highlight that, COXPD19 associated R68L ISD11 mutant displays reduced affinity to form a stable sub-complex with NFS1, thereby fails to prevent NFS1 aggregation, resulting impairment of Fe-S cluster biogenesis. The prime affected machinery is the ETC complex which demonstrates compromised redox properties, causing diminished mitochondrial respiration in COXPD19 patients. In summary, our findings provide compelling evidence that respiration defect due to impaired biogenesis of Fe-S clusters in ISCU myopathy patients, leads to manifestation of complex clinical symptoms. Additionally, our study highlights the role of ISD11 protein in Fe-S cluster biogenesis and maps the surface residues of ISD11 protein that are involved in interaction with sulfur donor protein NFS1. Moreover, we have demonstrated the molecular basis of disease progression of COXPD19 as a result of R68L ISD11 mutation.

Many bacteria use inorganic nitrogen and sulfur compounds for energy metabolism. These compounds are often toxic and so bacteria must adapt to survive their deleterious effects. Bacteria use specific proteins in order to metabolise, sense and detoxify these compounds. In this thesis protein interactions with inorganic nitrogen and sulfur compounds are examined at the mechanistic level. Intermediates in the Sox sulfur oxidation pathway are covalently attached to a cysteine on the swinging arm of the substrate carrier protein SoxYZ. An interaction between the Sox pathway enzyme SoxB and the carrier protein SoxYZ is demonstrated. A crystal structure of a trapped SoxB-SoxYZ complex at 3.3 Å resolution identifies two sites of interaction, one between the SoxYZ carrier arm and the SoxB active site channel and the other at a patch distal to the active site. The presence of a distal interaction site suggests a mechanism for promiscuous specificity in the protein-protein interactions of the Sox pathway. Using biophysical methods it is shown that SoxB distinguishes between the substrate and product forms of the carrier protein through differences in interaction kinetics and that the carrier arm-bound substrate group is able to out-compete the adjacent C-terminal carboxylate for binding to the SoxB active site. The thiosulfate dehydrogenase TsdA has an unusual His/Cys coordinated heme. TsdA catalyses oxidative conjugation of two thiosulfate molecules to form tetrathionate. Mass spectrometry and UV/visible spectroscopy are used to identify an S-thiosulfonate reaction intermediate which is covalently attached to the cysteine heme ligand. A catalytic mechanism for TsdA is proposed using a crystal structure of TsdA at 1.3 Å resolution alongside site-directed mutagenesis of active site residues. Nitric oxide is produced by the mammalian immune response to kill bacterial pathogens. Part of the killing mechanism occurs through the reaction of nitric oxide with protein-bound iron-sulfur clusters. However, the same type of reaction is also exploited by nitric oxide-sensing bacterial proteins. An infrared spectroscopy approach is developed to detect the products of iron-sulfur protein nitrosylation. Using this methodology it is shown that the presence of trace O2 strongly impacts which products are formed in these nitrosylation reactions. These observations are of physiological relevance because bacteria are often exposed to NO under aerobic conditions during an immune response.

Le cofacteur F420 est un coenzyme d’oxydoréduction essentiel pour la méthanogenèse chez les archées, un processus qui influence fortement les interactions métaboliques au sein du microbiote intestinal ; en outre, il joue un rôle important dans la pathogénicité de la bactérie Mycobacterium tuberculosis. L’étude de sa biosynthèse présente donc un intérêt majeur en Biologie.La formation du chromophore du F420 est catalysée par la F0-synthase, qui contient, de façon unique, deux domaines caractéristiques des enzymes à radical SAM (rSAM). Ces enzymes catalysent le clivage de la S-adénosylméthionine (SAM) pour former un radical 5′ déoxyadénosyle, capable d’initier un grand nombre de réactions radicalaires.Nous avons réussi à identifier les substrats de la F0-synthase et à reconstituer la synthèse du F0 in vitro. Nous avons également démontré que cette enzyme contient deux centre [4Fe-4S] 2+/1+ rSAM fonctionnels et caractérisé les étapes de la synthèse du F0. Ceci nous a permis de proposer un mécanisme réactionnel pour la F0 synthase. Nous avons ensuite entrepris la comparaison de la F0 synthase avec les deux autres enzymes rSAM tyrosine lyases connues à ce jour : ThiH, impliquée dans la biosynthèse de la vitamine B1, et HydG, impliquée dans la biosynthèse du cofacteur métallique de l’hydrogénase à fer-fer. Nous avons ainsi découvert de nouveaux aspects de la réaction de clivage de la tyrosine par ces enzymes, permettant une meilleure compréhension de ce groupe émergent au sein de la superfamille des enzymes rSAM. / Cofactor F420 is a redox coenzyme crucial for methanogenesis in Archaea, a process which plays a major role in metabolic interactions in the gut microbiota ; It also constitutes a key pathogenicity factor for Mycobacterium tuberculosis. Understanding the biosynthesis of this cofactor is thus of major interest.The biosynthesis of the chromophore of F420 is catalyzed by F0 synthase, which comprises, in a unique manner, two radical SAM (rSAM) domains. These enzymes catalyze the cleavage of S adenosylmethionine (SAM) to produce a 5′-deoxyadenosyl radical, which can initiate a broad range of radical reactions.We succeeded to identify the substrates of F0-synthase and to perform the biosynthesis of F0 in vitro. We ascertained that F0-synthase contains two functional [4Fe-4S]2+/1+ rSAM clusters, and characterized the steps of the reaction of F0 synthesis. Based on these date, we proposed a mechanism for the F0-synthase reaction. Furthermore, we compared F0 synthase with the two other radical SAM tyrosine lyases identified to date: ThiH, which is involved in vitamin B1 biosynthesis, and HydG, which is involved in the biosynthesis of the metal cofactor of iron-iron hydrogenases. We obtained novel insights of the reaction of tyrosine cleavage catalyzed by these enzymes, providing a better understanding of this emerging group in the rSAM enzyme superfamily.

Hydrogenasen sind essentielle Enzyme im mikrobiellen H2-Kreislauf und werden als vielversprechende Katalysatoren in biologisch basierten H2-Technologien angesehen. Ein entscheidender Nachteil vieler Hydrogenasen ist ihre hohe O2-Sensitivität. Die membrangebundene Hydrogenase (MBH) aus Ralstonia eutropha ist eines der wenigen Beispiele für Hydrogenasen, die in Gegenwart von O2 katalytisch aktiv sind. Die molekularen Ursachen dieser O2 Toleranz sind bislang ungeklärt. In bisherigen Studien wurde lediglich das [NiFe]-Zentrum und dessen Umgebung auf Faktoren untersucht, die die O2-Toleranz des Enzyms hervorrufen könnten. In dieser Arbeit wurde daher der Fokus auf die kleine Untereinheit der MBH gelegt, in der sich drei elektronentransferierende Fe-S Cluster befinden. Die ligandierenden Aminosäuren dieser Fe-S Cluster wurden mittels ortsspezifischer Mutagenese verändert und die resultierenden MBH-Varianten physiologisch, biochemisch, spektroskopisch und elektrochemisch charakterisiert. Dabei wurde gezeigt, dass die O2-Toleranz der MBH maßgeblich auf einer Modifikation eines dieser drei Fe-S Cluster beruht. In der direkten Umgebung des zum aktiven Zentrum nächstgelegenen Fe-S Clusters befinden sich sechs statt vier Cysteine, wie in O2 sensitiven [NiFe]-Hydrogenasen. Die beiden zusätzlichen Cysteine um dieses proximale Cluster wurden gegen Glycine ausgetauscht, die an der entsprechenden Position in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden sind. Der Austausch der zusätzlichen Cysteine führte in vivo und in vitro zu einer erhöhten O2 Sensitivität der MBH. In EPR-spektroskopischen Untersuchungen wurde beobachtet, dass diese MBH-Variante veränderte elektronische Eigenschaften aufweist. Statt des für O2-tolerante Hydrogenasen typischen EPR-Spektrums wurde ein Signal detektiert, welches in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden ist. Anhand der Ergebnisse wurde ein Modell erstellt, das erklärt, wie eine modifizierte Fe-S Clusterkette zur O2-Toleranz von Hydrogenasen beiträgt. / Hydrogenases are essential for H2 cycling in microbial metabolism and serve as valuable blueprints for H2-based biotechnological application. Like many metalloproteins, most hydrogenases are extremely oxygen-sensitive and prone to inactivation by even traces of O2. The O2-tolerant membrane-bound [NiFe]-hydrogenase of Ralstonia eutropha is one of the few examples that have established a mechanism enabling H2 uptake in the presence of ambient O2. The molecular mechanisms of this O2 tolerance are not yet unravelled. However, up to date, only the large subunit harbouring the [NiFe] active site has been in the focus of studies on O2 tolerance. In the present study, the role of the small subunit with its electron relay, consisting of three Fe-S clusters, was investigated. Amino acid residues involved in coordination of all three clusters were exchanged, and the resulting MBH variants were investigated with physiological, biochemical, electrochemical and spectroscopic methods. It is shown that the rare feature of O2 tolerance is crucially related to a modification of the electron transfer chain. The Fe-S cluster proximal to the catalytic centre is surrounded by six instead of the four conserved coordinating cysteines. Removal of the two additional cysteines renders the protein O2-sensitive in vivo and in vitro. Electron paramagnetic resonance spectroscopy of this MBH variant revealed a signal resembling the spectrum usually detected in O2-sensitive [NiFe]-hydrogenases. The data imply that the major mechanism of O2 tolerance is based on the reductive removal of oxygenic species guided by the unique architecture of the electron transport chain rather than a restricted access of O2 to the active site.

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L'oxydation des résidus cystéines est une modification biochimique très répandue survenant dans tous les compartiments des cellules eucaryotes. Ce phénomène sert le repliement oxydatif des protéines dans le réticulum endoplasmique (RE), l'importation de protéines dans l'espace intermembranaire de la mitochondrie (IMS). De plus, il a un rôle régulateur dans la matrice mitochondriale et dans le cytosol où il contrôle l’activité des enzymes et des protéines de signalisation et de régulation. Dans tous ces procédés, la réversibilité de l'oxydation des résidus Cys est une caractéristique essentielle. Deux systèmes oxydoréductase puissants existent : les voies de glutathion (GSH) et la thiorédoxine ; ils catalysent la réduction des ponts disulfure, et contrôlent la plupart des processus cellulaires thiol-redox dépendant. Cependant, en dépit d'énormes connaissances portant sur leur enzymologie, peu est connu sur les caractéristiques physiologiques de ces systèmes chez les eucaryotes. Pour déterminer l'importance physiologique de ces systèmes et indiquer lequel est à la base de l'exigence du GSH pour la viabilité, nous avons effectué une analyse complète des cellules de levure épuisée ou contenant des niveaux toxiques de GSH. Les deux conditions déclenchent une réponse « iron-starvation-like » et une altération de l'activité des enzymes d’assemblage des centres fer-soufre (Iron sulfure cluster : ISC) extra-mitochondriales. Cependant, elles n’ont pas d'impact sur l’entretien thiol redox, à l’exception des niveaux élevés de glutathion qui ont altéré le repliement oxydatif des protéines dans le reticulum endoplasmique. Alors que le fer sauve partiellement la maturation des ISC et les défauts de croissance des cellules appauvries eh GSH, des expériences génétiques ont indiqué que, contrairement à la thiorédoxine, le glutathion ne peut pas assurer par lui-même les fonctions thiol-redox de la cellule. Nous proposons que le glutathion soit essentiel par son exigence dans l’assemblage des centres fer-soufre, mais ne serve comme backup que pour maintenir l’état thiol-redox de la cellule. Des niveaux physiologiques élevés de GSH sont ainsi destinés à isoler sa fonction dans le métabolisme du fer des variations de sa concentration pendant le stress redox, ce qui constitue un modèle contestant la vision traditionnelle du GSH comme acteur primordial du contrôle thiol-redox cytosolique.Nos données préliminaires sur la distribution de GSH dans les cellules recueillies par lasurveillance de l'état redox de rxYFP ciblée pour différents compartiments cellulaires (RE,Matrice, cytosol et IMS) dans les cellules HGT1 indiquent un transport spécifique du GSH vers le RE et l'exportation de GSSG de ce compartiment. Nous avons pu caractériser deuxtransporteurs ABC dont la suppression modifie le RE plus oxydant et entraîne une accumulation de GSSG par rapport aux cellules sauvages. Ces données ont été confirmées par le suivi de l'état redox de PDI1 et ERO1 (WT et hyper active). Elles suggèrent un rôle de ces transporteurs dans l'exportation du GSSG du la RE, et que le flux de GSH entre les différents compartiments est très régulé. / Cys residue oxidation is a widespread biochemical modification occurring in all eukaryotic cells compartments. It serves oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum (ER), protein import in the intermembrane space of mitochondria (IMS), and it has a regulatory role in the mitochondrial matrix and in the cytosol where it controls enzymes and signaling regulatory proteins activity. In all these processes, reversibility of Cys residue oxidation is a crucial feature. Two potent oxidoreductase systems, the glutathione (GSH) and thioredoxin pathways, catalyze disulfide bond reduction, and presumably control most thiol-redox-dependent cellular processes. However, despite tremendous knowledge of their enzymology, little is known about the physiological features of these systems in eukaryotes. To determine the physiologic importance of these functions and sort out which of them accounts for the GSH requirement for viability, we performed a comprehensive analysis of yeast cells depleted of or containing toxic levels of GSH. Both conditions triggered an intense iron-starvation-like response and impaired the activity of extra-mitochondrial ISC enzymes, but did not impact thiol-redox maintenance, except high glutathione levels that altered oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. While iron partially rescued the ISC maturation and growth defects of GSH-depleted cells, genetic experiments indicated that unlike thioredoxin, glutathione could not support by itself the thiolredox duties of the cell. We propose that glutathione is essential by its requirement in ISC assembly but only serves as a thioredoxin back up in cytosolic thiol-redox maintenance. Glutathione high physiologic levels are thus meant to insulate its function in iron metabolism from variations of its concentration during redox stresses, a model challenging the traditional view of it as prime actor in cytosolic thiol-redox control.Our preliminary data on the distribution of GSH inside cells collected by monitoring the redox state of rxYFP targeted to different cell compartments (ER, Matrix, Cytosol and IMS) in HGT1 cells indicate a specific transport of GSH into the ER and export of GSSG out of it. We were able to characterize two ABC transporters on which their deletion modify the redox state of the ER to more oxidizing and result in accumulation of higher GSSG content compared to WT. These data were confirmed by looking to the redox state of the PDI1 and ERO1 (WT and hyper active), all together suggest a role of these transporters in GSSG export from the ER, and that GSH flux between the different compartments is highly regulated.

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De nombreuses protéines possèdent des cofacteurs inorganiques contenant des métaux de transition. Les propriétés physico-chimiques de ces métaux permettent aux enzymes qui les portent de catalyser des réactions impossibles par l'utilisation des seules potentialités chimiques des vingt-deux acides aminés. Cependant, ces métaux sont toxiques pour la cellule lorsqu'ils sont libres. La synthèse et l'incorportion de ces cofacteurs dans les enzymes nécessitent alors des machineries protéiques complexes d'assemblage. Au cours de cette thèse, les mécanismes de synthèse des centres FeS par les machineries ISC (Iron-Sulfur Cluster) et Hyd (Hydrogenase) ont été étudiés. Le système ISC correspond à la machinerie primaire d'assemblage des centres FeS chez les bactéries, et un système équivalent existe chez les eucaryotes au niveau de la mitochondrie. Le système Hyd est la machinerie de maturation de l'hydrogénase à FeFe chez plusieurs eucaryotes inférieurs (algues et protistes) et dans une grande variété de bactéries. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la machinerie ISC d'Archaeoglobus fulgidus dont le coeur est composé de la cystéine désulfurase IscS et de la protéine échafaudage IscU ; IscS apportant le soufre nécessaire à l'assemblage du centre FeS sur IscU. Au cours de cette étude, il est apparu que IscS d'Archaeoglobus fulgidus ne possède pas d'activité cystéine désulfurase, mais qu'elle joue tout de même un rôle fondamental dans la synthèse du centre FeS sur le complexe IscSU en fournissant sa cystéine active en tant que ligand de l'agrégat. Dans un second temps, nous avons étudié la protéine à radical S-adénosyl-L-méthionine HydG, responsable de la synthèse des ligands CN- et CO du sous-agrégat à 2 Fe des hydrogénases à FeFe, qui était la seule maturase du système Hyd dont la structure n'était pas connue. Nos résultats structuraux et fonctionnels suggèrent que HydG synthétise successivement le ligand CN- dans un site actif basique, puis le ligand CO sur le cinquième Fe de son agrégat [5Fe-4S] C-terminal. Ce dernier pourrait être stabilisé par un ligand cystéine ou homocystéine. / Many proteins have inorganic cofactors containing transition metals. The physicochemical properties of these metals allow the enzymes, which carry them to catalyze reactions not possible when only using the chemical properties of the twenty-two amino acids. However, these metals are toxic to the cell when they are free. Consequently, the synthesis and incorporation of these cofactors into enzymes requires complex protein assembles. In this thesis, the FeS clusters synthesis mechanisms by the ISC (Iron-Sulfur Cluster) and Hyd (Hydrogenase) machineries were studied. The ISC system corresponds to the primary FeS clusters assembly machinery in bacteria, and a homologous system exists in mitochondria. The Hyd system is FeFe-hydrogenase active site maturation machinery found in several lower eukaryotes (algae and protists) and in a wide variety of bacteria. Initially, we studied the ISC machinery from Archaeoglobus fulgidus whose core is composed of the cysteine desulfurase IscS and the scaffold protein IscU; IscS delivers the sulfur needed for the FeS assembly to IscU. From this study we conclude that IscS from Archaeoglobus fulgidus has no cysteine desulfurase activity, but it still plays a fundamental role in FeS cluster synthesis by IscSU complex by providing a cysteine ligand to the nascent cluster. Secondly, we studied the radical S-adenosyl-L-methionine HydG, responsible for the synthesis of CN- and CO ligand of the active site [FeFe] subcluster, which was the only Hyd system maturase for which the structure was unknown. Our structural and functional results suggest that HydG successively synthesizes the CN- ligand at a basic site, and then the CO ligand at the unique fifth Fe ion of its C-terminal [5Fe-4S] cluster. The latter could be stabilized by either a cysteine or a homocysteine ligand.

Le développement d’une économie basée sur l’hydrogène implique l’utilisation de catalyseurs efficaces et peu chers. Pour cela on peut s’inspirer de la nature qui a produit des métalloenzymes, les hydrogénases. On considère que la maturation est réalisée en deux étapes. Dans un premier temps, les clusters [4Fe–4S] sont assemblés par les systèmes ISC/SUF. Puis trois maturases, HydE/F/G réalisent la biosynthèse du 2Fe sous-cluster pour synthétiser le cluster-H. Seules quelques hydrogénases à [FeFe] ont été caractérisées montrant une grande diversité alors qu’elles possèdent le même centre catalytique, le cluster-H. Ainsi, une partie de cette thèse a porté sur l’utilisation de la «maturation chimique» pour activer de nouvelles enzymes apo-HydA. L’hydrogénase provenant de Megasphaera elsdenii, et sa version tronquée, MeH-HydA, contenant seulement le domaine du cluster-H ont été étudiées grâce à cette technique. La stratégie mise en œuvre a été la reconstitution des cofacteurs métalliques par l’assemblage des clusters [4Fe–4S] et la maturation des enzymes par le complexe biomimétique [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2–. Les hybrides HydF synthétisés en incubant la protéine contenant le cluster [4Fe–4S] avec les complexes biomimétiques [Fe2(xdt)(CO)4(CN)2]2– possèdent un centre à 6 fers similaire au cluster-H. Cette grande similarité amène au dernier point traité dans cette thèse: la possible activité catalytique d’HydF en tant que «hydrogénase artificielle». Les hybrides de HydF ont été caractérisés et leur activité d’hydrogénase a été évaluée. De plus, une structure RX de la protéine contenant son cluster [4Fe-4S] a été obtenue. / There is a general agreement that the building of a sustainable H2 economy relies on the availability of cheap, abundant and efficient catalysts. Nature has provided attractive solutions, hydrogenases. However, these enzymes are difficult to produce and so far only few HydAs have been completely characterized showing diversity despite the same active site. This core, H-cluster, is composed of a [4Fe–4S] cluster bound via a Cys to a diiron complex which has 3 CO, 2 CN and an azadithiolate ligands. Recently, it has been showed that hydrogenases can be easily produced through the insertion of a biomimetic [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2– complex inside the heterologously produced apo-enzyme, resulting in a full activation. Part of the PhD has been focused on the chemical maturation of new HydA from Megasphaera elsdenii and its truncated version, MeH-HydA, containing only the H-cluster. The assembly of all metal cofactors via the chemical reconstitution of the [Fe–S] clusters and the maturation through the [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2–complex has been carried out. Interestingly, HydF hybrids synthesized incorporating biomimetic [Fe2(xdt)(CO)4(CN)2]2– complexes onto the [4Fe–4S] cluster HydF protein, have a 6Fe core reminiscent of the H-cluster. HydFs from different organisms were purified and subsequently the [4Fe–4S] cluster has been reconstituted. For the first time, an X-ray structure of HydF with its [4Fe-4S] cluster has been obtained. The 6Fe cluster of HydF has been also prepared chemically with diiron complexes mimicking the active site of HydA. The metallo-cofactors have been spectroscopically characterized (EPR, FTIR, HYSCORE), hydrogenase activities evaluated.