Dans cette thèse, nous présentons la détection électrochimique des herbicides, c'est-à-dire le paraquat et l'isoproturon dans des échantillons aqueux. Leur utilisation intensive est une source de contamination de l'environnement et leur toxicité constitue une menace pour la santé. La détection électrochimique est une technique prometteuse et avantageuse par rapport aux méthodes de détection conventionnelles en raison de ses propriétés telles que l'analyse rapide, la facilité d'utilisation, la rentabilité et la sensibilité élevée résultant de la modification de l'électrode de travail. Ici, nous avons modifié les électrodes modifiées avec des films minces de silice mésoporeuse pour agir comme capteurs d'herbicide. Ces électrodes ont été modifiées par un processus d'auto-assemblage assisté par électrochimie, un processus bien établi pour la modification des électrodes par notre groupe. Dans la première partie, l'adhérence du film de silice mésoporeux aux électrodes de carbone a été améliorée à l'aide d'une amine primaire qui a agi comme colle moléculaire pour une meilleure fixation de ces films à la surface des électrodes. Dans la partie suivante, ces électrodes modifiées ont été utilisées pour la détection électrochimique des herbicides susmentionnés. Les électrodes modifiées ont montré une sensibilité accrue et une limite de détection basse par rapport aux électrodes non modifiées. L'effet des différents paramètres de la solution ainsi que l'épaisseur du film et la géométrie de l'électrode ont également été étudiés et ont un impact critique sur la sensibilité du système / In this thesis, we present the electrochemical detection of herbicides i.e. paraquat and isoproturon in aqueous samples. These herbicides are used worldwide extensively for weed control in different crops. Their intensive use is a source of environmental contamination and their toxicity is a threat to Human health. Electrochemical sensing is a promising and advantageous technique as compared to conventional detection methods due to its properties such as rapid analysis, ease of operation, cost effectiveness and high sensitivity as a result of working electrode modification. Here, we modified electrodes modified with mesoporous silica thin films to act as herbicide sensors. These electrodes were modified by electrochemically assisted self-assembly process, a well-established process for electrode modification by our group. In the first part adhesion of mesoporous silica film at carbon electrodes was improved with the help of a primary amine which acted as molecular glue for better attachment of these films at electrodes surface. In the next part these modified electrodes were used for electrochemical detection of above stated herbicides. Modified electrodes showed enhanced sensitivity and low limit of detection as compared to unmodified ones. Effect of different solution parameters as well as film thickness and electrode geometry was also studied and found to have critical impact on sensitivity of the system

L’usage répété d’isoproturon (IPU) en agriculture pour contrôler développement de plantes adventices dans les cultures céréalières a non seulement abouti à la contamination du sol et des ressources en eaux mais également à l’adaptation de la microflore du sol à la dégradation accélérée de cet herbicide appartenant à la famille des phénylurées. A l’heure actuelle, les mécanismes microbiens impliqués dans cette adaptation ne sont pas encore parfaitement élucidés. Dans ce contexte, l’objectif de cette étude était d’explorer les processus et les facteurs impliqués dans la biodégradation de l’isoproturon, et ce, depuis l’échelle agricole de la parcelle jusqu’à celle des gènes codant cette fonction dans des populations microbienne dégradantes.L’étude réalisée à partir d’une parcelle expérimentale du domaine d’Epoisses, cultivée selon une rotation blé d’hiver/ orge / colza, a montré que, suite à l’usage répété d’IPU, la microflore du sol s’était adaptée à sa minéralisation. Des analyses réalisées à l’aide d’outils statistiques et géostatistiques ont révélé l’existence d’une variabilité spatiale de la minéralisation de l’IPU au sein de la parcelle agricole. Celle-ci s’est révélée être non seulement corrélée avec différents caractéristiques physicochimiques du sol (C/N, CEC, …) mais également avec le plan d’épandage des pesticides au cours de la rotation culturale.Afin de mieux étudier les mécanismes moléculaires responsables de la minéralisation de l’IPU, une culture bactérienne ainsi qu’une souche (Sphingomonas sp. SH) minéralisant l’IPU ont été isolées par enrichissement à partir de deux sols différents, tous deux adaptés à la biodégradation accélérée de l’IPU. La culture bactérienne et la souche pure ont toutes deux montré un métabolisme spécifique pour la dégradation de l’IPU, étant capables de dégrader l’IPU et ses principaux métabolites mais aucun des autres herbicides de la famille des phénylurées. La culture bactérienne et la souche présentaient une activité dégradante optimale à pH7,5 et étaient affectées par des pH inférieurs et supérieurs à cette valeur optimale. Sur la base des métabolites accumulés lors de la dégradation de l’IPU, nous avons proposé que l’IPU serait dégradé par deux déméthylations successives, suivi par la coupure de la chaine urée aboutissant à l’accumulation de 4-isopropylaniline, et finalement la minéralisation du cycle phényl.Afin d’identifier les gènes impliqués dans la minéralisation de l’IPU, une banque de clones BAC a été réalisée à partir de l’ADN génomique purifié de la culture bactérienne. Bien que le crible fonctionnel réalisé n’a pas permis d’identifier de BAC capable de dégrader l’IPU ou l’un de ses métabolites, un criblage moléculaire par PCR ciblant la séquence catA codant la catéchol 1,2-dioxygénase, nous a permis d’identifier trois BACs. Le pyroséquençage des ces 3 BACs et l’agrégation des séquences correspondantes ont permis d’identifier un fragment génomique de 33 kb présentant notamment l’opéron cat impliqué dans le clivage ortho du cycle phényl du catéchol. De ce fait nous avons émis l’hypothèse selon laquelle la 4-isopropylaniline formée lors de la dégradation de l’IPU pourrait être minéralisée par le clivage ortho du catéchol, un intermédiaire clef de la voie des beta-kétoadipates. Ceci nous a donc permis de proposer une voie métabolique pour la voie basse de la dégradation de l’IPU qui, jusqu’alors, n’avait pas encore été décrite. / Frequent use of phenylurea herbicide isoproturon (IPU) in agricultural fields has resulted not only in the contamination of the natural resources including soil and water but also in the adaptation of the soil microflora to its rapid degradation. However, up to now, the mechanisms underlying this microbial adaptation are not well elucidated. The aim of this study was to explore the processes and factors implicated in IPU degradation from the agricultural field to the genes coding for catabolic genes. The study carried out at the experimental field of Epoisses cropped with a winter wheat / barley / rape seed crop rotation indicated that as a result of its periodically repeated use, the soil microflora adapted to IPU mineralization activity. Further analysis using exploratory and geostatistical tools demonstrated the existence of spatial variability in IPU mineralization activity at the field scale which was correlated not only with several soil physico-chemical parameters like organic matter content, CEC and C/N ratio but also with the pesticide application plan over a three year crop rotation. In order to get further insight into underlying mechanisms, an IPU mineralizing bacterial culture and strain Sphingomonas sp. SH were isolated through enrichment cultures performed from two different adapted soils. Both had the catabolic activities highly specific for the mineralization of IPU and its metabolites but none of other structurally related phenylurea herbicides. IPU metabolic activity of both the mixed culture and the strain SH was found to be affected by pH with optimal activity taking place at pH 7.5. Based on the accumulation of different known metabolites during mineralization kinetics, IPU metabolic pathway was proposed to be initiated by two successive demethylations, followed by cleavage of the urea side chain resulting in the accumulation of 4-isopropylaniline, and ultimately the mineralization of the phenyl ring. In order to identify the genes involved in IPU degradation, BAC clone library was established from the genomic DNA of the bacterial culture. Although, the functional screening did not yield in identifying any BAC clone able to degrade IPU or its known metabolites, the PCR based screening led us to identify a cat gene cluster involved in ortho-cleavage of the phenyl ring of catechol through beta-ketoadipate pathway. Based on this finding, it was hypothesized that phenyl ring of 4-isopropylaniline formed during IPU transformation might be mineralized through ortho-cleavage of catechol. This finding allowed us to propose the lower IPU metabolic pathway which was not yet described.

L'objectif de ce travail est de comparer la rétention de deux herbicides, l'isoproturon et le diflufénicanil, et d'un métabilite de l'isoproturon l'isopropylaniline, pour trois occupations de sols contrastées: un sol cultivé, un sol souis bande enherbée et un sol forestier. Pour chaque sol, différentes fractions granulométriques ont été isolées. sur chaque sol et chaque fraction, la sorption et la desorption des trois molécules ont été caractérisées. La rétention des molécules est plus élevée dans les sols enherbés et boisés que dans les sols cultivés. Des différences significatives des coefficients Koc entre les horizons superficiels sous culture, parairies et forêt, suggèrent que le nature des matières organiques (MOS) est en cause dans les différences observées. Les matières organiques particulaires ont des capacités de rétention particulièrement élevées vis à vis des trois molécules étudiées. Les résultats montrent que l'aromaticité des MOS, leur caractère hydrophobe et leur surface spécifique sont les principaux paramètres régulant les capacités de sorption des pesticides étudiés.

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Frequent use of phenylurea herbicide isoproturon (IPU) in agricultural fields has resulted not only in the contamination of the natural resources including soil and water but also in the adaptation of the soil microflora to its rapid degradation. However, up to now, the mechanisms underlying this microbial adaptation are not well elucidated. The aim of this study was to explore the processes and factors implicated in IPU degradation from the agricultural field to the genes coding for catabolic genes. The study carried out at the experimental field of Epoisses cropped with a winter wheat / barley / rape seed crop rotation indicated that as a result of its periodically repeated use, the soil microflora adapted to IPU mineralization activity. Further analysis using exploratory and geostatistical tools demonstrated the existence of spatial variability in IPU mineralization activity at the field scale which was correlated not only with several soil physico-chemical parameters like organic matter content, CEC and C/N ratio but also with the pesticide application plan over a three year crop rotation. In order to get further insight into underlying mechanisms, an IPU mineralizing bacterial culture and strain Sphingomonas sp. SH were isolated through enrichment cultures performed from two different adapted soils. Both had the catabolic activities highly specific for the mineralization of IPU and its metabolites but none of other structurally related phenylurea herbicides. IPU metabolic activity of both the mixed culture and the strain SH was found to be affected by pH with optimal activity taking place at pH 7.5. Based on the accumulation of different known metabolites during mineralization kinetics, IPU metabolic pathway was proposed to be initiated by two successive demethylations, followed by cleavage of the urea side chain resulting in the accumulation of 4-isopropylaniline, and ultimately the mineralization of the phenyl ring. In order to identify the genes involved in IPU degradation, BAC clone library was established from the genomic DNA of the bacterial culture. Although, the functional screening did not yield in identifying any BAC clone able to degrade IPU or its known metabolites, the PCR based screening led us to identify a cat gene cluster involved in ortho-cleavage of the phenyl ring of catechol through beta-ketoadipate pathway. Based on this finding, it was hypothesized that phenyl ring of 4-isopropylaniline formed during IPU transformation might be mineralized through ortho-cleavage of catechol. This finding allowed us to propose the lower IPU metabolic pathway which was not yet described.

Biotests sind für die toxikologische Bewertung von Chemikalien, Pflanzenschutzmitteln und schadstoffbelasteten Gewässern oder Böden von besonderer Bedeutung, da sie Auskünfte über die biologische Wirksamkeit eines Stoffes auf Organismen geben. Bislang gibt es für die ökotoxikologische Bewertung, insbesondere von Chemikalien und Pflanzenschutzmitteln, für die autotrophe Organismenebene neben verschiedenen Biotests mit höheren Pflanzen den DIN 28 692 Biotest "Wachstumshemmtest mit den Süßwasseralgen Scenedesmus subspicatus und Selenastrum capricornutum", der auch als OECD 201 Biotest "Algal, Growth Inhibition Test" vorliegt. Dieser aquatische Biotest wird nur mit einer Süßwasseralgenart durchgeführt und trotzdem zunehmend für die Bewertung von belasteten Böden und Sedimenten eingesetzt. Untersuchungen über aquatische Biotests, die Bodenalgen als Testorganismen nutzen, oder Boden-Biotests mit Bodenalgen gibt es nur vereinzelt. Ein Biotestsystem, das sowohl aus einem aquatischen als auch aus einem terrestrischen Biotest besteht und mehrere Bodenalgenarten als Testorganismen nutzt, existiert bisher nicht. Dieses wurde in vorliegender Arbeit entwickelt und an dem Schwermetall Cadmium als Cadmiumchlorid und dem Herbizid Arelon, Wirkstoff Isoproturon erprobt. Um Bodenalgen, die keine Resistenzen oder Toleranzen gegenüber Schadstoffen aufweisen, als Testorganismen nutzen zu können, wurden aus unbelasteten Böden Algen isoliert, Klonkulturen erstellt und die Arten bestimmt. Dies führte zu einer Sammlung mit 35 Algenarten. Aus den in die Bodenalgensammlung aufgenommenen Arten wurden Xanthonema tribonematoides, Stichococcus bacillaris, Klebsormidium flaccidum, Xanthonema montanum und Chlamydomonas noctigama für das Testsystem ausgewählt. Zusätzlich zu diesen wurde die Süßwasseralge Scenedesmus subspicatus als Referenzalge ausgewählt. Mit diesen Algen wurde der Gel-Biotest, bestehend aus einem flüssigen gelartigen Medium, das die Kontaminationspfade im Wasser nachbildet, und ein Boden-Biotest mit einem naturnahen sorptionsschwachen Boden entwickelt, der die Kontaminationspfade über Gas-, Wasser- und Festphase im Boden nachbildet. Bei der Erprobung dieses Biotestsystems mit Cadmiumchlorid und Isoproturon zeigte sich, daß Bodenalgen gegenüber Cadmiumchlorid im Gel-Biotest eine geringe bis mittlere Sensibilität aufwiesen. Im Boden-Biotest lag eine sehr geringe Sensibilität vor, wie dies auch bei anderen Bodenorganismengruppen in Biotests festgestellt wurde. Dies kann mit der Sorption der Cadmiumionen im Boden erklärt werden und dem damit geringen für die Organismen bioverfügbaren Cadmiumionenanteil. Für Isoproturon lag sowohl im Gel- als auch im Boden-Biotest eine hohe Sensibilität der Bodenalgen vor. Erstaunlich war, daß die Sensibilität in beiden Biotests nahezu identisch war, obwohl Isoproturon in sorptionsschwachen Böden zu ca. 30 % adsorbiert wird. Im Vergleich zur Sensibilität von Scenedesmus subspicatus waren die Bodenalgen bei Cadmiumchlorid bis auf zwei Ausnahmen um den Faktor 5 bis 10 unsensibler. Die Bodenalge Klebsormidium flaccidum besaß eine vergleichbare Sensibilität und Xanthonema montanum war um den Faktor 20 unsensibler. Für Isoproturon konnten keine Unterschiede in der Sensibilität zwischen Scenedesmus subspicatus und den geprüften Bodenalgen ermittelt werden, außer bei Stichococcus bacillaris, die um den Faktor 5 unempfindlicher war. Das entwickelte miniaturisierte Biotestsystem eignet sich dazu, differenzierte Aussagen über das ökotoxische Potential von Stoffen auf Bodenalgen und der Süßwasseralge Scenedesmus subspicatus zu erhalten. Durch den Einsatz von zwei unterschiedlichen Testsubstraten (Flüssigmedium und naturnaher Boden) werden der Einfluß dieser Substrate sowie die daraus resultierenden Kontaminationspfade der Teststoffe und ihre ökotoxikologische Wirkung auf Algen feststellbar und vergleichbar. Ein Normenentwurf des Biotestsystems wurde inzwischen in das "Technical Committee 190 - Soil Quality" der International Standards Organization (ISO) eingereicht. / Biotests are an important device to assess the toxicity of chemicals, pesticides, polluted water, and soils because they can provide direct information about the influence of a compound on the organism level. Besides various biotests using higher plants there is only the DIN 28 692 biotest "Growth-inhibition test using fresh water algae Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum" (DIN 28 692) also known as the OECD 201 biotest "Algal, Growth Inhibition Test" which is currently available for an ecotoxicological assessment of chemicals such as pesticides on the autotrophic organism level. This aquatic biotest is based on a single specie of fresh water algae and is increasingly applied to evaluate polluted soils and sediments. There is almost no information on aquatic biotests which are using soil algae as test organisms instead. A more comprehensive biotest system which actually combines aquatic and terrestric biotests using several soil algae species as test organisms has not been reported, yet. Thus, a biotest system was developed and subsequently evaluated by using cadmium (cadmium chloride) as a heavy metal, and the herbicide arelon containing isoproturon as the active ingredient. Soil algae were isolated from unpolluted soil in order to obtain test organisms which are not resistant or tolerant to pollutants. The algae isolates were then cultivated, and subsequently identified. A total of 35 algae species was collected. Algae species used in the biotest system were Xanthonema tribonematoides, Stichococcus bacillaris, Klebsormidium flaccidum, Xanthonema montanum, Chlamydomonas noctigama. In addition, the fresh water specie Scenedesmus subspicatus served as a reference algae. Based on these different algae species a gel biotest using liquid gel medium was developed to investigate the contamination path via water, and also a soil biotest with a pre-treated soil of low sorption capacity was deviced to simulate the contamination path through gas, water, and solid phase. The evaluation of the biotest system using cadmium chloride and isoproturon did reveal that soil algae have had only low to medium sensitivity to cadmium chloride in the gel biotest. Algae sensitivity in the soil biotest was very low which was in accordance with data from other biotests using different soil organisms. The weak response of the algae was most likely caused by the sorption of the cadmium ions to the soil matrix what may have decreased the bioavailability of cadmium. In comparison, soil algae were very sensitive to isoproturon in both, the gel biotest and the soil biotest. Both biotests indicated almost identical sensitivities of the tested soil algae which was surprising since 30 % of the isoproturon was sorbed even in soils with a low sorption capacity. Soil algae when compared to the water algae Scenedesmus subspicatus were generally 5 to 10-fold less sensitive to cadmium chloride. Only Klebsormidium flaccidum has proved to have a similar sensitivity as Scenedesmus subspicatus had, whereas Xanthonema montanum was about 20-fold less sensitive. With isoproturon, however, no differences in sensitivity could be seen between Scenedesmus subspicatus and the tested soil algae, except Stichococcus bacillaris which was about 5-fold less sensitive. The biotest system as developed in this study has shown to be suitable for obtaining valuable information about ecotoxicological effects of chemicals on soil and water algae. Since the biotest system consists of two different test media (liquid gel and soil) it is possible to determine ecotoxicological effects on algae in both, water and soil. A first draft of the developed biotest system has been submitted to the "Technical Committee 190 - Soil Quality" of the International Standards Organization (ISO) for review.