II existe de nombreuses études mettant en relation le vieillissement et le stress oxydant, mais peu d'entre elles ont caractérisé l'évolution des marqueurs des défenses antioxydantes, notamment au niveau cutané, au cours du vieillissement dit extrinsèque ou environnemental.Nous avons cherché à mimer in vitro le vieillissement extrinsèque cutané, à partir d'un modèle de cellules épidermiques en culture, la lignée de kératinocytes humains HaCaT, soumises à un stress chimique, l'exposition au glyphosate, un principe actif entrant dans la composition de nombreuses formulations pesticides. Ainsi, nous avons exploré notre modèle par une approche multi-échelle originale et innovante: tout d'abord, à l'échelle moléculaire, par une étude protéomique quantitative différentielle des taux d'expression protéique intracytosolique suite à l'induction du stress ; puis, à l'échelle cellulaire en cytomètrie en flux, par la caractérisation fonctionnelle du stress oxydant et de la mort cellulaire qui en découle ; enfin, à l'échelle micro- et nanométrique, en microscopie confocale et à force atomique, par le suivi de l'évolution des propriétés morphologiques et viscoélastiques des kératinocytes stressés.Ce travail de thèse a démontré que le glyphosate altérait signifïcativement l'état et la fonction barrière de l'épiderme humain, ciblant notamment les kératinocytes, dont l'équipement moléculaire et les fonctions vitales d'adhérence et de dynamique membranaire se retrouvent fondamentalement dégradées. L'ensemble de ces résultats constitue un « tableau » qui évoque parfaitement les événements, les signaux et les comportements cellulaires s'installant au cours du vieillissement cutané. / Numerous studies relate ageing to oxidative stress. Few of them described thé évolution of markers of antioxidant défenses, in particular at thé cutaneous level, during extrinsic or environmental ageing. We tried to mimic in vitro cutaneous extrinsic ageing, with a model of epidermic cells in culture, thé human kératinocytes cell line HaCaT, subjected to a chemical stress, Glyphosate, an active ingrédient présent in thé composition of numerous pesticide formulations. Indeed, we examined thé effects of induced ageing in thé loss of kératinocytes integrity in culture, by an original and innovative multi-scale approach: Firstly, at thé molecular scale, we assessed thé stress induced modifications of intracytosolic protein expression by a differential quantitative proteomic study; then, at thé .cellular scale, with flow cytometry, by thé functional characterization of thé oxidative stress and resulting cell death; fmally, at thé micro- and nanoscale, with confocal and atomic force microscopy by thé following thé évolution of morphological and viscoelastic properties of stressed kératinocytes. This PhD work demonstrated that glyphosate impaired thé state and thé barrier function of thé human skin, in particular by fundamentally impairing kératinocytes through thé molecular equipment, thé vital adhésion fonctions and membrane dynamics. Ail thèse results give us a global image of events, signais and cell behavior occurring in skin aging.

Nous avons étudié le rôle de l'immunité innée de la peau lors de la transmission des Borrelia (agent infectieux de la borréliose de Lyme) par son vecteur, une tique dure du genre Ixodes. Nous avons montré que la salive de tique et la protéine salivaire Salp15 inhibent la réaction inflammatoire (production de chimiokines et de peptides antimicrobiens) des kératinocytes induite par Borrelia. Cet effet anti- " alarmine " de la salive de tique contribue probablement à créer un environnement cutané local favorable à la transmission de Borrelia. Nous avons montré que Borrelia induit également au niveau des fibroblastes cutanés la transcription de nombreux gènes proinflammatoires. Nous avons observé un effet toxique direct de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés : cet effet dose-dépendant est de nature protéique mais non lié à la protéine Salp15. Ces résultats indiquent que les fibroblastes jouent un rôle important dans l'inflammation cutanée induite par Borrelia.

Nous avons étudié le rôle de l'immunité innée de la peau lors de la transmission des Borrelia (agent infectieux de la borréliose de Lyme) par son vecteur, une tique dure du genre Ixodes. Nous avons montré que la salive de tique et la protéine salivaire Salp15 inhibent la réaction inflammatoire (production de chimiokines et de peptides antimicrobiens) des kératinocytes induite par Borrelia. Cet effet anti- « alarmine » de la salive de tique contribue probablement à créer un environnement cutané local favorable à la transmission de Borrelia. Nous avons montré que Borrelia induit également au niveau des fibroblastes cutanés la transcription de nombreux gènes proinflammatoires. Nous avons observé un effet toxique direct de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés : cet effet dose-dépendant est de nature protéique mais non lié à la protéine Salp15. Ces résultats indiquent que les fibroblastes jouent un rôle important dans l’inflammation cutanée induite par Borrelia. / We studied the role of the skin innate immunity during the transmission of Borrelia (the infectious agent of Lyme borreliosis) by its vector, a hard tick belonging to the genus Ixodes. We showed that tick saliva and its protein Salp15 both inhibate Borrelia-induced inflammatory reaction of keratinocytes. The antialarmin effect of tick saliva ensure a favorable environment for Borrelia. We also showed that Borrelia induce a strong inflammatory response in dermal fibroblasts. We also demonstrate a dose-dependent lytic effect of tick salivary gland extracts on dermal fibroblasts and that this cytotoxic effect was of proteinaceous nature and not related to Salp15. These results indicate that dermal fibroblasts could be considered as central mediators in immune cell recruitment to the skin site of Borrelia invasion.

La cicatrisation parodontale est un processus complexe, composé de quatre phases hautement intégrées (hémostase, inflammation, prolifération, remodelage), qui nécessite une interaction complexe entre les différents types tissulaires (épithélium, conjonctif, os) ainsi que la synthèse de médiateurs, tels que les hormones et les facteurs de croissance. La difficulté à pouvoir obtenir une régénération des tissus parodontaux est en partie due à la réponse inflammatoire qui interfère avec le processus de cicatrisation, via la surexpression des cytokines pro-inflammatoires, ainsi qu’à la croissance rapide des cellules épithéliales le long de la surface de la racine qui porte atteinte à la vraie organisation des tissus, essentielle à la régénération parodontale. Notre objectif a été de mettre au point des membranes nanofibreuses implantables à base de polycaprolactone (PCL) fonctionnalisés par plusieurs molécules actives (Alpha-Melanocyte Stimulating Hormone (α-MSH)), ibuprofène, atorvastatine) et implantables, permettant à la fois un contrôle physique et biochimique de la cicatrisation parodontale. En d’autres termes, nous avons cherché à ralentir la colonisation de la surface radiculaire par les cellules épithéliales et à moduler l’inflammation de la phase post-chirurgicale afin de promouvoir la cicatrisation parodontale. Pour cela, nous avons mis au point un modèle d’inflammation in vitro mimant le tissu superficiel du parodonte en utilisant des cellules parodontales, à savoir des kératinocytes et fibroblastes gingivaux humains, stimulées par du lipopolysaccharide de Porphyromonas gingivalis (LPS-Pg). Les résultats obtenus ont montré une bonne biocompatibilité des systèmes (α-MSH, ibuprofène) ainsi qu’une diminution de la prolifération, migration des kératinocytes, fibroblastes gingivaux humains et une diminution significative de l’expression des marqueurs pro- ou anti-inflammatoires (TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-8), des marqueurs d’adhérence, de prolifération (Intégrine, Laminine, Fibronectine) et de remodelage (COL-IV). En conclusion, les stratégies développées (α-MSH, ibuprofène) au sein de notre laboratoire ont permis de mettre en évidence l’intérêt de délivrer une molécule anti-inflammatoire à partir d’un biomatériau et représentent un fort potentiel d’application clinique pour la parodontologie mais aussi pour la médecine de demain. / Periodontal wound healing is a process involving hemostasis, inflammatory phase, proliferation and maturation/matrix remodeling. These phases require cell-to-cell interaction of different cell types (epithelial cells, fibroblasts, osteoblasts, and cementoblasts) orchestrated by growth factors, cytokines and extracellular matrix components. After conventional periodontal therapy, wound healing corresponds more to tissue reparation than regeneration. This absence of true regeneration is considered to be mainly due to the competition between the different periodontal tissues (gingiva, cementum, alveolar bone) and the differential rate of proliferation, migration and differentiation of periodontal cells during wound healing. Therefore, the inflammatory response could interfere with the healing process depending on the secretion/activity level of matrix metalloproteinase (MMPs), cytokines, chemokines and also the imbalance with their antagonists/inhibitors, which leads to fibrosis and excessive scarring. Our aim was to develop implantable nano-fibrous membranes based on polycaprolactone (PCL) and functionalized by several active molecules (Alpha-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)), ibuprofen, atorvastatin) allowing both physical control and biochemical periodontal healing features. Furthermore, we developed an in vitro inflammatory model mimicking the periodontal tissue surface, using periodontal cells ; keratinocytes and human gingival fibroblasts stimulated with lipopolysaccharide of Porphyromonas gingivalis (Pg-LPS). The results obtained showed good biocompatibility systems (α-MSH, ibuprofen) and a decrease in the proliferation and migration of keratinocytes, human gingival fibroblasts. Moreover, a significant decrease of pro- or anti-inflammatory markers expression (TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-8), adhesion markers of proliferation (Integrin, laminin, fibronectin) and remodeling (COL-IV) could be achieved. In conclusion, the strategies developed in our laboratory (α-MSH, ibuprofen), have helped to highlight the interest of the release of an anti-inflammatory molecule from a biomaterial, and represented a strong potential for clinical application not only in periodontics but also in general medicine.

II existe de nombreuses études mettant en relation le vieillissement et le stress oxydant, mais peu d'entre elles ont caractérisé l'évolution des marqueurs des défenses antioxydantes, notamment au niveau cutané, au cours du vieillissement dit extrinsèque ou environnemental.Nous avons cherché à mimer in vitro le vieillissement extrinsèque cutané, à partir d'un modèle de cellules épidermiques en culture, la lignée de kératinocytes humains HaCaT, soumises à un stress chimique, l'exposition au glyphosate, un principe actif entrant dans la composition de nombreuses formulations pesticides. Ainsi, nous avons exploré notre modèle par une approche multi-échelle originale et innovante: tout d'abord, à l'échelle moléculaire, par une étude protéomique quantitative différentielle des taux d'expression protéique intracytosolique suite à l'induction du stress ; puis, à l'échelle cellulaire en cytomètrie en flux, par la caractérisation fonctionnelle du stress oxydant et de la mort cellulaire qui en découle ; enfin, à l'échelle micro- et nanométrique, en microscopie confocale et à force atomique, par le suivi de l'évolution des propriétés morphologiques et viscoélastiques des kératinocytes stressés.Ce travail de thèse a démontré que le glyphosate altérait signifïcativement l'état et la fonction barrière de l'épiderme humain, ciblant notamment les kératinocytes, dont l'équipement moléculaire et les fonctions vitales d'adhérence et de dynamique membranaire se retrouvent fondamentalement dégradées. L'ensemble de ces résultats constitue un « tableau » qui évoque parfaitement les événements, les signaux et les comportements cellulaires s'installant au cours du vieillissement cutané. / Numerous studies relate ageing to oxidative stress. Few of them described thé évolution of markers of antioxidant défenses, in particular at thé cutaneous level, during extrinsic or environmental ageing. We tried to mimic in vitro cutaneous extrinsic ageing, with a model of epidermic cells in culture, thé human kératinocytes cell line HaCaT, subjected to a chemical stress, Glyphosate, an active ingrédient présent in thé composition of numerous pesticide formulations. Indeed, we examined thé effects of induced ageing in thé loss of kératinocytes integrity in culture, by an original and innovative multi-scale approach: Firstly, at thé molecular scale, we assessed thé stress induced modifications of intracytosolic protein expression by a differential quantitative proteomic study; then, at thé .cellular scale, with flow cytometry, by thé functional characterization of thé oxidative stress and resulting cell death; fmally, at thé micro- and nanoscale, with confocal and atomic force microscopy by thé following thé évolution of morphological and viscoelastic properties of stressed kératinocytes. This PhD work demonstrated that glyphosate impaired thé state and thé barrier function of thé human skin, in particular by fundamentally impairing kératinocytes through thé molecular equipment, thé vital adhésion fonctions and membrane dynamics. Ail thèse results give us a global image of events, signais and cell behavior occurring in skin aging.

Les épithéliums muqueux se présentent comme porte d’entrée majeure du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et jouent un rôle critique dans la transmission sexuelle du virus. Les cellules épithéliales et les cellules dendritiques dans les muqueuses pluristratifiés, sont des cibles initiales pour la transmission virale. Il a été déjà montré, sur les muqueuses génitales chez l’homme, que la circoncision réduit plus de 60% acquisition du virus chez l’homme. Les mécanismes d’entrée du VIH au niveau du tractus génital chez l’homme sont tres mal connus et pratiquement pas étudiés. Nous avons émis l’hypothèse selon laquelle le prépuce, qui est enlevé lors de la circoncision, pourrait être une porte d’entrée majeure du virus. Nous avons d’abord montré que le VIH peut pénétrer effectivement au niveau du prépuce ex vivo, la partie interne du prépuce présente plus permissive que la partie externe. De plus, le virus pénètre uniquement dans le prépuce après formation d’une synapse virologique entre la cellule infectée, présente dans les secrétions génitales et la surface muqueuse du prépuce. La formation de la synapse virologique induit le bourgeonnement massif et polarisé de virions dans la fente synaptique; ceux ci pénètrent dans l’épiderme du prépuce. À l’inverse, l’entrée du VIH sous forme de virus libre dans le prépuce est inefficace. Nous avons ensuite caractérisé la séquence des événements initiaux mis en place lors de l’entrée du VIH dans le prépuce interne. La première cellule cible immune est la cellule de Langerhans (LCs), dont le rôle physiologique est de protéger la muqueuse contre les pathogènes qui l’envahissent. Après la capture du virus les LCs migrent vers le derme pour former des conjugués cellulaires avec les cellules T CD4+ du derme. La dynamique de migration de LCs est régulée par de sécrétion de cytokines et chimiokines (RANTEs et MIP- 3alpha) induites par la pénétration du virus dans le tissu. Nous avons ensuite caractérisé les mécanismes de l’immunité mis en jeu au niveau des kératinocytes de l’épiderme lors de la formation de la synapse virologique et évalué comment ces signaux contribuent à l’entrée efficace du virus dans la muqueuse du prépuce interne chez l’homme, ex vivo. À l’aide d’un modèle cellulaire de muqueuse simplifiée basé sur des kératinocytes primaires humains ex vivo, nous avons montré que les protéines d’enveloppe du VIH , gp120 mais pas gp41, et les molécules d’adhésion (intégrines LFA-1, leurs ligands ICAM-1 and -3) contrôlent la formation de la synapse virologique. La synapse virologique induit au niveau des kératinocytes l’activation de la voie NF- B indépendentmmment de MyD88 après activation du Toll-like-receptor 4 (TLR4) exprimé par les kératinocytes. En recherchant quelle cytokine pouvait être induite par cette signalisation, nous avons montré que la synapse virologique induit la sécrétion par les kératinocytes d’une cytokine produite par les cellules non-hématopoïétiques, la thymic stromal lymphopoietin (TSLP). La TSLP est un chemoattracteur des cellules myéloïdes comme les cellules LCs et peut induire leur maturation. Nous avons ensuite montré que, sur des explants de prépuce humain ex vivo, la synapse virologique induit bien la sécrétion de TSLP, laquelle en premier lieu attire les LCs qui expriment le TSLP-récepteur vers la surface du tissus induisant leur maturation. Les LCs peuvent ensuite migrer dans l’autre sens vers le derme. La sécrétion des cytokines comme RANTEs, MIP-3alpha, qui sont impliquées lors de la pénétration effective du virus dans les tissus n’a pas de rôle dans la signalisation induite par la formation de la synapse virologique proprement dite. Les kératinocytes de l’épiderme du prépuce interne, grâce à leur réponse innée TSLP induite par la synapse virologique ont un rôle déterminant dans l’entrée du VIH dans le prépuce. Ainsi, en réponse de la synapse virologique, les kératinocytes secrètent du TSLP après activation de la voie de NF- B dépendante de MyD88. (...) / The mucosal epitheliums are presented as a major portal of HIV-1, and play a critcal role for the sexual transmission of HIV-1. Epithelial cells, and dendritic cells in the pluristratified mucosa, are the initial targets of viral transmission. It has already been shown, in the genital mucosa in men, circumcision reduces by more than 60 % of virus acqusition by men. The entry mechanisms of HIV-1 in the male urogenital tracts are poorly understood and not pratically studied. We suggested that foreskin, removal by circumcision surgery, could be a major portal of HIV-1 entry. We first showed that HIV-1 could enter efficiently ex vivo inner foreskin mucosa, the inner part of foreskin which is more permissive than the outer part. More over, virus penetrates only after the viral synapse (VS) formation between HIV-1-infected cells and foreskin epidermis, in the presence of genital secretion on the surface of foreskin mucosa. The formation of VS induces massive and polarized budding of HIV-1 particles within the synaptic cleft. The virions therefore penetrate into the foreskin epidermis. Inversely, cell-free virus entry is inefficient in the foreskin. Next, we characterized the initial events of HIV-1 VS formation in the inner foreskin. The first cell type that HIV-1 encounters is Langerhans cells (LCs), whose physiological role is to protect the mucosa against invasive pathogens. After capture of virus, LC migrates towards the dermis to form intercellular conjugates with dermal CD4+ T cells. The dynamic of LC migraiton is regulated by the secretion of cytokines in the mucosa, induced by HIV-1 entry, including RANTEs and MIP-3alpha. We then characterized the mechanisms of foreskin epidermal keratinocyte (KC), activated innate immunity during the VS formation and the signaling pathway contributed to the efficient entry of HIV-1 via inner foreskin mucosa. Using a simplified mucosal model based on human primary foreskin keratinocytes, we demonstrated that HIV-1 envelope protein, gp120, but not gp41 and the adhesion molecules (integrins LFA-1, ICAM-1/-3), contribute to the VS formation. VS induces at the KC level the activation of NF- B pathway by I B and p65 molecules, after activation of TLR4 expressed on KCs. By searching for which cytokine could be induced by this signalisation, we then showed that VS induced the secretion by KC of one cytokine, which is produced by the non-hematopoetic cells, thymic stromal lymphopoietin (TSLP). TSLP is an chemoattractant for myeloid cells like LCs, and could induce LC maturation. We then showed, using the foreskin explants that, VS induces the secretion of TSLP, which first attracts LC expressing constitutively TSLP receptors to the apical surface of foreskin, inducing its maturation. These matured LCs then migrate to another direction towards the dermis. The secretion of cytokines such as RANTEs and MIP-3alpha, involved in the HIV-1 efficient entry has no roles in the signaling induced by VS formation as mentioned above. The Inner foreskin keratinocytes, due to the innate response of TSLP induced by VS, have a determinant role in the HIV-1 entry into the foreskin. Likewise, in response to VS, KCs secrete TSLP after NF- B activation dependent on regulator MyD88. The secreted TSLP, in addition to four different proinflammatory cytokines and chemokines (IL-6, IL-8, MIG, and MMP-9) allows virus to attract LCs to the foreskin surface, to capture the virus present in the synaptic cleft in order to facilite efficient transmission at the level of foreskin mucosa. Likely to the conventional immune cells, KCs, in one hand protects the foreskin mucosa and in another, is hijacked to facilitate HIV-1 transmission.