Le photo-vieillissement cutané est en partie dû aux effets néfastes des rayonnements UV qui induisent un stress oxydant. Celui-ci joue un rôle promoteur dans l’installation d’un statut micro-inflammatoire lié à la production de médiateurs tels que des cytokines pro-inflammatoires, des métalloprotéinases de la matrice extracellulaire (MMPs) et des prostaglandines E2. Mes travaux ont été effectués sur le kératinocyte, cellule majeure de l’épiderme et acteur du processus de vieillissement cutané. Dans une première partie, nous décrivons différentes expériences menées pour évaluer l’association de plusieurs molécules anti-oxydantes connues afin d’en potentialiser l’activité. Cette étude a mis en évidence que dans certains cas, un effet pro-oxydant pouvait être observé. Dans une seconde partie, grâce à un système de multiplexing, nous avons pu identifier 39 cytokines et 4 MMPs sécrétées par les kératinocytes suites à une irradiation par des UVB. Nous avons également pu mettre en évidence une différence entre donneurs jeunes et âgés, avec une augmentation des cytokines pro-inflammatoires et une diminution des cytokines anti-inflammatoires pour ces derniers. Dans une dernière partie, l’activité d’un extrait de fleurs de Butea monosperma a été étudiée. L’extrait présente une activité anti-oxydante en piégeant les EORs intracellulaires, anti-inflammatoire en diminuant la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (IL-1; IL-6 et IL-8) et protectrice du derme en inhibant la production de MMP-1 ; 2 ; 9 et 10. Cette étude multifactorielle a permis d’expliquer les utilisations traditionnelles de cette plante comme anti-inflammatoire. En conclusion, afin de comprendre et de limiter les effets des radiations UVB sur le vieillissement cutané, il est nécessaire d’avoir une approche multifactorielle. Comme nous l’avons observé, le stress oxydant n’est pas le seul responsable du statut micro-inflammatoire cutané mais en est le promoteur. Il faut donc agir en amont en limitant la production d’EORs et en aval en contrôlant la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et de MMPs. / Early signs of skin aging are related amongst others by UV irradiation that induces an oxidative stress. This one is associated with a skin micro-inflammatory status which is the consequence of mediator productions as pro-inflammatory cytokines, matrix metalloproteinases (MMPs) and prostaglandin E2. Studies reported in this thesis were mainly conducted with human keratinocyte, one of the cells involved in the skin aging process. In a first part, we describe various experiments led to evaluate the association of several antioxydant molecules in the aim to increase their activities. This study has shown that in certain cases, a pro-oxidizing effect could be observed. In a second part, through a multiplexing system, we have identified 39 cytokines and 4 extracellular MMPs that are secreted upon UVB irradiation. We have also found a difference between the cytokines secreted by keratinocytes from young and old donors; the latter has an increase of pro-inflammatory cytokines and a decrease in anti-inflammatory cytokines. Finally, in a last part, an extract of flowers of Butea monosperma has been studied. The extract present an anti-oxidant activity by scavenging intracellular ROS, an anti-inflammatory effect by reducing the secretion of pro-inflammatory cytokines (IL-1 , IL-6 and IL-8) and a protective effect of the dermis by inhibiting the production of extracellular MMP-1, 2, 9 and 10. These results explain the strong protective anti-inflammatory activity of this plant which is widely used. In conclusion, in order to understand and limit the impact UVB radiations on skin aging, it is necessary to have a multifactorial approach. As we have observed, oxidative stress is not solely responsible for the micro-inflammatory status associated with photo-aging, but is the proponent. We must act upstream by limiting production of ROS and downstream by controlling the secretion of pro-inflammatory cytokines and MMPs.

Les brûlures cutanées graves dont les lésions profondes et étendues des tissus ne permettent pas d’envisager un traitement classique par autogreffes, bénéficient aujourd’hui de substituts épidermiques autologues pour leur recouvrement. En effet l’ingénierie tissulaire permet l’obtention d’épiderme de culture autologue (CEA) par l’amplification in vitro de kératinocytes à partir d’une petite biopsie de peau saine. Si ces CEAs ont permis la survie de nombreux patients depuis les années 1980, ils n’en restent pas moins largement perfectibles du point de vue de l’esthétique et de la fonctionnalité de l’épiderme et de la jonction dermo-épidermique régénérés mais aussi en termes de coûts et de prévention des zoonoses.Ainsi, ce travail de thèse s’inscrit dans le cadre d’une recherche translationnelle et porte sur l’élaboration d’un épiderme de culture par ingénierie tissulaire en vue d’une application clinique chez les grands brûlés, afin de favoriser la cicatrisation et la régénération épidermique. Ce travail porte également sur l’évaluation non clinique de notre substitut épidermique sur un modèle animal de brûlure cutanée.Après avoir développé un nouveau substitut épidermique sur fibrine de plasma humain (hPBES : human Plasma-Based Epidermal Substitute), nous avons procédé à l’évaluation détaillée de ses caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles en comparaison au substitut épidermique de référence Epicel® (Genzyme, US). Nous avons montré des propriétés plus intéressantes en termes de clonogénicité et de caractère souche, de prévention de la différenciation, de prolifération, de potentiel de migration, et de conservation des protéines de la membrane basale avec notre produit par rapport à Epicel®.L’apport de la matrice de fibrine de plasma sur la culture des kératinocytes en comparaison à une matrice de fibrine issue de fibrinogène purifié et à une culture sans matrice a été étudié notamment sous l’angle des facteurs libérés par les matrices. Nous avons observé une amélioration des propriétés des substituts épidermiques par la fibrine : diminution de la différenciation terminale, augmentation du potentiel migratoire et sécrétion de facteurs pro-cicatrisants (GM-CSF et PDGF-BB). En outre, la fibrine de plasma améliore spécifiquement la morphogénèse épidermique, la prolifération kératinocytaire et la clonogénicité.Le procédé de culture de ce nouveau substitut a été adapté aux exigences réglementaires sans altération du potentiel régénératif: remplacement des cellules nourricières murines par des fibroblastes dermiques humains, adaptation du milieu de culture et sécurisation du plasma par traitement à l’amotosalen.Toutes les étapes d’un modèle de brûlure chez le rat nude reproduisant la technique chirurgicale employée pour la greffe de CEA ont été mises au point, mais un rejet du greffon épidermique n’a pas permis l’évaluation d’hPBES sur ce modèle. Nous avons donc évalué le substitut épidermique développé hPBES chez la souris NOD-SCID après greffe au fascia et mis en évidence une bonne prise de greffe épidermique permettant la régénération d’un épiderme humain aux caractéristiques proches d’une peau saine avec une réorganisation de la jonction dermo-épidermique des 2 semaines après greffe. / The deep and large injuries caused by massive burns prevent the use of split-thickness skin autografts. Today, autologous epidermal substitutes constitute an alternative treatment for skin regeneration. In fact tissue engineering allows the production of Cultured Epithelial Autografts (CEA) by in vitro keratinocyte amplification from a small healthy skin biopsy. The clinical use of CEA since the 1980’s has allowed an increase in the survival rate of burnt patients. However, CEAs present numerous drawbacks, among them the high fragility of keratinocyte sheets, and the immaturity of the dermal-epidermal junction leading to heavy cosmetic and functional sequelae.This thesis focuses on the bioengineering of epidermal substitute for clinical burn treatment to enhance wound healing and skin regeneration, from a translational research point of view. This work also includes the development of an animal model of third degree burn for the evaluation of epidermal substitute.We first developed a new epidermal substitute cultured on a fibrin matrix from human plasma (hPBES: human Plasma-Based Epidermal Substitute). Then we characterized this new substitute with phenotypical and functional analyses, using as a reference the epidermal substitute Epicel® (Genzyme, US). We observed properties more favorable with hPBES than with Epicel® in terms of clonogenicity, stemness, differentiation level, proliferation, migration potential and basement membrane protein conservation.The influence of the plasma-based fibrin matrix on keratinocytes was studied in comparison with a culture on a fibrin from purified fibrinogen, and with a culture with no matrix. For this study we focused our analysis on the role of the released factors from fibrin matrices during epidermal substitute culture. Both fibrin matrices improved epidermal substitute properties: reduction of terminal differentiation, enhancement of migration potential, secretion of wound healing enhancing factors. Besides, plasma-based fibrin specifically promote epidermal morphogenesis, keratinocyte proliferation and clonogenicity.The culture process was adapted to European regulation requirements without diminishing its regenerative potential: substitution of murine feeder cells by human dermal fibroblasts, adaptation of culture medium and plasma viral inactivation using amotosalen treatment.A burn model including all the surgical steps used in clinics for CEA grating was developed on nude rats. However the evaluation of hPBES on this model could not be achieved due to graft rejection. Therefore we evaluated epidermal regeneration after hPBES graft on acute wounds on NOD-SCID mice. We showed a good graft rate, with the regeneration of a human epidermis close to healthy epidermis with a well-organized dermal-epidermal junction two weeks after hPBES grafting.

Dans la première partie de ma thèse, nous avons étudié le rôle de la TSLP, une cytokine produite par les kératinocytes, dans la mélanogenèse. Nous avons montré que l'expression de TSLP était induite dans l'épiderme de la peau atteinte de mélanome chez la souris et l'humain. Notre resulats indiquent que la TSLP murine joue un rôle dans la croissance de la tumeur et que ce rôle s'exerçait via les cellules immunitaires. Nos résultats suggèrent l'existence d'un dialogue entre les cellules du mélanome, les kératinocytes et les cellules immunitaires jouant un rôle important dans la croissance et la métastase du mélanome. Dans la seconde partie, nous avons exploré les cytokines produites dans le contexte de la dermatite atopique et leur rôle dans l'initiation de l'asthme. Nous avons trouvé que TSLP est différemment impliquée dans la sensibilisation allergique épicutanée et dermocutanée, et nous avons identifiée l'IL-1β comme un acteur majeur dans la marche atopique. Cette étude expose de nouvelles approches pour le développement de stratégies pour prévenir ou stopper la marche atopique. / My PhD thesis aimed at studying skin inflammatory responses under two pathogenic contexts, melanoma and atopic march. In the first part, we studied the role of keratinocyte-produced cytokine TSLP in melanomagenesis. We showed that TSLP expression was induced in skin epidermis of both mouse and human melanoma. We further provided evidence that TSLP played a tumor-promoting role by ablating or overexpressing TSLP in mouse melanoma, and that such role of TSLP was mediated through immune cells. Our results suggest that a crosstalk between melanoma cells, epidermal keratinocytes and immune cells plays an important role for melanoma growth and metastasis. In the second part, we explored the cytokine factors derived from atopic dermatitis (AD) in driving the asthma. By using an innovative laser-assistant microporation system, we established novel atopic march mouse models. We found that TSLP was differentially implicated in allergen epicutaneous or dermacutaneous sensitization, and further identified IL-1β as an important player in atopic march. This study adds new insight into the development of potential strategies for preventing or stopping the atopic march.

L’inflammation neurogène cutanée (INC) est une inflammation de la peau induite par l’activation des fibres nerveuses intra-épidermiques qui secrètent des neuropeptides tels que la substance P (SP). L’INC est impliquée dans des dermatoses inflammatoires prurigineuses comme le psoriasis, la dermatite atopique (DA) et le syndrome de Netherton (SN). Un nouveau concept émerge, suggérant que les kératinocytes sont également des acteurs majeurs de l’INC. Le récepteur activé par des protéases de type 2 (PAR-2) est fortement incriminé dans l’INC associée à ces dermatoses, ce qui permet de comprendre les voies du prurit non-histaminergique. Les enjeux thérapeutiques sont de taille puisqu’il n’existe actuellement aucun traitement efficace permettant la prise en charge spécifique du prurit histamino-indépendant au cours des dermatoses prurigineuses associées à l’INC.Bien que le rôle de PAR-2 dans la sécrétion de neuropeptides à partir des neurones sensoriels soit clairement établi, son implication dans la modulation de gènes pouvant contribuer à l’entretien ou l’amplification de l’INC reste méconnue. Le rôle inflammatoire de PAR-2 a également été démontré sur des kératinocytes cultivés en monocouche via la sécrétion de cytokines par des mécanismes dépendants du Ca2+. La surexpression de PAR-2 et la perte d’expression de certains canaux calciques impliqués dans sa réponse calcique dans les kératinocytes différenciés suggèrent des mécanismes d’action de PAR-2 différents pour ceux-ci. Dans le but d’étudier le rôle pro-inflammatoire de PAR-2 au cours des dermatoses prurigineuses, nous avons analysé l’effet de son activation sur des monocultures de neurones sensoriels issus de ganglions rachidiens dorsaux (GRD) de rat et de kératinocytes humains différenciés (DhPK), en criblant l’expression de médiateurs de l’inflammation. Pour approfondir, les voies calciques de PAR-2 sous-jacente à la modulation d’expression dans les kératinocytes différenciés, des expériences d’imagerie calcique ont été réalisées et différents antagonistes ont été utilisés pour analyser les acteurs impliqués.Dans le cadre d’un partenariat avec les laboratoires dermatologiques d’Uriage, nous avons testé les effets de l’eau thermale d’Uriage sur la modulation de gènes induite par PAR-2 dans les DhPK. Nous avons également utilisé une lignée de PC12 différenciables en neurones par le NGF afin de les utiliser comme alternatives des neurones sensoriels issus des GRD de rat pour l’étude de l’INC.L’ensemble des résultats obtenus au cours du criblage des gènes modules par PAR-2 confirme le rôle pro-inflammatoire de PAR-2 dans les neurones sensoriels de rat et dans les DhPK. La découverte d’une nouvelle voie calcique de PAR-2 dans les DhPK offre de nouvelles pistes thérapeutiques pour les dermatoses prurigineuses telles que le psoriasis, la DA et le NS. Les résultats obtenus avec l’eau thermale d’Uriage peuvent présenter une perspective thérapeutique pour les patients souffrants de dermatoses prurigineuses réfractaires aux traitements conventionnels. L’utilisation d’une lignée neuronale comme lesPC12 pour l’étude de l’INC serait une alternative utile dans le développement des tests cosmétiques avec les industriels pour notre laboratoire. / Cutaneous neurogenic inflammation (CNI) is an inflammation of the skin induced by the activation of intraepidermal nerve fibers that release neuropeptides such as substance P (SP). CNI is involved in pruritic inflammatory skin disorders such as psoriasis, atopic dermatitis (AD) and Netherton syndrome (NS). A new concept is growing, suggesting that keratinocytes could also trigger INC. The proteases activated receptor 2 (PAR-2) is strongly incriminated in CNI associated with these dermatoses, which allow to understand the histamine-independent itching pathways. The therapeutic stakes are high since there is currently no effective treatment allowing the specific management of histamine-independent pruritus during skin disorders associated with CNI.Although the role of PAR-2 in the secretion of neuropeptides from sensory neurons is clearly established, its involvement in the modulation of genes involved in the maintenance or amplification of CNI remains unknown. The inflammatory role of PAR-2 on keratinocytes has also been demonstrated through the production of cytokines in a Ca2+-dependent mechanisms. The overexpression of PAR-2 and the loss of ORAI1 expression, a calcium channel following keratinocytes differentiation suggest different signaling pathways downstream to PAR-2 activation between undifferentiated and differentiated keratinocytes.In order to study the pro-inflammatory role of PAR-2 during pruritic dermatoses, we analyzed the effect of its activation on rat primary sensory neurons from dorsal spinal ganglia (DRG) and on differentiated human primary keratinocytes (DhPK) by screening the expression of inflammatory mediators. To deepen the Ca2+ pathways underlying PAR-2-mediated inflammatory mediator modulation in DhPK, we performed Ca2+ imaging experiments and different antagonists were used to analyze the involvement of intracellular actors. In a partnership with the dermatological laboratories of Uriage, we tested the effects of Uriage thermal water on PAR-2-induced gene modulation in DhPK. We also used a PC12 cell line differentiable in neurons by the NGF in order to use them as alternatives of rat primary sensory neurons from DRG for the study of INC. We also used a PC12 cell line differentiable in neurons by the NGF use them as alternatives of rat primary sensory neurons from DRG for the study of INC.The results obtained during the screening of the PAR-2-modulated genes confirmed the proinflammatory role of PAR-2 in rat primary sensory neurons and in DhPK. The discovery of a new PAR-2-mediated Ca2+ pathway in DhPK offers new therapeutic pathways for pruritic dermatoses such as psoriasis, AD and NS. The results obtained with the thermal water of Uriage can present a therapeutic perspective for patients suffering from pruritic dermatoses refractory to conventional treatments. The use of a neuronal cell line as the PC12 for the study of INC would be an useful alternative in the development of cosmetic tests.

L'angiodermite nécrotique ou "Hypertensive Leg Ulcer" (HLU) est un ulcère de jambe inflammatoire de traitement difficile, associé à une hypertension artérielle chronique. La douleur est très importante et nécessite l'utilisation de la morphine pour soulager les patients. Notre objectif était d'analyser les caractéristiques de l'inflammation et d'étudier son implication dans la physiopathologie de la nécrose cutanée. La peau inflammatoire est le siège d'un infiltrat composé de macrophages et de lymphocytes. L'épiderme et les cellules vasculaires lisses des microvaisseaux présentent des troubles de la différenciation et une importante prolifération. Nous observé une forte augmentation des transcrits de l'interleukine 1β (IL-1β), de l'IL-6 et de l'Oncostatin M (OSM), qui sont exprimées par les macrophages.Les kératinocytes humains in vitro et in vivo chez la souris montrent un phénotype semblable lorsqu'ils sont exposés à ces cytokines.Comparée à la peau inflammatoire et à la peau saine, la peau en périphérie de l'inflammation est douloureuse et présente des altérations histologiques intermédiaires. On observe une légère augmentation de l'expression des cytokines inflammatoires IL-1β et OSM. D'autre part, la consommation de morphine est associée au niveau d'expression de l'OSM et l'inflammation systémique reflète la douleur ressentie par le patient. Ces éléments sont en faveur d'une implication des cytokines inflammatoires IL-1β et OSM dans la physiopathologie de la douleur et de la nécrose dans l'HLU. Le cercle vicieux pourrait être bloqué par l'utilisation des biothérapies anticytokines, ce qui met en avant de nouvelles cibles thérapeutiques. / Hypertensive Leg Ulcer (HLU) is an inflammatory skin lesion associated to chronic high blood pressure. The ulcer is painful requiring morphine to relieve patients. Our objective was to analyze the characteristics of the inflammation and to study it’s implication in pathogenesis of skin necrosis. Inflammatory skin is infiltrated by macrophages and lymphocytes. Keratinocytes and vascular smooth muscle cells of microvessels display an alteration of differentiation and an important proliferation. We studied the expression of cytokines associated to skin inflammation and we observed a strong augmentation of the transcripts for the interleukin 1β (IL-1β), the IL-6 and the Oncostatin M (OSM); which are expressed by the macrophages. The reconstructed human epidermis in vitro exposed to these cytokines showed a similar phenotype of the histological studies in human. At least, injection of these cytokines to the mouse produces an inflammation and an alteration of the epidermis comparable to HLU.Compared to the inflammatory skin and to the healthy skin, the skin in periphery of the inflammation is painful and presents intermediate histological alterations. We observed a slight augmentation of the inflammatory cytokines IL-1β and OSM. On the other hand, the consumption of morphine is associated with the level of expression of the OSM and systemic inflammation reflects the pain felt by the patient.The present evidence indicates an involvement of inflammatory cytokines IL-1β and OSM in the pathogenesis of pain and skin necrosis in the HLU. The vicious circle may be blocked by the use of biotherapies against inflammatory cytokines, which highlights new therapeutic targets.

Chaque cadre doit contenir un résumé de 1700 caractères maximum, espaces compris. En cas de dépassement, lacoupure sera automatique.Le doctorant adresse son texte sous forme électronique selon les recommandations de la bibliothèqueLes dermocorticoïdes (DC) sont des anti-inflammatoires topiques largement prescrits pour traiter de nombreuses dermatoses. Actuellement, leur puissance, classée en quatre groupes, est déterminée par leur effet vasoconstricteur basé sur un test empirique obsolète, subjectif et réducteur vis-à-vis des nombreux autres effets des DC. L'objectif de ce travail était de comparer la puissance des DC dans trois de leurs indications et de la confronter à la classification actuelle:• Anti-inflammatoire. Une étude clinique randomisée contrôlée en double aveugle a été réalisée sur 21 patients allergiques aunickel traités par quatre DC. Les différents paramètres de l'inflammation ont été mesurés objectivement par des outils debiométrologie. La hiérarchisation de la puissance des DC variait en fonction du temps et des paramètres de l'inflammationétudiés. Sur ce modèle, la classification peut être simplifiée en trois groupes.• Antiprolifératif. L'efficacité de six DC sur la prolifération, le cycle cellulaire et l'apoptose de kératinocytes hyperproliféranten culture a été comparée. La classification de la puissance antiproliférative divergeait de la classification actuelle.• Antiprurigineux à médiation histaminique. L'effet anti-histaminolibérateur de huit DC a été comparé sur des explants depeau à l'aide d'un dosage par microdialyse sous-cutanée. La classification de la puissance anti-histaminolibératrice divergeaitde la classification actuelle.Nous avons démontré que la classification actuelle des DC n'est pas exactement corrélée à leur effet anti-inflammatoire dansl'allergie de contact, à leur effet antiprolifératif ainsi qu'à leur effet sur la libération d'histamine. Notre nouvelle approche est deparler des puissances DC au pluriel. Une classification multimodale adaptée à la situation clinique permettrait une prescriptionplus efficiente et limiterait les échecs et effets indésirables. / Topical corticosteroids (TCS) are topical anti-inflammatory widely prescribed to treat many skin diseases. Currently, their potency, ranged into four groups, is determined by their vasoconstrictor effect based on an empirical, outdated, subjective and too restrictive test. The aim of this work was to compare specifically the potency of TCS in three situations and to compare it to the current classification:• Anti-inflammatory. A randomized controlled double-blind clinical study was performed on 21 nickel-sensitive patientstreated by four TCS. Different inflammation parameters were objectively assessed with bioengineering tools. The ranking ofTCS potency varied according to time and parameters of the inflammation studied. According to this model, the classificationmay be simplified into three groups.• Antiproliferative. The efficacy of six TCS on immortal keratinocytes proliferation, cell cycle and apoptosis was compared. Theclassification of the antiproliferative potency differed from the current classification.• Antipruritic histamine-mediated. The histamine-release inhibition of eight TCS was compared on skin explants by asubcutaneous microdialysis dosage. The classification of the histamine-release inhibition potency differed from the currentclassification.We have demonstrated that the current classification of TCS potency is not strictly correlated to their anti-inflammatory effect in the context of allergie contact dermatitis, to their antiproliferative effect and to their histamine-release inhibitor effect. Our new approach is to talk about TCS potencies in the plural. A specifie classification adapted to the therapeutic target is needed to be more efficient and reduce side effects.

Les peptides élastiques (ELP, Elastin-like peptide) sont d'excellents exemples de polymères biomimétiques récemment proposés en médecine régénérative, en particulier dans le domaine de l'ingénierie tissulaire des tissus mous (peau, vaisseaux sanguins, poumons…) pour lesquels la modélisation est complexe car l'instruction correcte des cellules nécessite une élasticité fonctionnelle. L'ajustement précis de la structure primaire des ELP peut moduler voire améliorer les propriétés physico-chimiques, structurales et fonctionnelles de la protéine native. De plus, la capacité des ELP à ajuster leurs caractéristiques physico-chimiques en réponse à des stimuli externes (température, pH), les définit comme des polymères intelligents. Ces polymères bioactifs offrent ainsi une large gamme d'applications très prometteuses encore très peu explorées dans les technologies d'ingénierie tissulaire et les systèmes d'administration de médicaments. Dans ce travail de thèse, nous avons développé, caractérisé et évalué les potentiels thérapeutiques d'une protéine élastique synthétique, Elactiv', inspirée de la structure unique de la tropoélastine humaine, précurseur soluble de l'élastine. Elactiv' conserve les caractéristiques physico-chimiques (comportement thermosensible, propriétés d'autoassemblage) et les fonctions biologiques de la protéine native (prolifération, différenciation et survie des fibroblastes dermiques et kératinocytes humains, sensibilité à la dégradation enzymatique). De plus, Elactiv' possède la particularité in vitro de s'incorporer dans les fibres élastiques néo-synthétisées par des fibroblastes dermiques sains, et d'induire la synthèse de tropoélastine fibrillaire par des fibroblastes pathologiques, syndrome de Williams-Beuren, qui ne synthétisent pas ou très peu de fibres élastiques. Un hydrogel formé exclusivement d'Elactiv' a permis d'accéder aux propriétés mécaniques de l'ensemble et de vérifier sa biocompatibilité in vitro et son innocuité et sa résorption in vivo. Enfin, l'association de la protéine Elactiv' aux dendrigrafts de poly(L-lysine), polymères synthétiques hautement fonctionnalisables, a permis de faire évoluer l'architecture de l'hydrogel vers un biomatériau hybride dans le but d'augmenter ses propriétés mécaniques et biologiques. Ainsi, les potentiels biomimétiques et thérapeutiques de la protéine Elactiv' en font un candidat prometteur pour la régénération des tissus mous / Elastin-like peptides are excellent examples of biomimetic polymers recently proposed in regenerative medicine, particularly for soft tissue engineering (skin, blood vessels, lung ...) for which modeling is a complex task requiring functional elasticity to insctruct cells properelly. Fine-tuning of ELP’s primary structure can modulate or improve physicochemical, structural and functional properties of the native protein. In addition, the adjustment of ELP physicochemical characteristics through external stimuli (temperature, pH) defined them as intelligent polymers. These bioactive polymers thus provide a wide range of very promising applications in tissue engineering and drug delivery, although this has been under-explored until then. In this thesis, we have developed, characterized and evaluated therapeutic potentials of Elactiv', a synthetic elastic protein inspired by the unique structure of the human tropoelastin, the soluble precursor of elastin. Elactiv’ retains physicochemical characteristics (thermoresponsive behavior, self-assembly properties) and biological functions of the native protein (proliferation, differentiation and survival of human keratinocytes and dermal fibroblasts, susceptibility to enzymatic degradation). Besides, Elactiv’ is able to incorporate into neosynthesized elastic fibers by healthy dermal fibroblasts, and to induce fibrillar tropoelastin synthesis by pathological fibroblasts, Williams-Beuren syndrome, which do not synthesize or very few elastic fibres. A hydrogel formed exclusively of Elactiv’ allowed to access to mechanical properties of the scaffold and to verify its biocompatibility in vitro and its safety and resorption in vivo. Finally, the association of Elactiv' protein to poly(L-lysine) dendrigrafts, highly functionalizable synthetic polymers, enabled to evolve the hydrogel's architecture to a hybrid biomaterial in order to increase its mechanical and biological properties for skin tissue engineering. Taken together, biomimetic and therapeutic potentials of Elactiv' protein make it a promising candidate for soft tissue regeneration

La peau, organe le plus étendu du corps humain, réalise une barrière entre l’environnement et le milieu interne préservant ainsi l’homéostasie. De nombreuses fonctions sont assurées par le tégument telles une modulation des échanges thermiques, une barrière physique, chimique et immunitaire contre l’entrée des composés et microorganismes exogènes mais également contre la perte des substances du milieu interne. L’altération de la surface cutanée et donc de ses fonctions, engendre un processus complexe de réparation qui vise à restaurer le système. Lors de ce travail de thèse des outils biophysiques ont été expérimentés dans un premier temps afin de renseigner sur la qualité de la fonction barrière, et donc sur la qualité de la cicatrisation cutanée. La première approche consistait à quantifier la qualité de la barrière cutanée par mesure de la perte insensible en eau. Cette approche s’est révélée fructueuse et a été proposée comme standard interne dans les études de perméation cutanée ex vivo afin de permettre une comparaison plus aisée des résultats expérimentaux issus de différentes préparations de peau. Dans un second temps la mesure des paramètres du micro relief cutané a été confrontée aux résultats des mesures concomitantes des paramètres biophysiques classiques (perte insensible en eau et hydratation cutanée) afin de mettre en évidence une possible corrélation entre qualité de la fonction barrière cutanée et topologie de surface. Les résultats des deux méthodes d’investigation sont effectivement bien corrélés dans le cas d’une altération physique de la surface cutanée, suggérant les mesures des paramètres du micro relief cutané comme une méthode originale de quantification de la réépithélialisation cutanée. Une approche plus fondamentale a également été éprouvée afin d’appréhender les mesures de « pertes insensibles en oxygène » comme une mesure innovante de la qualité de la fonction barrière cutanée. Cette première approche a permis de mettre en évidence, une orientation préférentielle significative du flux d’oxygène à travers la peau.La deuxième partie de ce travail de thèse a consisté à développer une nouvelle formulation pro cicatrisante et de tester son potentiel thérapeutique in vitro. Initialement basée sur l’administration d’oxygène afin de lutter contre l’hypoxie qui accompagne souvent les lésions cutanées, cette ligne d’étude a rapidement été écartée au profit du développement d’une formulation pour l’établissement d’un stress oxydant améliorant les processus de cicatrisation. Cette théorie du stress oxydant comme promoteur de la cicatrisation découle d’observations récentes qui démontrent un retard de cicatrisation en l’absence d’un stress oxydant in vivo, et une stimulation spécifique des cellules in vitro. Les formulations développées à ce dessein ont été testées sur des cultures de kératinocytes in vitro afin d’étudier leurs effets sur la réépithélialisation : l’une des dernières étapes de la cicatrisation. / Skin, the largest organ of the human body, confers protection from the environment through several barrier functions which provide physical, immune and chemical defenses. Skin provides protection to microorganisms, exogenous compounds, shocks, radiations, temperature and out flowing of solutes or water from the body. Without an efficient system to restore skin structures and functions, skin wounding may be deleterious. Over the course of this Ph.D. work, varied biophysical parameters have been experienced as tools to investigate the cutaneous wound healing quality. Measurement of transepidermal water loss (TEWL) to quantify the barrier function quality of the skin has been successfully assessed. It has been proposed as an internal standard of skin integrity facilitating direct comparison of data issued from different skin samples. In an in vivo approach, skin micro-relief parameters have been set against TEWL and hydration values after a physical or chemical damage onto the skin. Interestingly micro-relief parameters and biophysical measurements were closely related after tape-stripping, suggesting topographical parameters as an original method to quantify skin reepithelialization. A more fundamental assay was performed suggesting oxygen flux as a new tool to investigate skin barrier quality. From our results a “transepidermal oxygen loss” development seems to be compromised but surprisingly, we pointed out a preferential oxygen delivery course through the skin from endogenous reservoir. Besides the improvement of these tools for wound healing assessment, an innovative formulation to promote skin wound healing has been developed. The challenge of this new preparation is to generate reactive oxygen species, namely hydrogen peroxide, at sub-cytotoxic levels. Indeed recent studies pointed out that down regulation of hydrogen peroxide production in vivo delayed wound healing; furthermore, in vitro stimulation of fibroblasts or keratinocytes with hydrogen peroxide induced expression of healing promoting factors. The developed formulation was therefore assayed on keratinocytes’ in vitro culture in order to evaluate their efficacy on réépithélialisation, ending wound closure. Interestingly one of the developed formulation stimulated significantly keratinocytes migration, through a mechanism which do not imply TGF-1 expression, suggesting a potential benefit in wound réépithélialisation.

Induced pluripotent stem cells (iPSC) have the capacity to self renew and differentiate into a myriad of cell types making them potential candidates for cell therapy and regenerative medicine. The goal of this thesis was to determine the characteristics of equine iPSC (eiPSC) that can be harnessed for potential use in veterinary regenerative medicine. Trauma to a horse’s limb often leads to the development of a chronic non-healing wound that lacks a keratinocyte cover, vital to healing. Thus, the overall hypothesis of this thesis was that eiPSC might offer a solution for providing wound coverage for such problematic wounds. Prior to considering eiPSC for clinical applications, their immunogenicity must be studied to ensure that the transplanted cells will be accepted and integrate into host tissues. The first objective of this thesis was to determine the immune response to eiPSC. To investigate the immunogenicity of eiPSC, the expression of major histocompatibility complex (MHC) molecules by the selected lines was determined, then the cells were used in an intradermal transplantation model developed for this study. While transplantation of allogeneic, undifferentiated eiPSC elicited a moderate cellular response in experimental horses, it did not cause acute rejection. This strategy enabled the selection of weakly immunogenic eiPSC lines for subsequent differentiation into lineages of therapeutic importance. Equine iPSC offer a potential solution to deficient epithelial coverage by providing a keratinocyte graft with the ability to differentiate into other accessory structures of the epidermis. The second objective of this thesis was to develop a protocol for the differentiation of eiPSC into a keratinocyte lineage. The protocol was shown to be highly efficient at inducing the anticipated phenotype within 30 days. Indeed, the eiPSC derived vi keratinocytes (eiPSC-KC) showed both morphologic and functional characteristics of primary equine keratinocytes (PEK). Moreover, the proliferative capacity of eiPSC-KC was superior while the migratory capacity, measured as the ability to epithelialize in vitro wounds, was comparable to that of PEK, suggesting exciting potential for grafting onto in vivo wound models. In conclusion, equine iPSC-derived keratinocytes exhibit features that are promising to the development of a stem cell-based skin construct with the potential to fully regenerate lost or damaged skin in horses. However, since eiPSC do not fully escape immune surveillance despite low MHC expression, strategies to improve engraftment of iPSC derivatives must be pursued. / Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ont la capacité de s'auto renouveler et de se différencier en une myriade de types cellulaires, ce qui en fait des outils intéressants pour la thérapie cellulaire et la médecine régénérative. Le but de cette thèse était de déterminer les caractéristiques des iPSC équines (eiPSC) qui peuvent être exploitées pour l'usage potentiel en médecine régénérative vétérinaire. Chez le cheval, une plaie cutanée est souvent cicatrisée par seconde intention et est sujette à de nombreuses complications lorsque située sur le membre, notamment une épithélialisation lente. Ainsi, l'hypothèse globale de cette thèse était que les eiPSC pourraient offrir une solution novatrice de couverture pour de telles blessures. Avant d'envisager l’utilisation d'eiPSC à des fins cliniques, leur immunogénicité doit être étudiée afin de s'assurer que les cellules transplantées seront acceptées et intégrées dans les tissus du receveur. Le premier objectif de cette thèse était de définir la réponse immunitaire suscitée par les eiPSC. Afin d'étudier l'immunogénicité d'eiPSC, l'expression de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) des lignes choisies a été déterminée, puis les cellules ont été utilisées dans un modèle de transplantation intradermique développé pour cette étude. Bien que la transplantation allogénique d'eiPSC non différenciées ait induit une réponse cellulaire modérée chez les chevaux d'expérimentation, elle n'a pas provoqué de rejet. Cette stratégie a permis la sélection de lignées d'eiPSC faiblement immunogènes pour la différenciation ultérieure en des lignées d'importance thérapeutique. Les eiPSC représentent une solution intéressante et qui, par l’entremise du développement d’une lignée de kératinocytes, pourraient servir à la création d’une greffe ayant la capacité de former non seulement l’épithélium manquant mais aussi d'autres structures accessoires de l'épiderme. Le deuxième objectif de cette thèse était donc de iv développer un protocole pour la différentiation des eiPSC en lignée de kératinocytes. Un protocole visant cette différenciation fut ainsi développé et ce dernier a démontré une grande efficacité à produire le phénotype attendu dans une période de 30 jours. En effet, les kératinocytes dérivés d'eiPSC (eiPSC-KC) ont montré des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des kératinocytes primaires équins (PEK). En outre, la capacité de prolifération d'eiPSC-KC est supérieure tandis que la capacité migratoire, mesurée comme l'aptitude à cicatriser les plaies in vitro, est comparable à celle du PEK. En conclusion, les eiPSC-KC ont des caractéristiques intéressantes pour le développement d'un substitut cutané à base de cellules souches, ayant le potentiel de régénérer la peau perdue lors de trauma ou de maladie, chez le cheval. Cependant, parce que les eiPSC n'échappent pas totalement à la surveillance immunitaire, malgré une faible expression du MHC, des stratégies pour améliorer la prise de greffe eiPSC-KC doivent être élaborées.

La maladie de Lyme est la maladie à transmission vectorielle la plus répandue de l’hémisphère Nord. La peau est un organe clef dans cette maladie, car c’est à cet endroit qu’interagissent les cellules de l’hôte, le pathogène, le microbiote cutané et le vecteur. Nous avons développé un modèle murin d’infection disséminée de borréliose de Lyme, qui nous a permis de développer une méthode spécifique de détection de protéines de Borreliella dans le tissu cutané murin par SRM-MS, pouvant aboutir à une méthode de diagnostic chez l’homme. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux relations entre le microbiote cutané, les cellules résidentes de la peau, kératinocytes et fibroblastes, avec Borreliella. Les sécrétomes de trois bactéries commensales, S. epidermidis, P. acnes et C. striatum possèdent un effet synergique sur l’expression de gènes inflammatoires par les kératinocytes et les fibroblastes. Les sécrétomes de P. acnes et de C. striatum se sont également montrés capables d’inhiber une partie de la réponse inflammatoire des kératinocytes, pouvant aider le pathogène lors de la transmission/dissémination précoce. / Lyme disease is the most common vector-borne disease in the Northern Hemisphere. Skin is a key organ in the disease, since it is the key interface where host cells, pathogen, skin microbiota and vector interact early during pathogen transmission. We developed a late lyme borreliosis model on mice. This model allowed us to develop a specific detection method of Borreliella proteins in the mouse skin by SRM-MS that might be used to develop a human diagnosis of disseminated Lyme disease. In a second part, we analysed the relationship between skin microbiota, resident skin cells (keratinocytes and fibroblasts), in the presence or absence of Borreliella. The secretome of three commensals bacteria, S. epidermidis, P. acnes and C. striatum was shown to have a synergistic activity with Borreliella in pro-inflammatory gene expressions by keratinocytes and fibroblasts. P. acnes and C. striatum secretomes were also able to inhibit partially the inflammatory response of keratinocytes that might help the transmission/dissemination of the pathogen.