Depuis plusieurs années, les nanosciences promettent des progrès remarquables dans de nombreux domaines, mais soulèvent aussi de nombreuses inquiétudes en regard de leur impact sur la santé humaine (expositions environnementales, industrielles, médicales). Il se pose, entre autres, la question de la détection, de la quantification et du devenir d’oxydes métalliques et de nanoparticules manufacturées au sein de tissus, et plus particulièrement de la peau. Il est donc essentiel de préciser les mécanismes impliqués dans ces processus de fonction barrière cutanée et de les caractériser dans des modèles biologiques in vitro/in vivo. Ainsi, au cours de ma thèse, il m’a été donné l’occasion de mettre en œuvre des méthodes d’analyses quantitatives en association avec des techniques d’imagerie très résolutives (microscopies confocale et électronique et analyse par microfaisceau d’ions) afin de caractériser : (i) la fonction barrière d’un modèle de peau d’oreille de porc maintenu en survie en définissant le comportement de l’homéostasie ionique en réponse à différents stress chimiques ou physiques (Collaboration Hélène Duplan, Institut de Recherche Pierre Fabre); (ii) l’impact sur la viabilité, l’accumulation et la distribution intracellulaire de nanoparticules (oxydes de titane) natives ou fonctionnalisées à l’aide d’agents fluorescents (FITC, Rhodamine) (Collaboration M.H. Delville, Institut de Chimie de la Matière Condensée de Bordeaux). Les résultats obtenus montrent la possibilité de définir (i) le rôle des ions dans la fonction barrière cutanée d’un modèle biologique maintenu en survie et exposé à différents stress, (ii) la toxicologie des nanoparticules manufacturées in vivo; (iii) leur devenir au sein de modèle biologique d’intérêt (kératinocytes). / Since many years, nanosciences are of great interest for researchers and industrialists, with numerous applications in various domains, however, their potential effects on human health have also attracted attention (environmental, industrial and medical exposures). Up to now, it has been very difficult to detect and track metallic oxides and manufactured nanoparticles in biological tissues, most particularly in skin. Thus, it is essential to precise the mechanisms involved in skin barrier function processes face to these exogenous agents and to characterize them in biological models in vitro/in vivo. During my PhD, I had the opportunity to combine quantitative methods of analysis with high resolution imagery techniques (confocal microscopy, transmission electron microscopy and ion beam analysis) in order to characterize: (i) the skin barrier function of an ex vivo pig ear skin model understanding the ion homeostasis behavior face to different stresses, chemical or physical (Collaboration with Hélène Duplan, Pierre Fabre Research Institute), (ii) the impact on viability, accumulation and intracellular distribution of nanoparticles (Titanium Oxides) naked or functionalized with fluorescent dyes (FITC, Rhodamine) (Collaboration with M.H. Delville, Bordeaux Institute of Condense Matter Chemistry). Results show the possibility to define (i) the role of ions in skin barrier function of a biological ex vivo model in native conditions and after exposure to different stresses (ii) in vivo toxicology of manufactured nanoparticles (iii) their future in a biological model of interest (keratinocytes)

Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la réépithélialisation des plaies cutanées, des expériences ont été réalisées chez la souris et à l'aide d'un nouveau modèle tridimensionnel humain issu du génie tissulaire. Bien qu'ayant eu lieu en fonction du temps, les expériences réalisées montrent que les changements, qui se produisent lors de la réépithélialisation, dépendent de la localisation des cellules dans l'épiderme en régénération. L'étude de l'expression des protéines de stress chez la souris révèle que chacune possède son propre patron d'expression au long de l'épiderme en régénération : Hsp60 et Hsp70 semblent associées à la prolifération des kératinocytes; Hsp27 et Hsp90, à leur différenciation. Les observations recueillies avec le modèle in vitro de guérison des plaies suggèrent deux mécanismes complémentaires de réépithélialisation : 1) le déplacement passif des couches superficielles à partir des marges de la plaie; 2) la régénération épidermique au centre des plaies à partir de la prolifération des kératinocytes locaux et leur migration les uns par-dessus les autres afin de faire progresser l'épiderme en régénération.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / Les cellules souches sont à la base de la régénération des tissus adultes et du maintien de leur homéostasie. Afin d'étudier le processus de différenciation des cellules souches cutanées et d'approfondir nos connaissances sur les conditions qui contrôlent leur différenciation en épiderme et/ou en follicules pileux in vitro différents substituts cutanés ont été mis au point par génie tissulaire. D'une part, la portion dermique des peaux reconstruites a été produite par la superposion de feuillets de matrice extracellulaire produits par des fibroblastes humains ou murins cultivés en présence d'acide ascorbique. D'autre part, des kératinocytes (humains ou murins) ou des follicules pileux immatures (murins) ont été implantés sur les dermes reconstruits. Les propriétés histologiques et immunohistochimiques des tissus ont été évaluées après leur maturation in vitro ou sur l'animal. Nos résultats ont révélé que les interactions mésenchyme-épithéliales créées dans la peau reconstruite par génie tissulaire influencent significativement la voie de différenciation qu'empruntent les kératinocytes engendrés par les cellules souches et qu' il est possible, en recréant les conditions adéquates, de reconstruire des substituts cutanées aux propriétés histologiques similaires à la peau native ainsi que des peaux reconstruites capables de soutenir la formation de follicules pileux après la greffe. Des études in situ ont également été menées sur les cellules souches de la vibrisse de la souris. Nous avons observé que les kératinocytes présentant un cycle cellulaire long forment deux populations distinctes dans la région du renflement: une est en contact avec la membrane basilaire et l'autre ne l'est pas (appelée Bs1). Chacune de ces populations possède un aspect histologique distinct et présente une organisation, du réseau de kératine qui lui est spécifique et qui est associée à l'expression de kératines particulières. L'étude des vibrisses des souris dont le gène de la kératine 17 (K 17) a été invalidé a révélé que la K 1 7 est essentielle à la formation des vibrisses et à l'intégrité ultrastructurale des cellules Bs 1. En conclusion, mes travaux apportent de nouvelles données sur les conditions qui régissent la différenciation des cellules souches cutanées et sur les caractéristiques intrinsèques des cellules souches de la vibrisse.

La différenciation épidermique est un processus complexe qui requiert une régulation fine, chronologique et précise. La régulation de ce processus de différenciation dépend d'un grand nombre de voies de signalisation et d'activateurs qui doivent intervenir à des moments précis. Les différents processus et acteurs moléculaires qui sont impliqués dans la différenciation des kératinocytes sont encore mal connus. Étant donné la complexité de ce programme de différenciation, la mise en lumière de ces processus moléculaires revêt un grand défi. La DLK est un élément régulateur potentiel du processus de cornification des kératinocytes puisqu'elle n'est exprimée que dans les cellules les plus différenciées de l'épiderme. L'expression de DLK dans des kératinocytes humains normaux peu différenciés à l'aide d'un système adénoviral de transfert de gènes a révélé un rôle clé de DLK dans la différenciation épidermique. Cette expression de DLK engendre en effet divers processus primordiaux à la phase tardive de la différenciation des kératinocytes comme l'expression de la filaggrine, l'activation de la transglutaminase, l'accumulation de la protéine p21 cipl/WAFl et la dégradation de l'ADN. La différenciation épidermique s'accompagne également de l'expression de protéines de la famille des Hsp, entre autres la Hsp 27. L'expression de DLK dans des kératinocytes normaux humains entraîne la colocalisation de Hsp 27 avec l'enveloppe cornée ainsi que son insolubilisation, un phénomène observé dans la phase tardive de la différenciation épidermique. Finalement, le calcium est un important régulateur de la différenciation des kératinocytes. L'augmentation du niveau de calcium intracellulaire engendre une augmentation de l'activité de DLK et une re-localisation aux membranes tel qu'observé dans la couche granuleuse de l'épiderme. La localisation membranaire de DLK est aussi un reflet de son rôle important dans la cornification des kératinocytes. Ces travaux montrent donc le rôle important de DLK dans la différenciation épidermique. Ainsi, ils ont permis d'identifier un nouveau régulateur de ce programme de différenciation terminale.

Les aquaporines (AQPs) sont des petites protéines formant des canaux hydriques àtravers les membranes cellulaires. Les AQPs 0, 1, 2 ,4 ,5 ,6 et 8 assurent le transport sélectif de l’eautandis que les AQPs 3, 7, 9 et 10 permettent également le passage du glycérol. Nous avons étudié leurexpression dans l’épiderme, la couche supérieure de notre peau supposée imperméable. Dans lesmélanocytes, des cellules dendritiques responsables de la pigmentation, seule l’AQP1 est exprimée.Nous avons montré que les kératinocytes, les cellules majoritaires de l’épiderme, expriment enprolifération les AQPs 3 et 10, alors que les kératinocytes différenciés expriment les AQPs 3 et 9. Lalocalisation de l'AQP3 a été précédemment rapportée à la membrane plasmique des kératinocytes, de lacouche basales à la couche épineuse. Nous avons localisé l'AQP9 dans les kératinocytes différenciés dela couche granuleuse au contenu riche en glycérol et réduit en eau. De fait nous pensons que l'AQP9 ysert de transporteur de glycérol. Enfin contrairement à d'autres auteurs, nous n’avons pu mettre enévidence de lien entre prolifération tumorale et expression des aquaporines. / Aquaporins (AQPS) are a family of small proteins forming water channels across cell membranes.AQPs 0, 1, 2, 4, 5, 6 and 8 are strictly water channel whereas AQPs 3, 7, 9 and 10 allow transport ofwater and glycerol. We have studied their expression in the epidermis, the outer-most water-impermeablelayer of the skin. In melanocytes, dendritic cells responsible for pigmentation, only AQP1 is expressed, invitro and ex vivo. We have shown that keratinocytes, principal cells of the epidermis, express AQPs 3 and10 in proliferation, whereas differentiated keratinocytes express AQPs 3 and 9. The localisation of AQP3to plasma membrane of keratinocytes was previously reported from the basal layer to the spinous layer ofthe skin. We localised AQP9 in the fully differentiated keratinocytes of the granular layer, where there is ahigh glycerol and low water content. So we think that AQP9 likely functions as a glycerol transporter.Unlike other authors, we were unable to identify a link between tumorous proliferation and the expressionof aquaporins.

Le récepteur à l'IGF1 (IGF-1R) ainsi que ses voies de régulation sous-jacentes ont été largement étudié pour leur importance au cours du développement et leur rôle mitotique sur divers types cellulaires. A l'échelle de la peau, l'IGF-1R contribue à l'homéostasie épidermique et est souvent associé au compartiment basal pour son effet pro-prolifératif. Très peu d'études ont montré son implication au niveau de la différenciation épidermique et celles-ci présentent des résultats contradictoires. Au cours du vieillissement, la peau s'amincit et la barrière épidermique présente des défauts de perméabilité. Parallèlement, l'activité de l'IGF- 1R, maximale à l'adolescence, diminue avec l'âge. Cette étude a contribué à éclaircir le rôle de l'IGF-1R sur la différenciation épidermique et à montrer un lien entre vieillissement, perte en qualité de la peau et diminution d'activité de l'IGF-1R. L'élaboration de modèles 2D et 3D mimant le vieillissement par diminution d'activité de l'IGF-1R, nous a permis de confirmer le rôle mitotique de l'IGF-1R sur les kératinocytes et les progéniteurs et de démontrer son effet régulateur sur la différenciation épidermique par augmentation ou diminution de ces marqueurs. L'IGF-1R renforce l'adhésion cellulaire sur différentes matrices, impliquant de possibles interactions avec les intégrines α6 et β1. Ces résultats ont été corrélés aux observations de biopsies de peaux jeunes et âgées. Nous avons aussi montré que l'IGF-1R conférait un état sénescent aux cellules soumises à de fortes doses d'H2O2. Ces travaux montrent ainsi que l'IGF-1R est nécessaire pour le processus de différenciation épidermique et pour en assurer sa protection face au stress oxydant / Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) and its signaling pathway have been widely studied for their growth promoting role on many cell types and their implication in development. On skin, the IGF-1R function has been associated to basal proliferation and contributes to epidermal morphogenesis, but very little is known about its involvement on keratinocytes differentiation and the few studies existing depict contradictory results. IGF-1R activity is maximal during teenage and tend to decrease during aging. Aged skin depicts major thinning and defects in permeability of skin barrier. Our work consisted in clarifying IGF-1R role on epidermal differentiation process and emphasized a correlation between aging, loss of skin quality and IGF-1R activity. By building 2D and 3D aging like models with low IGF-1R activity, we confirmed IGF-1R mitogenic role on both basal and progenitor-like keratinocytes. We demonstrated that IGF-1R activity regulated keratinocytes differentiation by either enhancing or slowing down differentiation markers deposition. More importantly, we highlighted the importance of IGF-1R activity for keratinocytes adhesion on both laminin-332 and collagen I/IV coatings, implying possible interactions with α6 and β1 integrins. This relationship was further correlated on skin biopsies of young and aged donors. In a parallel study, we showed that IGF-1R could induce cell senescence under acute H2O2 stress. Taken together, IGF-1R is necessary for the epidermal differentiation process and protects epidermis from acute oxidative stress induced damages

Lors de la prise d'un repas sanguin par le moustique Aedes (Ae) aegypti, le virus de la dengue (DENV) est transmis à l'homme avec la salive du moustique. Ce mélange complexe est en partie déposé dans le compartiment cutané extravasculaire lors de la piqûre de moustique. Il est donc important de prendre en compte la triade virus-vecteur-hôte vertébré dans les mécanismes de transmission de ce virus à l'hôte vertébré. Des analyses de génomique et protéomique des glandes salivaires d'Ae. Aegypti infectées ou non par le DENV nous ont permis de mettre en évidence dans les glandes salivaires de moustiques infectés, la surexpression d'un gène codant pour un peptide antimicrobien (PAM) cationique. Nous avons démontré, que ce PAM possède une activité antibactérienne et antivirale contre les virus de la dengue et du chikungunya. Nos travaux soulignent l'importance chez les invertébrés, du compartiment « glandes salivaires » dans la réponse immunitaire innée du moustique. Nous avons également démontré que les kératinocytes humains sont des cellules permissives pour le DENV et que l'infection de ces cellules stimule la réponse immunitaire innée antivirale. Nos travaux démontrent que des extraits de glandes salivaires d'Ae. Aegypti augmentent l'infection du virus de la dengue dans les kératinocytes humains. Nous avons par la suite identifié une protéine salivaire d'Ae. Aegypti (34kDa), qui augmente l'infection du DENV en supprimant la production d'interféron. L'ensemble de ces travaux ont permis de contribuer aux connaissances sur la transmission du DENV, mais aussi d'identifier de nouvelles cibles potentielles pour le contrôle de la réplication virale. / Dengue virus (DENV) transmission is initiated when a blood-feeding Aedes (Ae) aegypti mosquito injects saliva, together with the virus, into the epidermis of its mammalian host. Studies of DENV should, therefore, take into account the triad virus-vector-vertebrate host. We have used functional genomic and proteomic analyses, of the salivary glands of female Ae. Aegypti, to demonstrate that this compartment harbors a potent immune response against DENV, represented by the production of an antimicrobial peptide (AMP). This AMP was found to exert, in addition to its anti-bacterial activity, an anti-viral activity against DENV and Chikungunya. Our data demonstrate, for the first time, the permissiveness of human epidermal keratinocytes to DENV infection. Remarkably, DENV replication in keratinocytes contributes to the establishment of anti-viral innate immunity that might occur shortly after the mosquito bite. To investigate the role of Ae. aegypti saliva in DENV transmission to man, primary human keratinocytes were infected with DENV in the presence of Ae. aegypti salivary gland extract. We show that Ae. aegypti saliva enhances dengue virus infection of human keratinocytes by suppressing innate immune responses. Furthermore, we have found a 34-kDa protein, in the saliva of Ae.aegypti, that strongly enhances DENV replication by suppressing type-I IFN production. This study provides new insights into the role of Ae. aegypti salivary glands and saliva in DENV transmission. The data presented here provide novel targets for the control of DENV replication in mammalian hosts.

Depuis plusieurs années, les nanosciences promettent des progrès remarquables dans de nombreux domaines, mais soulèvent aussi de nombreuses inquiétudes en regard de leur impact sur la santé humaine (expositions environnementales, industrielles, médicales). Il se pose, entre autres, la question de la détection, de la quantification et du devenir d'oxydes métalliques et de nanoparticules manufacturées au sein de tissus, et plus particulièrement de la peau. Il est donc essentiel de préciser les mécanismes impliqués dans ces processus de fonction barrière cutanée et de les caractériser dans des modèles biologiques in vitro/in vivo. Ainsi, au cours de ma thèse, il m'a été donné l'occasion de mettre en œuvre des méthodes d'analyses quantitatives en association avec des techniques d'imagerie très résolutives (microscopies confocale et électronique et analyse par microfaisceau d'ions) afin de caractériser : (i) la fonction barrière d'un modèle de peau d'oreille de porc maintenu en survie en définissant le comportement de l'homéostasie ionique en réponse à différents stress chimiques ou physiques (Collaboration Hélène Duplan, Institut de Recherche Pierre Fabre); (ii) l'impact sur la viabilité, l'accumulation et la distribution intracellulaire de nanoparticules (oxydes de titane) natives ou fonctionnalisées à l'aide d'agents fluorescents (FITC, Rhodamine) (Collaboration M.H. Delville, Institut de Chimie de la Matière Condensée de Bordeaux). Les résultats obtenus montrent la possibilité de définir (i) le rôle des ions dans la fonction barrière cutanée d'un modèle biologique maintenu en survie et exposé à différents stress, (ii) la toxicologie des nanoparticules manufacturées in vivo; (iii) leur devenir au sein de modèle biologique d'intérêt (kératinocytes).

Le récepteur à l'IGF1 (IGF-1R) ainsi que ses voies de régulation sous-jacentes ont été largement étudié pour leur importance au cours du développement et leur rôle mitotique sur divers types cellulaires. A l'échelle de la peau, l'IGF-1R contribue à l'homéostasie épidermique et est souvent associé au compartiment basal pour son effet pro-prolifératif. Très peu d'études ont montré son implication au niveau de la différenciation épidermique et celles-ci présentent des résultats contradictoires. Au cours du vieillissement, la peau s'amincit et la barrière épidermique présente des défauts de perméabilité. Parallèlement, l'activité de l'IGF- 1R, maximale à l'adolescence, diminue avec l'âge. Cette étude a contribué à éclaircir le rôle de l'IGF-1R sur la différenciation épidermique et à montrer un lien entre vieillissement, perte en qualité de la peau et diminution d'activité de l'IGF-1R. L'élaboration de modèles 2D et 3D mimant le vieillissement par diminution d'activité de l'IGF-1R, nous a permis de confirmer le rôle mitotique de l'IGF-1R sur les kératinocytes et les progéniteurs et de démontrer son effet régulateur sur la différenciation épidermique par augmentation ou diminution de ces marqueurs. L'IGF-1R renforce l'adhésion cellulaire sur différentes matrices, impliquant de possibles interactions avec les intégrines α6 et β1. Ces résultats ont été corrélés aux observations de biopsies de peaux jeunes et âgées. Nous avons aussi montré que l'IGF-1R conférait un état sénescent aux cellules soumises à de fortes doses d'H2O2. Ces travaux montrent ainsi que l'IGF-1R est nécessaire pour le processus de différenciation épidermique et pour en assurer sa protection face au stress oxydant

La ciguatéra est une forme d’intoxication faisant suite à l’ingestion de poissons contaminés par des toxines appelées « ciguatoxines ». Cette intoxication endémique des régions tropicales est un problème économique et de santé non négligeable qui tend à prendre de plus en plus d’ampleur. L’essor du tourisme, le réchauffement climatique et la hausse des exportations internationales de poissons tropicaux favorisent l’expansion de la ciguatéra aux parties du globe au climat tempéré, jusqu’alors peu concernées par cette maladie. Les enjeux thérapeutiques et économiques de la ciguatéra sont de taille puisqu’il n’existe aucun moyen rapide et fiable de détecter un poisson contaminé et qu’aucun traitement efficace permettant sa prise en charge n’a actuellement été établi.Le prurit, terme médical désignant les démangeaisons est un symptôme notamment associé aux maladies de peau qui impacte grandement la qualité de vie des patients qui en souffrent.Ces dernières décennies, de nombreuses études scientifiques ont permis de mieux comprendre sa physiopathologie. Le prurit est un symptôme fréquemment observé chez les personnes atteintes de ciguatéra, d’où l’appellation « la Gratte », souvent employée pour faire référence à la pathologie.Dans le but d’étudier les mécanismes cellulaires à l’origine du prurit et des autres troubles sensoriels cutanés survenant lors de la ciguatéra, nous avons étudié l’effet des ciguatoxines sur un modèle in vitro de neurones sensoriels cocultivés avec des kératinocytes. Nous avons mis en évidence la libération dans le surnageant des neuropeptides de l'inflammation neurogène, SP et CGRP. L'effet d'antagonistes sélectionnés a été testé afin mettre en évidence les médiateurs impliqués dans la libération de neuropeptides. Par ailleurs, la signalisation cellulaire sous-jacente de cette sécrétion de neuropeptides a été étudiée par des expériences d’imagerie calcique réalisées sur neurones et kératinocytes.Les résultats obtenus valident notre coculture en tant que modèle de choix pour l’étude in vitro des mécanismes cellulaires, et plus généralement, dans les troubles neurocutanés impliqués dans le prurit ciguatérique. Parmi les antagonistes testés, une molécule s’est avérée particulièrement intéressante pour inhiber les effets constatés de la toxine. Ces résultats originaux, obtenus avec l’antagoniste d’un médiateur du prurit, présentent une perspective thérapeutique nouvelle et prometteuse, pour répondre à un enjeu de santé publique futur. / Ciguatera fish poisoning (CFP) is a seafood poisoning occurring after contaminated fish fleshes ingestion containing toxins called « ciguatoxines » (CTXs). This illness, originating from tropical and subtropical areas, is an economic and health problems which becomes substantial in relation to international tropical fishes export and tourism development, as well as global warming rise. Those factors contribute to CFP sprouting in non-endemic temperate climate regions which were not until then concerned by CFP. Economic and health stakes of CFP are important since no reliable and ready-to-use detection system for CTXs in fishes have been developed, along with no relevant cure has been established to treat CFP.Pruritus, medical term refer to itch, is a clinical sign usually associated to skin diseases which strongly alter patients’ quality of life. Last decades, several studies allowed to better understand pruritus pathophysiology. Interestingly, people suffering from CFP frequently present pruritus, hence designation “La Gratte” or “La Gratel (le)” employed in endemic areas.The aim of these works was to study cellular and molecular mechanisms of CTXs at the root of neurological cutaneous troubles occurring in CFP. Here, we evaluated CTXs effects on in vitro model composed of sensory neurons cocultived with primary keratinocytes, quantifying neuropeptides known to be involved in pruritus. Compiling knowledges about CFP and pruritus pathophysiology, some antagonists were tested to neutralize CTXs-mediated neuropeptide release. To deal with signaling pathways in depth of neuropeptide exocytosis induced by CTXs, mechanism known to be accurately regulated by calcium homeostasis, calcium imaging experiments were performed.Results obtained in this project confirm the use of such a model to elucidate cellular mechanism of CFP pruritus, but also constitute an alternative in vitro tool to study chemicals inducing abnormal cutaneous senses. Among antagonists tested, one stands out from the crowd and was proved to be effective to inhibit CTXs-evoked effects studied. Those originals results, collected with antagonist of pruritus mediator, show new and promiscuous therapeutic prospects for future health concern.