京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24997号 / 医博第5031号 / 新制||医||1069(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 藤田 恭之, 教授 羽賀 博典, 教授 武藤 学 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

O câncer de pulmão é o tipo de câncer que apresenta o maior índice de mortalidade em todo o mundo. As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são as mutações pontuais no oncogene que codifica a GTPase KRAS. Apesar destas mutações estarem diretamente ligadas à oncogênese, terapias que visam inibir diretamente a proteína Ras falharam em ensaios clínicos. Uma das propriedades mais importantes na oncogênese é a aquisição de capacidade metastática tumoral. Desta forma, o objetivo deste projeto é identificar alvos terapêuticos que inibam as metástases tumorais induzidas pelo oncogene KRAS no pulmão. Com base em relatos recentes mostrando que a forma oncogênica de KRAS promove, não só a iniciação tumoral, mas também promove a aquisição de um fenótipo metastático, a hipótese deste projeto é que (1) a capacidade mestastática tumoral induzida por KRAS no pulmão é potencializada pela quinase IKKβ; e (2) que a inibição desta quinase reduzirá a capacidade invasiva celular e metastática tumoral. Esta hipótese foi formulada com base em estudos anteriores, os quais demonstraram que o principal substrato da IKKβ, o fator de transcrição NF-κB, é ativado por KRAS em tumores pulmonares in situ de forma dependente da IKKβ, que o NF-κB é capaz de promover metástase em diferentes modelos tumorais, e que a inibição da atividade da IKKβ com um inibidor farmacológico em um modelo animal de câncer de pulmão induzido por KRAS, diminui o crescimento tumoral e a progressão tumoral para graus histológicos mais avançados. Nosso objetivo era avaliar se a inibição de IKKβ é capaz de afetar a migração e invasão de células portadoras de mutação em KRAS in vitro e se a inibição de IKKβ é capaz de afetar a capacidade metatática dessas células in vivo. Primeiramente, avaliamos a expressão de enzimas relacionadas ao fenótipo metastático, as metaloproteinases de matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) e, também uma molécula intimamente relacionada ao processo de adesão mediado por integrinas, FAK (quinase de adesão focal), frente a inibição de IKKβ através de um inibidor farmacológico altamente especifico (Composto A) e frente a inibição genética de IKKβ por interferência de RNA (siRNA) em células A549 e H358. Avaliamos também a atividade das MMPs frente inibição genética de KRAS (siKRAS) e IKKβ (siIKKβ) e vimos que IKKβ parece modular a expressão ou atividade de MMP-9 e reduz a expressão de FAK. Já a expressão de MMP-2 não apresentou alteração. Posteriormente avaliamos migração na célula A549 e invasão nas células A549 e H358 com inibição de IKKβ, por ensaios Transwell, e observamos uma redução da migração e invasão celular in vitro. Em seguida, fomos gerar linhagens celulares paraa expressar luciferase, as linhagens A549 pLUC e H358 pLUC. Os clones A549 pLUC B4 e H358 pLUC F1 com inibição de KRAS e IKKβ por interferência de RNA, foram injetados pela veia da cauda nesses camundongos e as metástases foram monitoradas por imageamento in vivo. Houve metástases em 20% dos animais com siIKKβ na região anatômica da boca. Os animais que receberam siControle e siKRAS não apresentaram nenhuma metástase visível no equipamento, mas foi observado micrometástases nas análises histológicas dos pulmões. O resultado do experimento de metástase in vivo é inesperado, não só pelo fato de ocorrer no grupo experimental siIKKβ, mas também pelo local anatômico do tumor, sendo necessária uma maior investigação do papel de IKKβ nesse processo, podendo ser um resultado aleatório. Quando avaliamos em conjunto, nossos resultados sugerem que a quinase IKKβ desempenha um papel importante no fenótipo migratório e invasivo de células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica, contribuindo para a capacidade metastática. / Lung cancer is the leading cause of cancer deaths worldwide. The most frequent genetic changes found in lung cancer are driver mutations in the KRAS proto-oncogene. Even though KRAS mutations have been causally linked to the oncogenic process, therapies targeted to oncogenic RAS have failed in clinical trials. One of the main characteristics in oncogenesis is the ability of tumors to acquire metastatic capability. The objective of this project is to identify therapeutic targets that reduce KRASinduced lung cancer metastasis. Based on previous reports that oncogenic KRAS, drives not only tumor initiation, but also promotes a metastatic phenotype, the hypothesis of this project is that (1) the acquisition of metastatic ability induced by KRAS in the lung is potentiated by the IKK kinase; and (2) that IKKβ inhibition will reduce KRAS-induced cell invasive properties and KRAS-induced tumor metastasis. This hypothesis has been formulated on the basis of previous studies showing that the main IKKβ substrate, the transcription factor NF-κB, is activated by KRAS in lung tumors in situ in an IKKβ-dependent manner, that NF-κB is known to promote metastasis in different tumor models, and that pharmacological IKKβ inhibition in a KRAS-induced lung cancer mouse model reduces tumor growth and progression to higher histological tumor grades. Our goal was evaluate how inhibition of IKKβ affects migration and invasion of KRAS-positive lung cells in vitro and whether inhibition of IKKβ is capable of affecting the metatactic capacity of these cells in vivo. First, we evaluated the expression of enzymes involved in the metastatic phenotype, matrix metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) and also a molecule involved in the integrinmediated adhesion, FAK (focal adhesion kinase), we targeted IKKβ by a highly specific IKK inhibitor (Compound A) or with RNA interference in A549 and H358 cells. We also used colorimetric Matrix Biotrak Activity Assay System to measure the activity of MMPs with RNA interference for KRAS (siKRAS) and IKKβ (IKKβ) and we have seen that IKKβ appears to modulate the expression or activity of MMP-9 and decreases the expression of FAK. The expression of MMP-2 did not change. Then we evaluated migration in A549 cell and invasion in A549 and H358 cells with inhibition of IKK by RNA interference or with Compound A treatment in Transwell assays, and observed a significantly reduced cell migration and invasion in vitro. We then generated cell lines to express luciferase, the A549 pLUC and H358 pLUC lines. A549 pLUC B4 and H358 pLUC F1 cells with RNA interference for KRAS and IKKβ were injected in the tail vein in nude (balb/c) mice and metastases were monitored by in vivo imaging. There were metastases in 20% of IKKβ animals in the anatomical region of the mouth. Animals that received siControl and siKRAS had no visible metastasis in the live imaging, but micrometastases were observed in the histological analyzes of the lungs. The result of this experiment is unexpected, not only due to the fact that it occurs in the IKKβ experimental group, but also due to the anatomical site of the tumor, and a further investigation of the role of IKKβ in this process, can be a random result. When evaluated together, our results suggest that the IKKβ kinase plays an important role in the migratory and invasive phenotype of in KRAS positive lung cancer cells, contributing to metastatic capacity.

O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo. Mutações em KRAS são altamente prevalentes no câncer e têm sido diretamente associadas ao processo tumorigênico. Apesar disso, até hoje todas as terapias visando inibir KRAS diretamente falharam e a caracterização de alvos indiretos, importantes para a oncogênese mediada por KRAS, é fundamental para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer de pulmão. Nós mostramos previamente que as quinases Aurora A (AURKA) e B (AURKB) são alvos a jusante de KRAS, importantes para o crescimento, viabilidade e oncogenicidade de linhagens celulares derivadas de tumores pulmonares mediados por KRAS. Aqui, nós aprofundamos os nossos estudos para melhor caracterizar AURKA e AURKB como potenciais alvos terapêuticos no câncer de pulmão. Os objetivos deste trabalho foram (1) investigar o mecanismo de perda de viabilidade induzido pela inibição de AURKA e/ou AURKB; (2) avaliar como a inibição de AURKA e/ou AURKB afeta propriedades oncogênicas relacionadas à agressividade tumoral; e (3) como a inibição destas quinases afeta o crescimento tumoral in vivo. Para tanto, nós utilizamos dois modelos celulares: (1) células A549 e H358, que apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão estável e induzível de shRNAs contra AURKA ou AURKB, e (2) células tumorais H1703, que não apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão induzível de KRASG12V, tratadas ou não com inibidores farmacológicos das quinases Aurora. A inibição farmacológica ou por interferência de RNA de AURKA e/ou AURKB em células H358 e A549 reduziu a proliferação celular, sendo esta inibição acompanhada de anomalias mitóticas, além de aneuploidia e poliploidia. A inibição destas quinases também induziu morte celular in vitro, tanto em mitose, quanto em interfase. Mais interessantemente, a inibição farmacológica dual de AURKA e AURKB induziu morte celular in vitro em células H1703, somente na presença de KRASG12V, indicando que a inibição das quinases Aurora afeta preferencialmente células portadoras de mutações em KRAS. Além disso, a inibição de AURKA e/ou AURKB reduziu propriedades malignas celulares relacionadas à agressividade tumoral, como migração, invasão e adesão. Finalmente, a inibição de AURKA por RNA de interferência em células A549 também reduziu a formação de tumores in vivo. Entretanto, como a inibição destas quinases levou a anomalias mitóticas e à instabilidade genética, nós resolvemos investigar se a inibição de TPX2, um substrato e ativador de AURKA, poderia ser uma abordagem alternativa para inibir esta via em câncer de pulmão induzido por KRAS. Primeiramente, nós observamos nos nossos modelos celulares que KRAS regula positivamente a expressão de TPX2. Além disso, a inibição de TPX2 em células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica reduziu a viabilidade e proliferação celulares e induziu morte celular. Mais interessantemente, esses efeitos ocorreram preferencialmente em células que expressam KRAS oncogênica. Em conclusão, nossos resultados apoiam a hipótese de que a ativação de AURKA/TPX2 e AURKB por KRAS são eventos importantes no câncer de pulmão e sugerem a inibição destas vias, possivelmente em combinação com outras terapias citotóxicas, como uma nova abordagem terapêutica para o câncer de pulmão induzido por KRAS. / Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. KRAS mutations are widespread in lung cancer and have been causally linked to tumorigenesis. Nonetheless, therapies targeting KRAS directly have so far failed and characterization of indirect KRAS targets, which play important roles in KRAS-mediated oncogenesis, is crucial for the development of new therapies for lung cancer. We have previously shown that mitotic kinases Aurora A (AURKA) and B (AURKB) are downstream targets of oncogenic KRAS, important for the growth, viability, and oncogenicity of KRAS-transformed lung cancer cell lines. Here, we studied these kinases more in depth in order to better characterize them as potential therapeutical targets for KRAS-induced lung cancer. The aims of this study were (1) to investigate the mechanism leading to loss of viability upon AURKA and/or AURKB targeting; (2) to evaluate how AURKA and/or AURKB inhibition affects malignant properties associated with tumor aggressiveness; and (3) to determine whether AURKA and/or AURKB inhibition reduces KRAS-induced tumor growth in vivo. For that purpose, we used two cell-based models: (1) KRAS mutant A549 and H358 cells with stable and inducible shRNA-mediated knockdown of AURKA or AURKB, and (2) KRAS wildtype H1703 tumor cell lines, genetically engineered to inducibly express oncogenic KRASG12V treated or not with Aurora kinase pharmacological inhibitors. Targeting AURKA and/or AURKB pharmacologically or by RNA interference in H358 and A549 cells led to decreased cell proliferation, which was accompanied by mitotic abnormalities, leading to aneuploidy and hyperploidy. Aurora kinase targeting also induced cell death in vitro, both during mitosis and interphase. More importantly, AURKA and AURKB inhibition with a dual pharmacological inhibitor in H1703 cells induced cell death in vitro, but only in the presence of KRASG12V, indicating that Aurora kinase targeting affects preferentially lung cells harboring oncogenic KRAS. Furthermore, AURKA and/or AURKB targeting reduced malignant properties associated with tumor aggressiveness, such as cell migration, invasion and adhesion. Finally, AURKA targeting by RNA interference in A549 cells also reduced growth of xenograft tumors in vivo. Nonetheless, since Aurora targeting was associated with mitotic abnormalities and genetic instability, we decided to investigate if targeting TPX2, a substrate and an activator of AURKA, could constitute an alternative approach to targeting this pathway in KRAS-induced lung cancer. First, using our cell-based models, we determined that KRAS positively regulates TPX2 expression. In addition, TPX2 inhibition by RNA interference in KRAS-positive lung cells reduced cell viability and proliferation and induced cell death. Finally, these effects occurred preferentially in cells harboring oncogenic KRAS. In conclusion, our results support the hypothesis that activation of AURKA/TPX2 and AURKB by KRAS are important events in lung cancer and suggest inhibition of these pathways, possibly in combination with other cytotoxic therapies, as a new approach for KRAS-induced lung cancer therapy.

As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são mutações pontuais que ativam o oncogene KRAS. Embora estas mutações estejam causalmente relacionadas à oncogênese, até hoje diferentes abordagens para inibir as proteínas RAS diretamente não obtiveram sucesso. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis é necessário identificar os mecanismos moleculares ativados por KRAS que estão diretamente envolvidos com a aquisição de propriedades malignas importantes, como o desenvolvimento e a manutenção de um fenótipo tronco-tumoral pelas células iniciadoras de tumor (CITs). CITs, também conhecidas como células tronco-tumorais, são definidas como uma subpopulação de células tumorais capazes de se autorrenovar, iniciar a formação de tumores e sustentar o crescimento tumoral. O desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas a estas células é imprescindível para melhorar a eficácia da terapia antitumoral. Uma vez que KRAS está associada a manutenção de um fenótipo tronco-tumoral e ativa o fator de transcrição NF-kB através da quinase IKKβ para promover a tumorigênese pulmonar, nós hipotetizamos que a quinase IKKβ contribui para o fenótipo tronco-tumoral induzido por KRAS em câncer de pulmão. Nós utilizamos ensaios de formação de tumoresferas para enriquecer e avaliar a função de CITs das linhagens pulmonares positivas para KRAS A549 e H358. As células A549 e H358 formaram tumoresferas em cultura de baixa aderência e, quando comparadas às células derivadas da cultura aderente, as células oriundas da cultura de tumoresferas apresentaram maior crescimento clonogênico, maior expressão de genes associados ao fenótipo tronco por qPCR e maior atividade da quinase IKKβ. A inibição da atividade de IKKβ através de um inibidor farmacológico altamente específico (Composto A) diminuiu levemente a proliferação de células A549 e H358, sem resultar em morte celular significativa. Entretanto, a inibição da atividade ou da expressão de IKKβ por interferência de RNA reduziu a expressão de genes associados ao fenótipo tronco e diminuiu a formação de tumoresferas. A inibição da expressão de IKKβ em células A549 reduziu também a capacidade de autorrenovação de CITs. Estes resultados sugerem que IKKβ desempenha um papel importante na manutenção do fenótipo tronco-tumoral de CITs pulmonares induzidas por KRAS. Em seguida, nós demonstramos que a inibição da atividade de IKKβ afetou preferencialmente a proliferação celular e o crescimento clonogênico de células oriundas da cultura de tumoresfera, sugerindo que IKKβ desempenha um papel mais importante em CITs do que em células derivadas da cultura aderente. A análise por citometria de fluxo identificou que células derivadas da cultura de tumoresfera apresentam um enriquecimento para células CD24+ na linhagem A549 e células CD44+ na linhagem H358, sugerindo que estes possam ser marcadores promissores para purificação de CITs nestas linhagens. Adicionalmente, demonstramos, por ensaios de wound-healing de células A549 e H358, que a inibição da atividade de IKKβ reduziu a migração celular, uma outra uma propriedade aumentada em CITs. Além disso, mostramos que a atividade da quinase IKKβ em células A549 e H358 não depende das vias da MAPK ou PI3K/Akt. Interessantemente, a inibição combinada de IKK (um efetor downstream de KRAS) e de EGFR/ERRB2 (reguladores upstream de KRAS que ativam as vias MAPK e PI3K/Akt) reduziu de forma aditiva a formação de tumoresferas, proliferação e migração celular. Quando avaliados em conjunto, nossos resultados sugerem que a quinase IKKβ desempenha um papel importante na biologia de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica e que a inibição desta quinase sozinha ou em combinação com a inibição de outras vias pode representar uma estratégia terapêutica promissora a ser explorada para reduzir a recidiva e metástase no câncer de pulmão induzido por KRAS. / The most frequent genetic alterations in lung cancer are point mutations that activate the KRAS oncogene. Although these mutations are causally related to oncogenesis, different approaches to inhibit RAS proteins directly have not been successful to date. Therefore, for better therapeutic targets for lung cancer to become available, it is necessary to identify the molecular mechanisms activated by KRAS that are directly involved with important malignant features, such as the development and maintenance of a cancer stem-like phenotype by the tumour-initiating cells (TICs). TICs, also known as cancer stem cells, are defined as a subpopulation of tumour cells able to self-renew, promote tumour initiation, and sustain tumour growth. The development of therapeutic strategies to target these cells is imperative to improve the efficacy of antitumor therapy. Since KRAS is associated with the maintenance of a cancer stem-like phenotype and activates the transcription factor NF-kB through the IKKβ kinase to promote lung tumourigenesis, we hypothesised that IKKβ kinase contributes to the cancer stem-like phenotype induced by KRAS in lung cancer. We used tumoursphere formation assays to enrich and evaluate the function of TICs of KRAS-mutant cell lines A549 and H358. A549 and H358 cells formed tumourspheres in low adhesion culture and, when compared to cells grown in adherent culture, sphere-derived cells displayed increased clonogenic growth, higher expression of stemness genes by qPCR, and increased IKKβ kinase activity . Inhibition of IKKβ activity through a highly specific pharmacological inhibitor (Compound A) slightly decreased proliferation of A549 and H358 cells without inducing significant cell death. On the other hand, inhibition of IKKβ activity or expression by RNA interference reduced the expression of stemness genes and decreased tumoursphere formation. Inhibition of IKKβ expression in A549 cells also reduced TICs self-renewal . These results suggest that IKKβ plays an important role in maintaining the cancer stem-like phenotype of KRAS-driven lung TICs. Next, we demonstrated that IKKβ inhibition preferentially reduced cell proliferation and clonogenic growth of sphere-derived cells, suggesting that IKKβ plays a more important role in TICs than in adherent culture-derived cells. Flow cytometry analysis identified that sphere-derived cells display an enrichment for the surface marker CD24 in A549 cells and CD44 in H358 cells, indicating that these could be promising markers for the purification of TICs in these cell lines. Furthermore, we have shown by wound-healing assays of A549 and H358 cells that IKKβ inhibition reduced cell migration , another feature increased in TICs. In addition, we have shown that IKKβ activity in A549 and H358 cells does not depend on the MAPK or PI3K/Akt pathways. Interestingly, combined inhibition of IKKβ (a downstream effector of KRAS) and EGFR/ERBB2 (upstream regulators of KRAS that activate the MAPK and PI3K/Akt pathways) additively reduced tumoursphere formation, cell proliferation and migration. Taken together, our results suggest that IKKβ kinase plays an important role in the biology of KRAS-driven lung TICs, and that inhibition of this kinase alone or in combination with inhibition of other signalling pathways may represent a promising therapeutic strategy to be explored in order to reduce tumour recurrence and metastasis in KRAS-driven lung cancer.

As alterações genéticas mais frequentes em tumores de pulmão são mutações pontuais que ativam o oncogene KRAS. Apesar destas mutações estarem ligadas à oncogênese de forma causal, diferentes abordagens para inibir as proteínas RAS diretamente fracassaram na clínica. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis, será necessário identificar as vias sinalizadoras ativadas pela proteína KRAS, que são críticas para a oncogênese. O objetivo deste projeto foi identificar novos alvos terapêuticos na oncogênese pulmonar induzida pela KRAS. Este projeto se baseou na seguinte hipótese: (1) a KRAS oncogênica leva à ativação das quinases mitóticas Aurora A e/ou B e (2) que as quinases Aurora A e/ou B são alvos terapêuticos relevantes no câncer de pulmão induzido pelo oncogene KRAS. Esta hipótese foi formulada com base em estudos anteriores mostrando que a quinase Aurora A fosforila diretamente componentes das vias efetoras de RAS, e que a Aurora A e Aurora B cooperam com a RAS oncogênica na transformação maligna. Para testar esta hipótese, nós inicialmente determinamos se a forma oncogênica da KRAS induz a expressão das quinases Aurora A e B. Para tanto, nós usamos 3 modelos celulares: (1) uma linhagem primária epitelial pulmonar imortalizada e seu par isogênico transformado pela KRAS oncogênica; (2) células tumorais pulmonares H1703 manipuladas geneticamente para expressar a forma oncogênica da KRAS de forma induzível; e (3) células de adenocarcinoma pulmonar portadoras de mutações oncogênicas em KRAS H358 e A549 manipuladas geneticamente para expressar short hairpin RNAs (shRNAs) para KRAS de forma induzível. Em todos os casos, a expressão da forma oncogênica da KRAS se correlacionou positivamente com a expressão de Aurora A e B. Para validar as quinases Aurora A e B como alvos relevantes do ponto de vista terapêutico, nós usamos, nas células mencionadas acima, abordagens genéticas ou farmacológicas para inibir a expressão ou atividade das quinases Aurora A e B. Nas células A549 e H358, portadoras da forma oncogênica da KRAS, a inibição da expressão das quinases Aurora A ou B por interferência de RNA de forma induzível, bem como o tratamento com um inibidor dual destas quinases, reduziu o crescimento, viabilidade e tumorigenicidade celulares in vitro. Mais importante do que isso, no modelo celular primário isogênico, bem como na linhagem H1703 com expressão induzível de KRAS oncogênica, a inibição farmacológica dual das quinases Aurora A e B levou a uma redução no crescimento, viabilidade e tumorigenicidade celulares de forma dependente da presença da KRAS oncogênica, sugerindo que a inibição das quinases Aurora A e B afeta especificamente células transformadas pela KRAS. Em conclusão, nossos resultados apoiam a nossa hipótese de que as quinases Aurora são alvos da KRAS oncogênica no pulmão, e sugerem a inibição das quinases Aurora como uma nova abordagem para a terapia do câncer de pulmão induzido pela forma oncogênica da KRAS. / The most frequent genetic change found in lung tumors are activating point mutations in the KRAS gene, which have been causally linked to the oncogenic process. Unfortunately, different approaches to target RAS proteins for therapy have been unsuccessful. Therefore, in order to select better targets for lung cancer therapy, key cancer-relevant KRAS downstream pathways will need to be identified. The overall objective of this study was to identify novel therapeutic targets in KRAS-mediated lung cancer. This project was based on the following hypothesis: (1) KRAS activates mitotic kinases Aurora A and/or B; and (2) Aurora A and/or B are relevant therapeutic targets in KRAS-induced lung cancer. This hypothesis was formulated on the basis of published studies showing that Aurora A directly phosphorylates RAS effector pathway components, and Aurora A and B both cooperate with oncogenic RAS to promote malignant transformation. In order to test this hypothesis, we first determined whether oncogenic KRAS induces Aurora kinase expression. For that purpose, we used three different cell-based models: (1) an immortalized primary lung epithelial cell line and its isogenic KRAS-transformed counterpart, (2) H1703 lung cancer cell line engineered to express oncogenic KRAS inducibly, and (3) KRAS positive lung cancer cell lines H358 and A549 stably expressing inducible shRNAs targeting KRAS. In all cases, KRAS expression positively correlated with Aurora A and Aurora B expression. In order to validate Aurora A and/or B as therapeutically relevant KRAS targets in lung cancer, we used genetic and/or pharmacological approaches in the abovementioned cells to inactivate Aurora A or B. In KRAS positive H358 and A549 cell lines, inducible shRNA-mediated knockdown of Aurora A or B, as well as treatment with a dual Aurora A and B inhibitor, decreased growth, viability and tumorigenicity in vitro. More importantly, in the primary isogenic model and in the H1703 KRAS-inducible cell line, dual pharmacological inhibiton of Aurora A and B reduced growth, viability and tumorigenicity in an oncogenic KRAS-dependent manner. This suggests that Aurora kinase inhibition therapy can specifically target KRAS transformed cells. In conclusion, our results support our hypothesis that Aurora kinases are important KRAS targets in lung cancer and suggest Aurora kinase inhibition as a novel approach for KRAS-induced lung cancer therapy.

Οι ανθρώπινοι όγκοι συνοδεύονται από κάποιου βαθμού φλεγμονή. Οι παράγοντες του καρκινικού κυττάρου που προκαλούν και ρυθμίζουν τη φλεγμονή, καθώς και οι επιδράσεις της φλεγμονής αυτής πάνω στον ίδιο τον όγκο αποτελούν σημαντικά ερευνητικά ζητούμενα. Τρέχοντα δεδομένα υποστηρίζουν ότι συγκεκριμένες γενετικές βλάβες του καρκινικού κυττάρου αποτελούν σημαντικούς τελεστές της παρανεοπλασματικής φλεγμονής. Συγκεκριμένα, μεταλλάξεις του ογκογονιδίου Kras, συχνές σε καρκίνους των πνευμόνων, του παγκρέατος και του εντέρου πιθανά συντελούν στη δημιουργία ενός φλεγμονώδους-ογκοπροαγωγού μικροπεριβάλλοντος. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη του ρόλου των μεταλλάξεων Kras στη νεοπλασματική πρόοδο και την παρανεοπλασματική φλεγμονή. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε γονοτύπηση καρκινικών σειρών ποντικού για μεταλλάξεις Kras. Σε κυτταρική σειρά που φέρει ενεργοποιητική μετάλλαξη Kras αποσιωπήθηκε σταθερά η έκφραση του με shRNA. Η μητρική και η θυγατρική σειρές εμφυτεύθηκαν στο υποδόριο και τον υπεζωκότα ανοσοεπαρκών ποντικών. Η αποσιώπηση του Kras οδήγησε σε μικρότερου βαθμού φλεγμονή και νεοπλασματική αύξηση, σε σύγκριση με τους μητρικούς όγκους. Ο κύριος πληθυσμός ανοσολογικών κυττάρων στους όγκους ήταν CD45+CD11b+ μυελοκύτταρα, τα οποία πρόσφατα βρέθηκε πως ρυθμίζονται φαινοτυπικά στο σπλήνα. Η σπληνεκτομή δεν επηρέασε την ανάπτυξη υποδόριων όγκων και νεοπλασματικής φλεγμονής από μητρικά και shKras κύτταρα. Αντίθετα, η σπληνεκτομή είχε ευεργετικά αποτελέσματα σε ζωϊκό πρότυπο κακοήθους υπεζωκοτικής συλλογής οδηγώντας σε ελάττωση συσσώρευσης υγρού και φλεγμονωδών κυττάρων. Συμπερασματικά, οι μεταλλάξεις Kras φαίνεται να παίζουν ρόλο στη νεοπλασματική πρόοδο και τη σχετιζόμενη φλεγμονή, αλληλεπιδρώντας με κάποιο σπληνοεξαρτώμενο πληθυσμό μυελοκυττάρων. Οι δράσεις αυτού του κυτταρικού πληθυσμού εξαρτώνται από το νεοπλασματικό μικροπεριβάλλον. / The human tumors are accompanied with some kind of inflammation. The factors of the cancer cell that cause and regulate this inflammation, as well as the influence of this inflammation on the tumor itself constitute an important research aim. Current data argue that specific genetic damage of the cancer cell constitute important operands of the paraneoplastic inflammation. In particular, mutations of the oncogene Kras, common in cancers of the lungs, the pancreas and the colon, possibly contribute to the initiation of a an inflammatory-tumorpromoting microenvironment. The aim of the current thesis was the study of the role of the Kras mutations in the neoplastic progression and the paraneoplastic inflammation. For this purpose, genotyping of murine cancer cell lines for Kras mutations was performed. In cancer cell line with activating Kras mutation, the expression of the Kras was silenced through shRNA. Both the parental and the daughter cell lines were implanted both subcutaneously and in the pleural cavity of immunocompetent mice. The silencing of the Kras led to a lower rate of inflammation and neoplastic growth, in comparison with the parental tumors. The main immunological population in the tumors was CD45+CD11b+ myeloid derived cells which were recently found to be phenotypically regulated in the spleen. The splenectomy did not influence the growth of subcutaneous tumors or neoplastic inflammation from parental and shKras cells. In contrast, the splenectomy had positive results on animal model of malignant pleural effusion, leading to lower collection of liquid and inflammatory cells. In conclusion, the mutations of Kras are shown to play a role in the neoplastic progression and the associated inflammation, interacting with a spleen- dependent population of myeloid derived cells. The actions of this cell population depend on the neoplastic microenvironment.

As alterações genéticas mais frequentes em tumores de pulmão são mutações pontuais que ativam o oncogene KRAS. Apesar destas mutações estarem ligadas à oncogênese de forma causal, diferentes abordagens para inibir as proteínas RAS diretamente fracassaram na clínica. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis, será necessário identificar as vias sinalizadoras ativadas pela proteína KRAS, que são críticas para a oncogênese. O objetivo deste projeto foi identificar novos alvos terapêuticos na oncogênese pulmonar induzida pela KRAS. Este projeto se baseou na seguinte hipótese: (1) a KRAS oncogênica leva à ativação das quinases mitóticas Aurora A e/ou B e (2) que as quinases Aurora A e/ou B são alvos terapêuticos relevantes no câncer de pulmão induzido pelo oncogene KRAS. Esta hipótese foi formulada com base em estudos anteriores mostrando que a quinase Aurora A fosforila diretamente componentes das vias efetoras de RAS, e que a Aurora A e Aurora B cooperam com a RAS oncogênica na transformação maligna. Para testar esta hipótese, nós inicialmente determinamos se a forma oncogênica da KRAS induz a expressão das quinases Aurora A e B. Para tanto, nós usamos 3 modelos celulares: (1) uma linhagem primária epitelial pulmonar imortalizada e seu par isogênico transformado pela KRAS oncogênica; (2) células tumorais pulmonares H1703 manipuladas geneticamente para expressar a forma oncogênica da KRAS de forma induzível; e (3) células de adenocarcinoma pulmonar portadoras de mutações oncogênicas em KRAS H358 e A549 manipuladas geneticamente para expressar short hairpin RNAs (shRNAs) para KRAS de forma induzível. Em todos os casos, a expressão da forma oncogênica da KRAS se correlacionou positivamente com a expressão de Aurora A e B. Para validar as quinases Aurora A e B como alvos relevantes do ponto de vista terapêutico, nós usamos, nas células mencionadas acima, abordagens genéticas ou farmacológicas para inibir a expressão ou atividade das quinases Aurora A e B. Nas células A549 e H358, portadoras da forma oncogênica da KRAS, a inibição da expressão das quinases Aurora A ou B por interferência de RNA de forma induzível, bem como o tratamento com um inibidor dual destas quinases, reduziu o crescimento, viabilidade e tumorigenicidade celulares in vitro. Mais importante do que isso, no modelo celular primário isogênico, bem como na linhagem H1703 com expressão induzível de KRAS oncogênica, a inibição farmacológica dual das quinases Aurora A e B levou a uma redução no crescimento, viabilidade e tumorigenicidade celulares de forma dependente da presença da KRAS oncogênica, sugerindo que a inibição das quinases Aurora A e B afeta especificamente células transformadas pela KRAS. Em conclusão, nossos resultados apoiam a nossa hipótese de que as quinases Aurora são alvos da KRAS oncogênica no pulmão, e sugerem a inibição das quinases Aurora como uma nova abordagem para a terapia do câncer de pulmão induzido pela forma oncogênica da KRAS. / The most frequent genetic change found in lung tumors are activating point mutations in the KRAS gene, which have been causally linked to the oncogenic process. Unfortunately, different approaches to target RAS proteins for therapy have been unsuccessful. Therefore, in order to select better targets for lung cancer therapy, key cancer-relevant KRAS downstream pathways will need to be identified. The overall objective of this study was to identify novel therapeutic targets in KRAS-mediated lung cancer. This project was based on the following hypothesis: (1) KRAS activates mitotic kinases Aurora A and/or B; and (2) Aurora A and/or B are relevant therapeutic targets in KRAS-induced lung cancer. This hypothesis was formulated on the basis of published studies showing that Aurora A directly phosphorylates RAS effector pathway components, and Aurora A and B both cooperate with oncogenic RAS to promote malignant transformation. In order to test this hypothesis, we first determined whether oncogenic KRAS induces Aurora kinase expression. For that purpose, we used three different cell-based models: (1) an immortalized primary lung epithelial cell line and its isogenic KRAS-transformed counterpart, (2) H1703 lung cancer cell line engineered to express oncogenic KRAS inducibly, and (3) KRAS positive lung cancer cell lines H358 and A549 stably expressing inducible shRNAs targeting KRAS. In all cases, KRAS expression positively correlated with Aurora A and Aurora B expression. In order to validate Aurora A and/or B as therapeutically relevant KRAS targets in lung cancer, we used genetic and/or pharmacological approaches in the abovementioned cells to inactivate Aurora A or B. In KRAS positive H358 and A549 cell lines, inducible shRNA-mediated knockdown of Aurora A or B, as well as treatment with a dual Aurora A and B inhibitor, decreased growth, viability and tumorigenicity in vitro. More importantly, in the primary isogenic model and in the H1703 KRAS-inducible cell line, dual pharmacological inhibiton of Aurora A and B reduced growth, viability and tumorigenicity in an oncogenic KRAS-dependent manner. This suggests that Aurora kinase inhibition therapy can specifically target KRAS transformed cells. In conclusion, our results support our hypothesis that Aurora kinases are important KRAS targets in lung cancer and suggest Aurora kinase inhibition as a novel approach for KRAS-induced lung cancer therapy.

O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo. Mutações em KRAS são altamente prevalentes no câncer e têm sido diretamente associadas ao processo tumorigênico. Apesar disso, até hoje todas as terapias visando inibir KRAS diretamente falharam e a caracterização de alvos indiretos, importantes para a oncogênese mediada por KRAS, é fundamental para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer de pulmão. Nós mostramos previamente que as quinases Aurora A (AURKA) e B (AURKB) são alvos a jusante de KRAS, importantes para o crescimento, viabilidade e oncogenicidade de linhagens celulares derivadas de tumores pulmonares mediados por KRAS. Aqui, nós aprofundamos os nossos estudos para melhor caracterizar AURKA e AURKB como potenciais alvos terapêuticos no câncer de pulmão. Os objetivos deste trabalho foram (1) investigar o mecanismo de perda de viabilidade induzido pela inibição de AURKA e/ou AURKB; (2) avaliar como a inibição de AURKA e/ou AURKB afeta propriedades oncogênicas relacionadas à agressividade tumoral; e (3) como a inibição destas quinases afeta o crescimento tumoral in vivo. Para tanto, nós utilizamos dois modelos celulares: (1) células A549 e H358, que apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão estável e induzível de shRNAs contra AURKA ou AURKB, e (2) células tumorais H1703, que não apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão induzível de KRASG12V, tratadas ou não com inibidores farmacológicos das quinases Aurora. A inibição farmacológica ou por interferência de RNA de AURKA e/ou AURKB em células H358 e A549 reduziu a proliferação celular, sendo esta inibição acompanhada de anomalias mitóticas, além de aneuploidia e poliploidia. A inibição destas quinases também induziu morte celular in vitro, tanto em mitose, quanto em interfase. Mais interessantemente, a inibição farmacológica dual de AURKA e AURKB induziu morte celular in vitro em células H1703, somente na presença de KRASG12V, indicando que a inibição das quinases Aurora afeta preferencialmente células portadoras de mutações em KRAS. Além disso, a inibição de AURKA e/ou AURKB reduziu propriedades malignas celulares relacionadas à agressividade tumoral, como migração, invasão e adesão. Finalmente, a inibição de AURKA por RNA de interferência em células A549 também reduziu a formação de tumores in vivo. Entretanto, como a inibição destas quinases levou a anomalias mitóticas e à instabilidade genética, nós resolvemos investigar se a inibição de TPX2, um substrato e ativador de AURKA, poderia ser uma abordagem alternativa para inibir esta via em câncer de pulmão induzido por KRAS. Primeiramente, nós observamos nos nossos modelos celulares que KRAS regula positivamente a expressão de TPX2. Além disso, a inibição de TPX2 em células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica reduziu a viabilidade e proliferação celulares e induziu morte celular. Mais interessantemente, esses efeitos ocorreram preferencialmente em células que expressam KRAS oncogênica. Em conclusão, nossos resultados apoiam a hipótese de que a ativação de AURKA/TPX2 e AURKB por KRAS são eventos importantes no câncer de pulmão e sugerem a inibição destas vias, possivelmente em combinação com outras terapias citotóxicas, como uma nova abordagem terapêutica para o câncer de pulmão induzido por KRAS. / Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. KRAS mutations are widespread in lung cancer and have been causally linked to tumorigenesis. Nonetheless, therapies targeting KRAS directly have so far failed and characterization of indirect KRAS targets, which play important roles in KRAS-mediated oncogenesis, is crucial for the development of new therapies for lung cancer. We have previously shown that mitotic kinases Aurora A (AURKA) and B (AURKB) are downstream targets of oncogenic KRAS, important for the growth, viability, and oncogenicity of KRAS-transformed lung cancer cell lines. Here, we studied these kinases more in depth in order to better characterize them as potential therapeutical targets for KRAS-induced lung cancer. The aims of this study were (1) to investigate the mechanism leading to loss of viability upon AURKA and/or AURKB targeting; (2) to evaluate how AURKA and/or AURKB inhibition affects malignant properties associated with tumor aggressiveness; and (3) to determine whether AURKA and/or AURKB inhibition reduces KRAS-induced tumor growth in vivo. For that purpose, we used two cell-based models: (1) KRAS mutant A549 and H358 cells with stable and inducible shRNA-mediated knockdown of AURKA or AURKB, and (2) KRAS wildtype H1703 tumor cell lines, genetically engineered to inducibly express oncogenic KRASG12V treated or not with Aurora kinase pharmacological inhibitors. Targeting AURKA and/or AURKB pharmacologically or by RNA interference in H358 and A549 cells led to decreased cell proliferation, which was accompanied by mitotic abnormalities, leading to aneuploidy and hyperploidy. Aurora kinase targeting also induced cell death in vitro, both during mitosis and interphase. More importantly, AURKA and AURKB inhibition with a dual pharmacological inhibitor in H1703 cells induced cell death in vitro, but only in the presence of KRASG12V, indicating that Aurora kinase targeting affects preferentially lung cells harboring oncogenic KRAS. Furthermore, AURKA and/or AURKB targeting reduced malignant properties associated with tumor aggressiveness, such as cell migration, invasion and adhesion. Finally, AURKA targeting by RNA interference in A549 cells also reduced growth of xenograft tumors in vivo. Nonetheless, since Aurora targeting was associated with mitotic abnormalities and genetic instability, we decided to investigate if targeting TPX2, a substrate and an activator of AURKA, could constitute an alternative approach to targeting this pathway in KRAS-induced lung cancer. First, using our cell-based models, we determined that KRAS positively regulates TPX2 expression. In addition, TPX2 inhibition by RNA interference in KRAS-positive lung cells reduced cell viability and proliferation and induced cell death. Finally, these effects occurred preferentially in cells harboring oncogenic KRAS. In conclusion, our results support the hypothesis that activation of AURKA/TPX2 and AURKB by KRAS are important events in lung cancer and suggest inhibition of these pathways, possibly in combination with other cytotoxic therapies, as a new approach for KRAS-induced lung cancer therapy.

As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são mutações pontuais que ativam o oncogene KRAS. Embora estas mutações estejam causalmente relacionadas à oncogênese, até hoje diferentes abordagens para inibir as proteínas RAS diretamente não obtiveram sucesso. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis é necessário identificar os mecanismos moleculares ativados por KRAS que estão diretamente envolvidos com a aquisição de propriedades malignas importantes, como o desenvolvimento e a manutenção de um fenótipo tronco-tumoral pelas células iniciadoras de tumor (CITs). CITs, também conhecidas como células tronco-tumorais, são definidas como uma subpopulação de células tumorais capazes de se autorrenovar, iniciar a formação de tumores e sustentar o crescimento tumoral. O desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas a estas células é imprescindível para melhorar a eficácia da terapia antitumoral. Uma vez que KRAS está associada a manutenção de um fenótipo tronco-tumoral e ativa o fator de transcrição NF-kB através da quinase IKKβ para promover a tumorigênese pulmonar, nós hipotetizamos que a quinase IKKβ contribui para o fenótipo tronco-tumoral induzido por KRAS em câncer de pulmão. Nós utilizamos ensaios de formação de tumoresferas para enriquecer e avaliar a função de CITs das linhagens pulmonares positivas para KRAS A549 e H358. As células A549 e H358 formaram tumoresferas em cultura de baixa aderência e, quando comparadas às células derivadas da cultura aderente, as células oriundas da cultura de tumoresferas apresentaram maior crescimento clonogênico, maior expressão de genes associados ao fenótipo tronco por qPCR e maior atividade da quinase IKKβ. A inibição da atividade de IKKβ através de um inibidor farmacológico altamente específico (Composto A) diminuiu levemente a proliferação de células A549 e H358, sem resultar em morte celular significativa. Entretanto, a inibição da atividade ou da expressão de IKKβ por interferência de RNA reduziu a expressão de genes associados ao fenótipo tronco e diminuiu a formação de tumoresferas. A inibição da expressão de IKKβ em células A549 reduziu também a capacidade de autorrenovação de CITs. Estes resultados sugerem que IKKβ desempenha um papel importante na manutenção do fenótipo tronco-tumoral de CITs pulmonares induzidas por KRAS. Em seguida, nós demonstramos que a inibição da atividade de IKKβ afetou preferencialmente a proliferação celular e o crescimento clonogênico de células oriundas da cultura de tumoresfera, sugerindo que IKKβ desempenha um papel mais importante em CITs do que em células derivadas da cultura aderente. A análise por citometria de fluxo identificou que células derivadas da cultura de tumoresfera apresentam um enriquecimento para células CD24+ na linhagem A549 e células CD44+ na linhagem H358, sugerindo que estes possam ser marcadores promissores para purificação de CITs nestas linhagens. Adicionalmente, demonstramos, por ensaios de wound-healing de células A549 e H358, que a inibição da atividade de IKKβ reduziu a migração celular, uma outra uma propriedade aumentada em CITs. Além disso, mostramos que a atividade da quinase IKKβ em células A549 e H358 não depende das vias da MAPK ou PI3K/Akt. Interessantemente, a inibição combinada de IKK (um efetor downstream de KRAS) e de EGFR/ERRB2 (reguladores upstream de KRAS que ativam as vias MAPK e PI3K/Akt) reduziu de forma aditiva a formação de tumoresferas, proliferação e migração celular. Quando avaliados em conjunto, nossos resultados sugerem que a quinase IKKβ desempenha um papel importante na biologia de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica e que a inibição desta quinase sozinha ou em combinação com a inibição de outras vias pode representar uma estratégia terapêutica promissora a ser explorada para reduzir a recidiva e metástase no câncer de pulmão induzido por KRAS. / The most frequent genetic alterations in lung cancer are point mutations that activate the KRAS oncogene. Although these mutations are causally related to oncogenesis, different approaches to inhibit RAS proteins directly have not been successful to date. Therefore, for better therapeutic targets for lung cancer to become available, it is necessary to identify the molecular mechanisms activated by KRAS that are directly involved with important malignant features, such as the development and maintenance of a cancer stem-like phenotype by the tumour-initiating cells (TICs). TICs, also known as cancer stem cells, are defined as a subpopulation of tumour cells able to self-renew, promote tumour initiation, and sustain tumour growth. The development of therapeutic strategies to target these cells is imperative to improve the efficacy of antitumor therapy. Since KRAS is associated with the maintenance of a cancer stem-like phenotype and activates the transcription factor NF-kB through the IKKβ kinase to promote lung tumourigenesis, we hypothesised that IKKβ kinase contributes to the cancer stem-like phenotype induced by KRAS in lung cancer. We used tumoursphere formation assays to enrich and evaluate the function of TICs of KRAS-mutant cell lines A549 and H358. A549 and H358 cells formed tumourspheres in low adhesion culture and, when compared to cells grown in adherent culture, sphere-derived cells displayed increased clonogenic growth, higher expression of stemness genes by qPCR, and increased IKKβ kinase activity . Inhibition of IKKβ activity through a highly specific pharmacological inhibitor (Compound A) slightly decreased proliferation of A549 and H358 cells without inducing significant cell death. On the other hand, inhibition of IKKβ activity or expression by RNA interference reduced the expression of stemness genes and decreased tumoursphere formation. Inhibition of IKKβ expression in A549 cells also reduced TICs self-renewal . These results suggest that IKKβ plays an important role in maintaining the cancer stem-like phenotype of KRAS-driven lung TICs. Next, we demonstrated that IKKβ inhibition preferentially reduced cell proliferation and clonogenic growth of sphere-derived cells, suggesting that IKKβ plays a more important role in TICs than in adherent culture-derived cells. Flow cytometry analysis identified that sphere-derived cells display an enrichment for the surface marker CD24 in A549 cells and CD44 in H358 cells, indicating that these could be promising markers for the purification of TICs in these cell lines. Furthermore, we have shown by wound-healing assays of A549 and H358 cells that IKKβ inhibition reduced cell migration , another feature increased in TICs. In addition, we have shown that IKKβ activity in A549 and H358 cells does not depend on the MAPK or PI3K/Akt pathways. Interestingly, combined inhibition of IKKβ (a downstream effector of KRAS) and EGFR/ERBB2 (upstream regulators of KRAS that activate the MAPK and PI3K/Akt pathways) additively reduced tumoursphere formation, cell proliferation and migration. Taken together, our results suggest that IKKβ kinase plays an important role in the biology of KRAS-driven lung TICs, and that inhibition of this kinase alone or in combination with inhibition of other signalling pathways may represent a promising therapeutic strategy to be explored in order to reduce tumour recurrence and metastasis in KRAS-driven lung cancer.

This master´s thesis deals with the design of architectural study of new facility for Sanatorium with speleotherapy for children Ostrov u Macochy. The construction area is located in the protected landscape area of Moravsky kras, near small town Ostrov u Macochy in Blansko county. The main ambition of this study is to fully use the potential of target area. Children sanatorium mainly focuses on the treatment of respiratory diseases by using speleotherapy. They use nearby cave system for these purposes. This project consists of three main buildings – accommodation for patients, sanatorium and guest house. These objects are designed as well-functioning and cooperative complex which along with pleasant surroundings will satisfy all requirements needed for operating such a facility. The urban solution allows easy access to the centre of city Ostrov u Machochy and also into therapeutic caves. The final form of this study respects all important aspects of affected area and tries to naturally integrate into surrounding nature.