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Volumeninduzierte Chloridströme wurden bereits in einer Reihe von Zelltypen charakterisiert. In dieser Arbeit wurde die Modulation volumenaktivierte Chloridströme ICl,Vol und der Signalweg zu ihrer Aktivierung untersucht. In Endothelzellen aus der Pulmonalarterie des Rindes (CPAE) wurden der Membranstrom unter Anwendung der 'patch clamp' - Technik und simultan dazu die Konzentration des freien intrazellulären Kalziums [Ca2+]i gemessen. Bisher wurde davon ausgegangen, daß die Aktivierung von ICl,Vol kalziumunabhängig erfolgt. In dieser Arbeit wurde ICl,Vol unter Pufferung des [Ca2+]i mit BAPTA und EGTA gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß freies intrazelluläres Kalzium in Konzentrationen niedriger als 50 nM zur Stromaktivierung notwendig ist. Bei einer höheren Konzentration verliert der Strom jedoch seine Kalziumabhängigkeit. Chromoglycinsäure (CL) blockiert ICl,Vol in Endothelzellen. Dieser Effekt ist jedoch im Vergleich zu dem klassischen Chloridkanalblocker NPPB geringer (Ki=15mM) und sehr langsam (im Mittel 100 s). Damit sind die blockierenden Eigenschaften auch geringer ausgeprägt als z.B. auf ICl,Vol und Hemmung der Serotoninsekretion in Mastzellen. Weiterhin war die Rolle von durch Proteinphosphorylierung modulierten intrazellulären Signalwegen bei der Aktivierung von ICl,Vol Gegenstand von Experimenten. Weder die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) durch direkte Applikation des Phorbolesters PMA noch deren Ab - Regulation durch 24-stündige Inkubation mit PMA hatten Einfluß auf die Aktivierung von ICl,Vol. Auch Wortmannin, ein Inhibitor sowohl der MAP - Kinasen (und damit des Tyrosinkinase - assoziierten Rezeptor - Signalweges) als auch der PI3 - Kinase, zeigte keinen Effekt auf ICl,Vol. Der Aktivator der MAP - Kinasen und der fokalen Adhaesionskinase p125FAK, die Substanz Lysophosphatsäure (LPA), zeigte weder einen Effekt auf ICl,Vol, noch konnte damit ein Chloridstrom induziert werden. Die Induktion von HSP durch Applizierung von thermischem und chemischem Streß unter Inkubation bei bis zu 45 °C über 60 min und Einwirkung von 0,3 mM Natriumarsenit zeigte keinerlei Einfluß auf ICl,Vol. Es konnte auch keine Aktivierung eines Chloridstromes beobachtet werden. Zur Untersuchung des Aktivierungsmechanismus von ICl,Vol dienten Experimente unter gleichzeitiger Messung von ICl,Vol, Membrankapazität (CM) und (jedoch zeitlich unabhängig voneinander) der Zellhöhe. Die Ergebnisse wurden an Hand dreier Modellvorstellungen zur Aktivierung von ICl,Vol diskutiert. Es bestand eine enge Korrelation zwischen Veränderungen der Zellhöhe und des aktivierten Stromes. Beide korrelieren jedoch nicht mit den Änderungen von CM. Dabei änderte sich CM bei einem Teil der Zellen praktisch nicht, d.h. geringer als 2% des Ausgangswertes vor Applikation hypotoner Lösung (n=17), bei den verbliebenen Teil zeigten sich deutliche Veränderungen von durchschnittlich 10,6 ± 0,9 % ( ± SEM, n=5). In letzterem Fall änderte sich jedoch immer zuerst ICl,Vol und dann CM. Nach Inhibierung des intrazellulären Vesikeltransports durch Brefeldin A war ICl,Vol ohne signifikante Änderungen auslösbar. Unter Cycloheximid, einem Blocker der Proteinsynthese auf Transkribtionssebene, wurden keine spezifischen Veränderungen von ICl,Vol beobachtet. Auf jeden Fall ist CM nicht der primäre Trigger für ICl,Vol. Die Aktivierung von volumeninduzierten Chloridströmen erfolgt nicht maßgeblich durch die Inkorporierung von Ionenkanal - Proteinen enthaltenden Membranvesikeln. / Volume-induced chlorid currents are characterised for many types of cells. I have investigated the modulation and activation of these currents. In cultered pulmonary artery endothelial cells (CPAE) patch clamp maesurements of membrane currents and simultaneous maesurements of free intracellular calcium ([Ca2+]i) were performed. Until now, activation of ICl,Vol was characterised as Calcium-independently. I maesured the current buffering [Ca2+]i with the Calcium chelators BAPTA and EGTA. It could be observed, that [Ca2+]i at concentrations less than 50 nM is required to activate ICl,Vol. At higher concentrations, there is no modulation by [Ca2+]i. Sodiumchromoglycate (CL) blocks ICl,Vol in endothelium cells. This effect is small (Ki=15mM) and slow (100 s) as compared of those of the classical chlorid channel blocker NPPB. Inhibitory effects of CL to ICl,Vol in endothelial cells are weaker than to ICl,Vol and to secretion of serotonin in mast cells. The role of intracellular phosphorylation signal pathways on activation of ICl,Vol was investigated. Neither activation of protein kinase C (PKC) throught direct application of the phorbol ester PMA nor down-regulation through preincubation with PMA had any effect on activation of ICl,Vol. Also Wortmannin, an inhibitor of MAP-kinases, failed to have significant effects on I

Bergmann Gliazellen reagieren auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Ihrem Soma Kalziumsignalen. Diese Signale sind sensitiv gegenüber den Antagonisten TTX, kalziumfreie Lösung und Cadmium. Ein Antagonist spannungaktivierter Kaliumkanäle, der synaptische Ereignisse verlängert, führt zu erheblich verstärkten Antworten. Um Kalziumantworten in Bergmann Gliazellsomata auszulösen ist eine erheblich stärkere elektrische Stimulation notwendig, als man für Kalziumantworten im Ausläufer der Zellen benötigt Es wurde eine Methode entwickelt, Raum-Zeit-Bilder von Kalziumantworten in Bergmann Gliazellausläufern auf elektrische Stimulation zu erzeugen. Die Darstellungen zeigen zeitlich und räumlich eingeschränkte Reaktionen auf teilen der Ausläufer. Beispiele für das Fortschreiten einer Kalziumwelle vom Ausläufer in das Zellsoma (oder umgekehrt) ließen sich nicht finden. Die räumlich Ausdehnung der beobachteten Signale unterstützt das in Grosche et al. (Grosche, et al, 1999) entwickelte Konzept von Mikrodomänen in Bergmann Gliazellausläufern. Die gemessenen Kalziumsignale sind nicht von den Kalziumspeichern des endoplasmatischen Retikulums abhängig. Dies schließt die Beteiligung G-Protein gekoppelter Rezeporen, die unter Aktivierung von endoplasmatischen IP3-Rezeptoren zu zytosolischen Kalziumsignalen führen, an der Generierung diese Signale aus. Die Beteiligung der Neurotransmitter Adrenalin, Noradrenalin, Histamin, Endothelin, Adenosin-tri-Phosphat und des Neurotransmitters Glutamat auf dem Wege der Aktivierung metabotroper Glutamatrezeptoren an der Detektion stimulationsvermittelter Kalziumsignale wurde über die Applikation spezifischer Antagonisten ausgeschlossen. Die Rolle von Glutamattransportern konnte nicht abschließend geklärt werden, da der Antagonist bei einer alleinigen Applikation zu einer Reduktion des Signals um 20 % führt. Bei einer Applikation mit geleertem endoplasmatischen Retikulum führt er zu einer Steigerung der Signalamplitude um 31.9 %. Die somatischen Kalziumantworten auf elektrische Stimula tion ließen sich zu einem Prozentsatz von 23.7 % durch den Antagonisten CNQX für ionotrope Glutamatrezeptoren vom AMPA/Kainat-Typ blockieren. In Bergmann Gliazellen sind diese Rezeptoren anders als in Neuronen kalziumpermeabel (Müller et al, 1992), da diese Zelle nicht die Untereinheit GluR2 des Kanals exprimieren. Es wurde eine funktionelle Bedeutung dieser Genexpression in der Detektion synaptischer Aktivität nachgewiesen. / Bergmann glia cells react to electrical stimulation of parallel fibers with calcium signals in their somata. These signals are sensitive against antagonists of neuronal activity, namly TTX calcium free solution and cadmium. An antagonist of voltage activated potassium channels, which is able to prolong synaptic events, leads to increased calcium responses. To elicit calcium responses in Bergmann glia somata much stronger stimulation compared to these required to elicit calcium responses in Bergmann glia processes is needed. A method was developed to get space-time images of calcium responses to electrical responses in Bergmann glia processes. The images show reactions restricted in time and space in parts of the processes. Examples of processing of calcium waves from the processes to the somata (or the other way around) could not be found. The special expansion of the observed signals supports the concept of micro domains as developed by Grosche et al. (Grosche, et al, 1999). Calcium signals measured do not d epend on the calcium stores of the endoplasmatic reticulum. This excludes the involvment of G-protein coupled receptors, which lead to cytosolic calcium signals via IP3-receptors, in the generation of these calcium signals. The involvment of the neurotransmitter adrenalin, noradrenalin, histamin, endothelin and adenosin-tri-phosphate in the generation of stimulation induced calcium signals was additionally excluded by the application of specific antagonists. The roll of glutamate transporter could not be fully clarified. The application of the antagonist l-PDC alone leads to a reduction of 20% of the signals amplitude, while the application in presence of emptied endoplasmatic calcium stores leads to an increase by 31.9%. Somatic calcium responses to electrical stimulation were able to be blocked by 23.7 % using the antagonist CNQX specific for ionotrope glutamate receptors of the AMPA/Kainat-Typ. In Bergmann glia cells these receptors differ from the AMPA/Kainat-Typ receptors on neuron with regard to their c alcium permeability (Müller et al, 1992) as result of leak in expression of the GluR2 subunit. A functionel involvment of this specific gene expression in the detection of synaptic activity by Bergmann glia cells was proved.

Kalzium ist ein wichtiger intrazelluläre Botenstoff, der extrazelluläre Signale in zelluläre Antworten übersetzt. Oft werden externen Signale in wiederholte Anstiege der zytosolischen Kalziumkonzentration übersetzt, die als Oszillationen bezeichnet werden. Diese interdisziplinäre Arbeit kombiniert biologische Experimente, analytische Methoden der theoretischen Physik und Computersimulationen, um den Oszillationsmechanismus zu charakterisieren. Von wesentlicher Bedeutung ist dabei die räumlich inhomogene Verteilung der Kanäle, die Kanalcluster bilden. Dies induziert zusammen mit Pumpen große Konzentrationsgradienten in der Nähe von offenen Clustern, was zu einer hierarchischen Organisation führt. Unter diesem Gesichtspunkt erwartet man, dass Kalziumoszillationen stochastisch sind und auf räumlicher Wechselwirkung beruhen. Diese Hypothese wird im ersten Teil der Arbeit experimentell verifiziert, indem Oszillationen vier verschiedener Zellarten analysiert werden. Der Kalziumsignalweg nutzt thermisches Rauschen konstruktiv um globale Signale zu bilden. Dabei werden molekulare Fluktuationen durch die hierarchische Struktur auf die zelluläre Ebene gehoben. Dies steht im Gegensatz zu der jahrzehntelang weitläufigen Auffassung, dass Kalzium ein repräsentatives Beispiel eines zellulären Oszillators ist. Des weiteren macht dieses Ergebnis Kalzium zu einem ersten natürlichen Beispiel für "array enhanced coherent resonance". Im Modellierungsteil dieser Arbeit wird ein physiologisches Modell für die intrazelluläre Kalziumdynamik entwickelt, das die dreidimensionale Struktur von Zellen berücksichtigt. Es verwendet ein detailliertes Kanalmodell und berücksichtigt sowohl Diffusion als auch Reaktionen mit Puffern. Der entwickelte parallele Green''s cell Algorithmus generiert in Abhängigkeit von physiologischen Parametern das gesamte Spektrum der experimentell bekannten Kalziumsignale und spiegelt die experimentellen Daten des ersten Teils in nahezu perfekter Weise wider. / Calcium is an important second messenger in cells serving as a critical link between extracellular stimuli and their cellular responses. The external signals are translated often into repeated increases of the cytosolic calcium concentration what is referred as oscillations. This work uses an interdisciplinary approach combining experimental techniques from biology, analytical tools from theoretical physics and computer simulations to clarify the question of the oscillation mechanism and how cells can generate globally coordinated calcium signals originated from local stochastic channel dynamics. In this context, the spatial inhomogeneous distribution of channels forming channel clusters plays a key role. Together with calcium pumps and buffers, this induces huge functional concentration gradients close to open clusters, leading to a hierarchical organization of calcium signals. Thus, calcium oscillations are predicted to be stochastic and to have a spatial character. This hypothesis is justified experimentally in the first part of this thesis by analyzing calcium oscillations of four different cell types. Hence, calcium signaling constructively uses thermal noise to build global signals. This contradicts the current opinion of the last decades of calcium being a representative cellular oscillator. Moreover, this makes calcium a first natural example of array enhanced coherent resonance. In the modeling part of this work, a physiological model for intracellular calcium dynamics in three spatial dimensions is developed that takes the spatial arrangement of cells seriously. It uses a detailed channel model for the discrete release sites and takes into account diffusion and buffer interaction of calcium. In dependence on physiologic parameters, the developed parallel Green''s cell algorithm generates in a natural way the whole spectrum of experimentally known calcium signals and fits the experimental data of the first part in an almost perfect manner.

This thesis deals with a newly-developed model for the spatiotemporal calcium dynamics within presynaptic terminals. The model is based on single-protein kinetics and has been used to successfully describe different neuron types such as pyramidal neurons in the rat neocortex and the Calyx of Held of neurons from the rat brainstem. A limited number of parameters had to be adjusted to fluorescence measurements of the calcium concentration. These values can be interpreted as a prediction of the model, and in particular the protein densities can be compared to independent experiments. The contribution of single proteins to the total calcium dynamics has been analysed in detail for voltage-dependent calcium channel, plasma-membrane calcium ATPase, sodium-calcium exchanger, and endogenous as well as exogenous buffer proteins. The model can be used to reconstruct the unperturbed calcium dynamics from measurements using fluorescence indicators. The calcium response to different stimuli has been investigated in view of its relevance for synaptic plasticity. This work provides a first step towards a description of the complete synaptic transmission using single-protein data.

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