Focal cartilage defects (FCD) of the knee joint remain a difficult area of treatment for orthopaedic surgeons, as they often progress to generalized osteoarthritis (OA). Osteochondral autograft transfer (OAT) to the damaged cartilage area has shown promise, but this has been associated with pain and bleeding at the site of graft harvest. The use of mesenchymal stem cells (MSCs) in a matrix to regenerate articular cartilage has been proposed. This work describes a prospective case-control series comparing OAT with a novel, MSC-seeded scaffold graft in the stifle joints of healthy merino sheep. The triphasic grafts were composed of a beta-tricalcium phosphate osseous phase, an intermediate activated plasma phase and a collagen I hydrogel cartilage phase. The osseous and cartilage phases were seeded with autologous MSCs. All sheep underwent creation of a full-thickness, 4.0 mm diameter FCD (n=20) followed by six weeks of unrestricted activity, allowing the defects to degenerate naturally. At six weeks, half of the lesions were treated with OAT and half with the triphasic engineered grafts. At 6-month and 12-month follow-up, no significant differences were noted between groups with regard to overall histological scores. Macroscopic and biomechanical analysis at 12 months showed no significant differences between groups. In summary, autologous MSC-seeded implants showed comparable repair quality to OAT without the associated donor site morbidity.

Summary Juliane Schneevoigt „Investigation of time- and pressure-dependent expression of different components of the extracellular matrix by chondrocytes in vitro” Institute of Anatomy, Histology and Embryology of the University of Leipzig Submitted in June 2015 98 pages, 34 figures, 41 tables, 153 references keywords: cartilage, chondrocytes, hydrostatic pressure, bioreactor, qPCR Introduction Hyaline cartilage maintains the basic function of transmitting articular pressure load within synovial joints and therefore provides the basis for the movements of an organism. Being a small coverage of the joint surface, it shows a composition designed to match this function specifically. A high amount of proteoglycans and its associated water determines the elastic formability of the hyaline cartilage which allows the absorbance of pressure and shear forces. These proteoglycans, mainly based on aggrecan as core-protein, are embedded into a meshwork of collagen fibres, primarily formed of collagen type II. This composition is not to be understood as a static construct; moreover it is exposed to biophysical forces that permanently require a dynamic adaptation. This adaptation of the extracellular matrix formed by proteoglycans and collagen type II is organised by a small number of embedded chondrocytes, the cells of the hyaline cartilage. As chondrocytes are post-mitotic cells and due to the lack of vascularisation within hyaline cartilage, there is hardly any chance for regeneration of defects in order to maintain the integrity of the tissue. The resulting replacement is formed as fibrocartilage, which has not the capability to withstand the biodynamical forces within the joint. As these defects in hyaline cartilage represent a gross of the diseases of the musculoskeletal system, there is a high medical interest in the development of innovative cell-based therapies, as autologous chondrocyte transplantation (ACT) is one. With this type of therapy in vitro cultivated chondrocytes are seeded into a cartilage defect with the aim of producing hyaline cartilage. Aims of the study In the last decades the need for a detailed understanding of the biodynamics of cartilage became obvious for further development of therapies. The aim of this study was therefore to establish a cell culture system to provide an insight into the biodynamics of chondrocytes. Aside from the examination of the differentiation of in vitro cultivated chondrocytes and their synthesis of extracellular matrix as a function of the cultivation time, another aim of this study was to determine whether the application of hydrostatic pressure might have beneficial influence on the expression of extracellular matrix components by chondrocytes in vitro, in accordance with the hyaline cartilage. Material and methods Human articular chondrocytes were cultivated in vitro without the application of hydrostatic pressure in the first place. The cells were observed phase contrast microscopically and the distribution of collagen type I and II was detected immuncytochemically. In further experiments optical confluent chondrocytes were transferred to a bioreactor system applying a hydrostatic pressure of 5 or 10 bar with variable time periods of the pressure applied. Subsequently, the expression of collagen type I, collagen type II and aggrecan was investigated and quantified using qPCR and Western Blot. Chondrocytes cultivated exclusively without the application of hydrostatic pressure served as controls. In this pilot-study the samples were analysed using arithmetic mean and standard deviation to evaluate the power statistically. In addition, similar test conditions with marginal differences were pooled and the necessary sample size to meet a power of 80 % with an alpha error of 0.05 was calculated using the maximum potential standard deviation. In cases where this statistic power was obtained, an analysis of significance (\"One Way Analysis of Variance”) was carried out meeting a significance level under 0.05. Results During the cultivation of chondrocytes in vitro without hydrostatic pressure the length of the cultivation time did neither show an effect on the phase contrast microscopical morphology nor on the immuncytochemically detected distribution of collagen typ I and II. The application of increased hydrostatic pressure for 24 hours results in a 0.2-0.8-fold decrease of the expression of collagen type I and II and a 1.7-2.2-fold increase of aggrecan expression compared to the unloaded controls. This effect was more distinct with 5 bar but was accompanied by instabilities in the cell culture. This is why further investigations concentrated on the use of 10 bar pressure with subsequently shortened time period of the applied pressure. With short times of loading (1.5 and 3 hours) a pressure load of 10 bar led to a 0.8 fold decrease of the expression of collagen type I and II and showed a 1.6-2.4 fold increase of aggrecan expression. These qPCR results were supported by the protein expression of collagen type I, II and aggrecan detected in Western Blot. Conclusions A cell culture system was established to examine the effect of hydrostatic pressure on the expression of chondrocytes on the one hand, which can further be modified for the assembly of cell transplants on the other hand. Subsequently the results of this study led to a definition of cell culture conditions, stimulating the extracellular matrix production of chondrocytes towards the composition of hyaline cartilage. This was the case using a seeding density of 104 cells/cm2 and a pre-cultivation time of 6 days of normal pressure, followed by the application of 10 bar hydrostatic pressure for 1.5-3 h. With the help of this pilot-study a cell culture system was established to gain more information on biodynamics of hyaline cartilage. Moreover it is possible that this information will provide a basis for further development of cell based therapies of cartilage defects, such as ACT. / Zusammenfassung Juliane Schneevoigt „Untersuchung der zeit- und druckabhängigen Expression verschiedener Komponenten der extrazellulären Matrix durch Chondrozyten in vitro“ Veterinär-Anatomisches Institut der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Juni 2015 98 Seiten, 34 Abbildungen, 41 Tabellen, 153 Literaturangaben Schlüsselwörter: Knorpel, Chondrozyten, hydrostatischer Druck, Bioreaktor, qPCR Einleitung Der hyaline Knorpel gewährleistet die grundlegende Funktion der Druckübertragung innerhalb der synovialen Gelenke und stellt somit die Grundlage für die Bewegung des Organismus dar. Als schmaler Überzug der Gelenkflächen ist er in seinem Aufbau an diese Funktion spezifisch angepasst. Dabei bedingt der hohe Gehalt an Proteoglykanen und das an diese assoziierte Wasser die elastische Verformbarkeit des hyalinen Knorpels, die es ermöglicht, Druck- und Scherkräfte abzufedern. Die Proteoglykane, die hauptsächlich auf Aggrekan als Kernprotein basieren, sind in ein Maschenwerk kollagener Fasern eingelagert, welches im Wesentlichen durch Kollagen Typ II gebildet wird. Diese Zusammensetzung darf nicht als statisches Konstrukt verstanden werden. Vielmehr ist der hyaline Knorpel in vivo verschiedenen biophysikalischen Einflüssen ausgesetzt, die eine dynamische Anpassung erfordern. Solche Anpassungsvorgänge in Form einer Änderung der Zusammensetzung der aus kollagenen Fasern und Proteoglykanen bestehenden extrazellulären Matrix werden durch die wenigen eingelagerten Chondrozyten, die Zellen des hyalinen Knorpels, organisiert. Da die reifen Chondrozyten jedoch keine Zellteilungen aufweisen und dem hyalinen Knorpel eine Vaskularisierung fehlt, ist eine Defektregeneration kaum möglich, sodass eine Wiederherstellung der Integrität des Gewebes unterbleibt und stattdessen ein Ersatzknorpel, der Faserknorpel, gebildet wird, welcher den einwirkenden biodynamischen Belastungen jedoch nicht standhalten kann. Da die Defekte des hyalinen Knorpels einen Großteil der Erkrankungen des Bewegungsapparats darstellen und zudem die Arthrose als Langzeitfolge nach sich ziehen, besteht ein hohes medizinisches Interesse an der Entwicklung zellbasierter Therapieansätze, wie der Autologen Chondrozytentransplantation (ACT). Hierbei werden - bislang mit unterschiedlichen Erfolgen – in vitro kultivierte Chondrozyten mit dem Ziel, neuen hyalinen Knorpel zu bilden, in einen Knorpeldefekt eingebracht. Ziele der Untersuchungen In den letzten Jahrzehnten zeigte sich, dass die Entwicklung von Therapieansätzen zur Behandlung von Knorpeldefekten ein detaillierteres Verständnis des Knorpelgewebes und speziell dessen Biodynamik erfordert. Ziel dieser Arbeit war es daher, im Rahmen einer Pilotstudie, ein In-vitro-System zu etablieren, welches die Untersuchung der Biodynamik der Chondrozyten ermöglicht. Neben der Untersuchung der Morphologie der Chondrozyten und der durch sie synthetisierten extrazellulären Matrix in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit der Zellen, wurde die Fragestellung bearbeitet, ob durch die Wirkung eines hydrostatischen Drucks günstige Effekte in Hinblick auf die Expression einer extrazellulären Matrix, wie sie im hyalinen Knorpel vorliegt, erzielt werden kann. Materialien und Methoden Eine Primärkultur humaner artikulärer Chondrozyten wurde zunächst unter Standardzellkulturbedingungen und atmosphärischem Druck kultiviert. Die Zellen wurden phasenkontrastmikroskopisch und hinsichtlich der Verteilung von Kollagen Typ I und II immunzytochemisch untersucht. In den weiteren Versuchen wurden optisch konfluente Chondrozyten in einen Bioreaktor überführt und weiter unter einem hydrostatischen Druck von 5 oder 10 bar kultiviert. Dabei wurde die Dauer der Druckeinwirkung auf die Chondrozyten variiert. Das Expressionsmuster der so kultivierten Chondrozyten wurde quantitativ in Hinblick auf Kollagen Typ I und II sowie Aggrekan mittels qPCR und Western Blot untersucht. Dabei dienten jeweils Chondrozyten, die ohne erhöhte Druckbedingungen kultiviert wurden, als Kontrollen. In dieser Pilotstudie wurden die Proben unter Berechnung der Mittelwerte und Standardabweichung hinsichtlich ihrer statistischen Power ausgewertet. Neben dieser Analyse der Einzelergebnisse wurden die Versuchsbedingungen, die kaum Unterschiede in den Ergebnissen aufwiesen, in Gruppen zusammengefasst und mit Hilfe der größtmöglichen vorhandenen Standardabweichung der Stichprobenumfang eines Versuchs errechnet, welcher die statistische Power der Ergebnisse bei einem Alpha-Fehler von 0,05 auf 80% erhöht. In den Fällen, in denen diese Power erreicht wurde, erfolgte eine Untersuchung der Unterschiede auf Signifikanz („One Way Analysis of Variance“) bei einem Signifikanzniveau < 0,05. Ergebnisse Während der In-vitro-Kultivierung der Chondrozyten unter atmosphärischem Druck zeigte die Länge der Kultivierungszeit weder einen Einfluss auf die phasenkontrastmikroskopisch untersuchte Morphologie der Zellen noch auf die immunzytochemisch detektierte Verteilung des Kollagen Typ I und II. Die Wirkung eines erhöhten hydrostatischen Drucks (5 bar, 10 bar) für 24 Stunden führte zu einer Abnahme der Expression von Kollagen Typ I und Typ II auf das 0,2-0,8-fache bei gleichzeitiger Zunahme der Expression des Aggrekan auf das 1,7-2,2-fache, verglichen mit der unbehandelten Kontrolle. Dieser Effekt war bei 5 bar ausgeprägter als bei 10 bar, führte jedoch gleichzeitig zu einer starken Instabilität des Zellkultursystems. Vor diesem Hintergrund wurde für den höheren Druck (10 bar) die Zeitdauer der Druckeinwirkung verkürzt. Hierbei konnten bei kurzzeitiger Druckeinwirkung von 10 bar (1,5 und 3 Stunden) bei Erhalt der Zellen ähnliche Effekte erzielt werden wie für die Bedingung 5 bar, 24 Stunden. Die Expression von Kollagen Typ I und Typ II sank auf das 0,8-fache, wohingegen ein Anstieg der Aggrekanexpression auf das 1,6-2,4-fache erreicht wurde. Diese Ergebnisse der qPCR konnten durch die im Western Blot für Kollagen Typ I, II und Aggrekan detektierte Proteinexpression gestützt werden. Schlussfolgerungen Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein In-vitro-System etabliert, welches einerseits der Untersuchung des Einflusses von hydrostatischem Druck auf die Expression von Chondrozyten dienen und andererseits für die Herstellung von Zelltransplantaten weiter modifiziert werden kann. Die Ergebnisse der Untersuchungen führten zur Definition von Bedingungen für das In-vitro-System, unter denen die Expression der extrazellulären Matrix durch die Chondrozyten in Richtung der Zusammensetzung im hyalinen Knorpel stimuliert werden kann. Dies zeigte sich bei einer Aussaat der humanen Chondrozyten in einer Konzentration von 104 Zellen/cm2 und einer Vorkultivierungszeit von 6 Tagen unter Normaldruck, gefolgt von der Kultivierung unter hydrostatischem Druck von 10 bar für 1,5 bis 3 Stunden. Mit Hilfe dieser Pilotstudie wurde somit ein In-vitro-System etabliert, auf dessen Basis Untersuchungen durchgeführt werden können, die weiterführende Erkenntnisse zur Biodynamik des hyalinen Knorpels liefern und der zukünftigen Entwicklung zellbasierter Therapieansätze der Knorpeldefekte, wie der ACT, zu Gute kommen.

Magnetresonanztomographische Studie zur altersabhängigen Abbildung der Wachstumsknorpel des distalen Radius des Pferdes unter besonderer Berücksichtigung des Epiphysenfugenknorpels. Es wurden magnetresonanztomographische Untersuchungen von 28 Gliedmaßenabschnitten des distalen Radius im Alter von zwei Tagen bis 17 Jahren durchgeführt. Die Studie wurde an einem 1,5 Tesla Magnetom “Symphony“ (Siemens) in vier unterschiedlichen Sequenzen (T1-gewichtet T1w, T2-gewichtet T2w, Protonendichte PD, T2 Double Echo in Steady State T2-dess) und zwei Schnittebenen (dorsal, sagittal) durchgeführt. Die Darstellung der knorpeligen Wachstumsregionen des distalen Radius mit besonderem Hinblick auf seine Epiphysenfuge wurde deskriptiv erfasst und altersbedingte Unterschiede definiert. Die durchschnittliche Dicke des sich darstellenden Epiphysenfugenknorpels wurde in zwei Sequenzen (T1w und T2-dess) vermessen und in Bezug zu dem ansteigenden Alter des Probenmaterials gesetzt. Die Proben konnte man fünf Gruppen zuordnen. In Gruppe 1 konnten sowohl der Wachstumsknorpel der distalen Ossifikationszentren als auch die knorpeligen Anteile der Epi- und Apophysenfugen dargestellt werden. In der Gruppen 2 ließen sich die Apo- und Epiphysenfugen darstellen, in Gruppe 3 nur die Epiphysenfugen. Gruppe 4 beschrieb partiell geschlossene Epiphysenfugen und in Gruppe 5 stellten sich nur 88 noch Fugennarben dar. Eine alterskorrelierende Abnahme der mittleren Knorpeldicke der Epiphyse konnte mittels Vermessungen der Knorpelschichten nachgewiesen werden. Der hyaline Knorpel war mit den gewählten Sequenzen sehr gut beurteilbar. Der Wachstumsknorpel der Epi- und Apophysen stellte sich in den T1w und PD mit hell-intermediärer und in den T2w mit intermediärer Signalintensität dar. Die knorpeligen Anteile der Epi- und Apophysenfuge wurden in T1w intermediär bis hellintermediär, in T2w hell-intermediär und in der PD hell-intermediär bis hyperintens dargestellt. Angrenzende Strukturen wie die subchondrale Knochenplatte und die Mineralisationszone der Epiphysenfuge konnten in dunkel-intermediären bis hypointensen Signalen abgebildet werden. Die Magnetresonanztomographie (MRT) hat sich als geeignetes Verfahren erwiesen, die knorpeligen Strukturen der Wachstumsregion des distalen Radius des Pferdes bildlich wiederzugeben. Altersabhängige strukturelle Unterschiede konnten im MRT dargestellt werden. Damit leistet die vorgestellte Studie einen wichtigen Beitrag über die anatomischen Verhältnisse und deren physiologische Darstellung.

Nicht behandelte Knorpelschäden führen langfristig zum Verschleiß des Gelenks – der Arthrose. Eine vielversprechende Möglichkeit zur Behandlung von Knorpelschäden ist die Matrix-assoziierte Chondrozytenimplantation. In der vorliegenden Dissertationsarbeit sollte die neuartige Matrix NOVOCART® Inject der Firma TETEC® auf ihre Eignung für die Therapie von Knorpeldefekten untersucht und ihre potentiellen Effekte im Vergleich zu dem bereits in der klinischen Anwendung befindlichen Biomaterial Fibrin charakterisiert werden. Für diese Studie wurden bei insgesamt 12 Göttinger Minipigs jeweils zwei vollschichtige Defekte (Ø 6mm) auf den medialen Femurkondylen beider Knie gesetzt und mit humanen Chondrozyten, die entweder in NOVOCART® Inject oder Fibringel eingebettet waren, gefüllt. Zellfreie Träger dienten jeweils als Kontrolle. Nach zwei und vier Wochen wurde die Defektfüllung, Biokompatibilität, Wirtszellanlockung und der Verbleib der implantierten Zellen sowie die Regeneratqualität histologisch und auf Genexpressionsebene evaluiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass NOVOCART® Inject auch ohne Membranabdeckung eine gute Defektfüllung erzielt. Es ist biokompatibel und weist keine signifikant erhöhten Entzündungszeichen gegenüber Fibringel auf. Des Weiteren konnte eine vergleichbare Regeneratqualität im Vergleich zum Fibringel im porzinen Tiermodell erreicht werden. Unabhängig vom verwendeten Trägermaterial überdauerten die xenogen transplantierten Zellen im vorliegenden Defektmodell nur kurzfristig. Wir fanden Hinweise auf eine Immunreaktion unter Beteiligung von Makrophagen, die ursächlich für das Verschwinden der implantierten Zellen sein könnten. Die Ergebnisse unserer Untersuchungen stellen folglich die häufig diskutierte Theorie des immunpriviligierten Status der Chondrozyten in Frage.

Focal cartilage defects (FCD) of the knee joint remain a difficult area of treatment for orthopaedic surgeons, as they often progress to generalized osteoarthritis (OA). Osteochondral autograft transfer (OAT) to the damaged cartilage area has shown promise, but this has been associated with pain and bleeding at the site of graft harvest. The use of mesenchymal stem cells (MSCs) in a matrix to regenerate articular cartilage has been proposed. This work describes a prospective case-control series comparing OAT with a novel, MSC-seeded scaffold graft in the stifle joints of healthy merino sheep. The triphasic grafts were composed of a beta-tricalcium phosphate osseous phase, an intermediate activated plasma phase and a collagen I hydrogel cartilage phase. The osseous and cartilage phases were seeded with autologous MSCs. All sheep underwent creation of a full-thickness, 4.0 mm diameter FCD (n=20) followed by six weeks of unrestricted activity, allowing the defects to degenerate naturally. At six weeks, half of the lesions were treated with OAT and half with the triphasic engineered grafts. At 6-month and 12-month follow-up, no significant differences were noted between groups with regard to overall histological scores. Macroscopic and biomechanical analysis at 12 months showed no significant differences between groups. In summary, autologous MSC-seeded implants showed comparable repair quality to OAT without the associated donor site morbidity.

Biochemische Marker machen es möglich den Knorpelmetabolismus im Gelenk zu untersuchen. Derzeit gibt es wenige Kenntnisse über den Gelenkstoffwechsel nach operativen Knorpelbehandlungen. Diese experimentelle Studie betrachtet synoviale Veränderungen im Rahmen der Therapie fokaler osteochondraler Defekte im Grosstier, durch autologe Knorpelknochen-Zylinder und biphasische stammzellbasierte Konstrukte. Dazu wurde Synovialflüssigkeit von 11 Merinoschafen vor und bis zu 1 Jahr nach der Therapie analysiert. In dieser wurden die Zellzahl, Zelldifferenzierung, Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-6, Glykosaminoglykane und Matrixmetalloproteinasen bestimmt. Von besonderem Interesse waren dabei der Zeitpunkt der Defektbehandlung, mögliche Unterschiede zwischen den beiden Therapiegruppen und der zeitliche Verlauf der Marker. 1. Es konnte gezeigt werden, dass zum Zeitpunkt der Defektbehandlung synoviale Normbedingungen vorherrschten. Die Zellzahl, Lymphozyten, Granulozyten, der Tumornekrosefaktor-α, als auch die Matrixmetalloproteinasen hatten zur Implantation das Ausgangsniveau wieder erreicht. Lediglich der Glykosaminoglykan-Gehalt und die Monozyten lagen unterhalb ihrer Ausgangswerte. Dies lässt jedoch auf einen verminderten Knorpelabbau oder Umbau schliessen. Es ist somit nicht davon auszugehen, dass in unserem Defektmodell in eine akute inflammatorische Situation hineinimplantiert wurde. 2. Es zeigten sich in der Zellzahl, dem Tumornekrosefaktor-α, den Matrixmetalloproteinasen und den Glykosaminoglykanen, bei beiden Therapiegruppen keine signifikanten Unterschiede der Werte zu den einzelnen Zeitpunkten untereinander. Beide Gruppen verhielten sich im zeitlichen Verlauf der Marker gleichläufig. Lediglich die Zeitpunkte der Maxima oder gelegentlich die Ausgangswerte variierten etwas voneinander. 3. Sowohl nach der Defektsetzung als auch nach der Therapie der Defekte kam es unabhängig von der Methode zu einem Anstieg der Zellzahl, Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, des Tumornekrosefaktor-α und der Matrixmetalloproteinasen. Dies lässt eine primäre inflammatorische Reaktion mit Umbau der Knorpelmatrix vermuten. Diese Marker erreichen ein erstes Maximum eine Woche nach Defektsetzung und ein Zweites zwei bis vier Wochen nach der Implantation. Die Matrixmetalloproteinasen zeigen einen nur geringen ersten und dann einen weitaus höheren Anstieg 24 Wochen nach der Therapie. Dies leiten wir von einer verspäteten Genexpression der Matrixmetalloproteinasen durch den Anstieg des Tumornekrosefaktor-α ab. Lediglich die Glykosaminoglykane sinken nach der Defektsetzung und der Therapie in ihrem Synovialflüssigkeitsgehalt ab. Dann nach vermehrter Matrixmetalloproteinasen-Ausschüttung steigen diese 24 Wochen nach der Therapie über den Ausgangswert an. Dies ist unabhängig von der Therapiemethode. Dies zeigt, dass der Knorpelmatrix-Umbau erst verspätet einsetzt. Ein Jahr nach der Knorpeltherapie zeigen sich anhand der letzten Messungen alleine die Lymphozyten und Monozyten der Gruppe mit biphasischen Konstrukten eine leichte Erhöhung über den Ausgangswert. Diese sind jedoch nicht signifikant. Die restlichen Knorpelmarker erreichen dann wieder Werte nahe des Ausgangsniveaus. Die Analyse von Knorpelmarkern bietet einen neuen und interessanten Ansatz zur Beurteilung operativer Knorpelbehandlungen. Jedoch gibt es derzeit noch keine spezifischen und standardisierten Marker zur Beurteilung des Gelenkknorpels. Angesichts der nur geringen Fallzahlen kann unsere Studie nur deskriptive Ergebnisse zum Gelenkstoffwechsel liefern. Zum genauen Verständnis und objektiven Einschätzen des Gelenkstoffwechsels bedarf es noch weiterer Studien.:INHALTSVERZEICHNIS I. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 5 II. EINLEITUNG 7 1. Gelenkknorpel 7 2. Knorpeldefekte 7 3. Knorpelmarker 9 3.1. Zytokine 10 3.2. Matrixmetalloproteinasen 10 3.3. Glykosaminoglykane 11 III. AUFGABENSTELLUNG 12 IV. MATERIAL UND METHODEN 13 1. Versuchstiere 13 2. Narkose und Vorbereitung 14 3. Defektsetzung 15 4. Bipahsisches Konstrukt Implantation 16 5. Osteochondrale Autograft Transplantation (OATS) 17 6. Defektentnahme 18 7. Zwischenpunktionen 18 8. Probenuntersuchung 18 9. Bestimmung der Zellzahl mittels Neubauer-Zählkammer 19 10. Fluorescence activated cell sorting (FACS) 20 11. Oviner IL-6 ELISA 21 12. Oviner TNF alpha ELISA: 23 13. MMP Collagenase Assay Kit 24 14. Glykosaminoglykane Dot Blot: 26 15. STATISTIK 28 V. ERGEBNISSE 30 1. Zellzahlen 30 1.1. Zellzahl x104/ml für Therapie 1 30 1.2. Zellzahl x104/ml für Therapie 2 32 1.3. Vergleich Zellzahl x104/ml 34 2. Zelldifferenzierung 34 2.1. R1 Therapie 1 34 2.2. R1 Therapie 2 36 2.3. Vergleich R1 38 2.4. R2 Therapie 1 39 2.5. R2 Therapie 2 41 2.6. Vergleich R2 43 2.7. R3 Therapie 1 44 2.8. R3 Therapie 2 46 2.9. Vergleich R3 48 3. Zytokine 49 3.1. TNF α Therapie 1 49 3.2. TNF α Therapie 2 51 3.3. Vergleich TNF α 53 3.4. IL-6 Therapie 1 und Therapie 2 54 4. Matrixmetalloproteinasen 54 4.1. MMP Therapie 1 54 4.2. MMP Therapie 2 56 4.3. Vergleich MMP 58 5. Glykosaminoglykane 59 5.1. GAG Therapie 1 59 5.2. GAG Therapie 2 61 5.3. Vergleich GAG 63 6. Zusammenfassung der Ergebnisse 64 VI. DISKUSSION 66 1. Material und Methodik 68 1.1. Probenentnahme 68 2. Ergebnisse 69 2.1. Knorpelmarker 69 3. Zellzahl 69 4. Zelldifferenzierung 71 4.1. R1 71 4.2. R2 73 4.3. R3 74 5. Zytokine 74 5.1. TNF α 74 5.2. IL-6 76 6. Matrixmetalloproteinasen 76 7. Glykosaminoglykane 78 VII. ZUSAMMENFASSUNG 80 VIII. LITERATURVERZEICHNIS 83 IX. SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 88 1. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 88 X. LEBENSLAUF 89 XI. DANKSAGUNG 90

Eine traumatische Läsion am artikulären Knorpel stellt eine noch ungelöste Herausforderung für den behandelnden Arzt dar. Bei den betroffenen Patienten handelt es sich häufig um junge, sportlich aktive Menschen im Arbeitsprozess {Hjelle et al. 2002}, bei denen eine längerfristige Belastungs- und Bewegungseinschränkung oder sogar eine Verminderung der Erwerbsfähigkeit zwingend vermieden werden muss. Jedoch existiert für den traumatischen Gelenkknorpelschaden derzeit noch keine Therapie mit sehr gutem, funktionellem Langzeitergebnis {Richter 2005}. Die konservativen Therapieformen haben immer eine narbige Ausheilung zur Folge. Aber auch mit der chirurgischen Basisversorgung, bestehend aus Debridement und Lavage des betroffenen Gelenks, kann keine Ausheilung erreicht werden. Regenerierende Verfahren, die auf der Grundlage der Penetration des subchondralen Knochens basieren, sollen durch das Einspülen von körpereigenen Stammzellen in den Defekt eine autologe Regeneration induzieren. Langzeitstudien zeigen, dass trotz der oft erreichten, guten funktionellen Ergebnisse histomorphologisch keine Wiederherstellung von intaktem, hyalinem Gelenkknorpel erreicht werden kann {Gaissmaier et al. 2003, Bernholt/Höher 2003}. Vielversprechende neue Therapiekonzepte liefert derzeit das „Tissue Engineering“ am Gelenkknorpel. Vor allem die Autologe Chondrozytentransplantation (ACT) eröffnet vollkommen neue Behandlungsstrategien. Bei der ACT werden arthroskopisch patienteneigene Chondrozyten gewonnen, die in dreidimensionale Gele eingesät und in Zellkultur gebracht werden. Durch verschiedene Stimulationstechniken werden die Zellen zur Proliferation und Produktion von Extrazellulärer Matrix (ECM), insbesondere Kollagen und Proteoglykan, angeregt. Nach drei bis sechs Wochen Kultivierung erfolgt die Implantation in den aufbereiteten Knorpeldefekt des Patienten. Aktuelle Studien konnten zeigen, dass das Transplantat mittelfristig ohne Narbenbildung in den bestehenden Gelenkknorpel einwächst und so die Inkongruenz des Gelenks, welche präarthrotisch wirkt, aufhebt {Brittberg et al. 1996, Peterson et al. 2000, Horas et al. 2000}. Um dieses neuartige Verfahren schnell im klinischen Alltag zu etablieren, bedarf es ausgereifter analytischer Methoden, die eine Qualitätsprüfung des biotechnologisch hergestellten Knorpels ermöglichen. MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) ist eine schnelle und sehr sensitive Methode, um die molaren Massen von Stoffen genau zu bestimmen und komplex zusammengesetzte Proben zu analysieren. Ziel dieser Arbeit war es, MALDI-TOF Massenspektrometrie als Analyseverfahren zu nutzen, um die Zusammensetzung des natürlichen Knorpels zu bestimmen und die hier gewonnenen Erkenntnisse auf biotechnologisch hergestellten Knorpel anzuwenden. Somit war die Überprüfung der Anwendbarkeit dieser massenspektrometrischen Untersuchungsmethode auf das komplexe biologische System Knorpel die erste Fragestellung in dieser Arbeit. Es erfolgte daher zunächst die Anpassung und Optimierung der Präparations- und Messmethoden mit dem Ziel, standardisierte Protokolle festzulegen, welche zu reproduzierbaren Spektren führen. Es schloss sich die Analyse der kommerziell verfügbaren Hauptbestandteile der ECM - Proteoglykane und Kollagene – mittels MADI-TOF MS an. Hierzu wurden Chondroitinsulfat und Kollagen verschiedener Typen enzymatisch verdaut und analysiert. So konnten Referenzspektren erstellt werden, welche die Grundlage für die Analyse des wesentlich komplexeren Systems des natürlichen Knorpels bildeten. Durch den Einsatz von Trypsin zur Hydrolyse nach thermischer Denaturierung des Kollagens wurde die Differenzierung zwischen den verschiedenen Kollagentypen ermöglicht. Es schlossen sich Studien zur Quantifizierung der enzymatischen Verdauungsprodukte der ECM an, welche das Ziel verfolgten, neben der stofflichen Zusammensetzung Aussagen zu den relativen Anteilen der einzelnen Bestandteile zu erlauben. Nachdem die grundsätzliche Eignung der Methode gezeigt werden konnte, diente der zweite Teil der hier dargelegten Forschungsarbeit der Beantwortung der Frage, ob die Erkenntnisse, welche bei der Analyse der Einzelbestandteile gewonnen wurden, auf natürliches Knorpelgewebe anwendbar sind. Der artikuläre Schweineknorpel ähnelt im Aufbau und den biomechanischen Eigenschaften dem menschlichen Knorpel. Da er zudem noch günstig und in adäquaten Mengen zur Verfügung gestellt werden kann, wurde der Gelenkknorpel des Schweins als Modellgewebe für die Anwendbarkeit der Methode auf natürlichen Knorpel genutzt. Ziel war es, die Hauptbestandteile der ECM einwandfrei zu identifizieren, Untersuchungen zur Quantifizierung anzustellen und Unterschiede zwischen den Knorpeltypen verschiedener Spezies nachzuweisen. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit erfolgte die Analyse von biotechnologisch hergestelltem Knorpel und somit die Anwendung der bisher erworbenen, vor allem einem theoretisch-wissenschaftlichem Interesse folgenden Erkenntnisse auf eine praktisch-klinische Fragestellung nach der tatsächlichen Beschaffenheit des zu transplantierenden Konstrukts. Dazu wurden Konstrukte, welche zum einem aus dreidimensionalen Agarosegele bestückt mit Chondrozyten, zum anderen aus Kollagengel mit eingesäten Stammzellen oder Chondrozyten bestanden, untersucht. Dieser Schritt erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Biotechnologisch-Biomedizinischen Zentrum Leipzig. Ziel war es, die bis dahin etablierten Probenpräparations- und Messbedingungen auf den künstlichen Knorpel anzuwenden und mit Referenzspektren von Bestandteilen der ECM sowie des natürlichen Schweineknorpels zu vergleichen. Durch die Analyse des Materials zu verschiedenen Kultivierungszeitpunkten sollte eine Aussage über die Qualität und die Menge der de novo synthetisierten ECM erreicht werden. Mit dieser Arbeit wurde die Grundlage geschaffen, die MALDI-TOF MS als geeignetes analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konstruktqualität einzuführen. Perspektivisch sollte es so möglich sein, die Qualität der Konstrukte, welche für die Autologe Chondrozytentransplantation bestimmt sind, zu bewerten und zu überwachen.

Articular cartilage damage caused by sports accidents, trauma or gradual wear and tear can lead to degeneration and the development of osteoarthritis because cartilage tissue has only limited capacity for intrinsic healing. Osteoarthritis causes reduction of mobility and chronic pain and is one of the leading causes of disability in the elderly population. Current clinical treatment options can reduce pain and restore mobility for some time, but the formed repair tissue has mostly inferior functionality compared to healthy articular cartilage and does not last long-term. Articular cartilage tissue engineering is a promising approach for the improvement of the quality of cartilage repair tissue and regeneration. In this thesis, a promising new cell type for articular cartilage tissue engineering, the so-called articular cartilage progenitor cell (ACPC), was investigated for the first time in the two different hydrogels agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) in comparison to mesenchymal stromal cells (MSCs). In agarose, ACPCs´ and MSCs´ chondrogenic capacity was investigated under normoxic (21 % oxygen) and hypoxic (2 % oxygen) conditions in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer. In the newly developed hyaluronic acid (HA)-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G), chondrogenesis of ACPCs and MSCs was also evaluated in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs like in agarose hydrogel. Additionally, the contribution of the bioactive molecule hyaluronic acid to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated in 2D monolayer, 3D pellet and HA-SH hydrogel culture. It was shown that both ACPCs and MSCs could chondrogenically differentiate in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels. In agarose hydrogel, ACPCs produced a more articular cartilage-like tissue than MSCs that contained more glycosaminoglycan (GAG), less type I collagen and only little alkaline phosphatase (ALP) activity. Hypoxic conditions did not increase extracellular matrix (ECM) production of ACPCs and MSCs significantly but improved the quality of the neo-cartilage tissue produced by MSCs. The creation of zonal agarose constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer led to an ECM production in zonal hydrogels that lay in general in between the ECM production of non-zonal ACPC and MSC hydrogels. Even though zonal co-culture of ACPCs and MSCs did not increase ECM production, the two cell types influenced each other and, for example, modulated the staining intensities of type II and type I collagen in comparison to non-zonal constructs under normoxic and hypoxic conditions. In HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogel, MSCs produced more ECM than ACPCs, but the ECM was limited to the pericellular region for both cell types. Zonal HASH/P(AGE-co-G) hydrogels resulted in a native-like zonal distribution of ECM as MSCs in the lower zone produced more ECM than ACPCs in the upper zone. It appeared that chondrogenesis of ACPCs was supported by hydrogels without biological attachment sites such as agarose, and that chondrogenesis of MSCs benefited from hydrogels with biological cues like HA. As HA is an attractive material for cartilage tissue engineering, and the HA-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) appeared to be beneficial for MSC chondrogenic differentiation, the contribution of HA to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated. An upregulation of chondrogenic gene expression was found in 2D monolayer and 3D pellet culture of MSCs in response to HA supplementation, while gene expression of osteogenic and adipogenic transcription factors was not upregulated. MSCs, encapsulated in a HA-based hydrogel, showed upregulation of gene expression for chondrogenic, osteogenic and adipogenic differentiation markers as well as for stemness markers. In a 3D bioprinting process, using the HA-based hydrogel, gene expression levels of MSCs mostly did not change. Nevertheless, expression of three tested genes (COL2A1, SOX2, CD168) was downregulated in printed in comparison to cast constructs, underscoring the importance of closely monitoring cellular behaviour during and after the printing process. In summary, it was confirmed that ACPCs are a promising cell source for articular cartilage engineering with advantages over MSCs when they were cultured in a suitable hydrogel like agarose. The performance of the cells was strongly dependent on the hydrogel environment they were cultured in. The different chondrogenic performance of ACPCs and MSCs in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels highlighted the importance of choosing suitable hydrogels for the different cell types used in articular cartilage tissue engineering. Hydrogels with high polymer content, such as the investigated HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels, can limit ECM distribution to the pericellular area and should be developed further towards less polymer content, leading to more homogenous ECM distribution of the cultured cells. The influence of HA on chondrogenic gene expression and on the balance between differentiation and maintenance of stemness in MSCs was demonstrated. More studies should be performed in the future to further elucidate the signalling functions of HA and the effects of 3D bioprinting in HA-based hydrogels. Taken together, the results of this thesis expand the knowledge in the area of articular cartilage engineering with regard to the rational combination of cell types and hydrogel materials and open up new possible approaches to the regeneration of articular cartilage tissue. / Gelenkknorpeldefekte, die durch Sportverletzungen, Unfälle oder graduelle Abnutzung ent-stehen, können zu Degeneration des Gewebes und zur Entstehung von Arthrose führen, da Knorpelgewebe nur über eine eingeschränkte Fähigkeit zur Selbstheilung verfügt. Arthrose reduziert die Beweglichkeit und verursacht chronische Schmerzen. Sie ist vor allem bei älte-ren Menschen einer der häufigsten Gründe für körperliche Behinderung. Die zurzeit verfüg-baren operativen Behandlungsmöglichkeiten können die Symptome meist für einige Zeit lindern, aber das dabei gebildete Ersatzgewebe zeigt meistens nur eingeschränkte Funktiona-lität im Vergleich zu natürlichem gesunden Knorpelgewebe und bleibt nur für eine begrenzte Zeit stabil. Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Qualität des Ersatzgewebes und der Knorpelregeneration zu verbessern. Diese Arbeit untersuchte einen neuen vielversprechenden Zelltyp für das Tissue Engineering von Knorpelgewebe, sogenannte Gelenkknorpel-Vorläuferzellen (ACPCs). Diese Zellen wurden erstmals in zwei verschiedenen Hydrogelen, Agarose und HA-SH/P(AGE-co-G), mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) verglichen. Die chondrogene Kapazität von ACPCs und MSCs in Agarose wurde unter normoxischen (21 % Sauerstoff) und hypoxischen (2 % Sauerstoff) Bedingungen in Monokultur und zonal geschichteter Kokultur untersucht. In den zonalen Kokulturen befanden sich ACPCs in einer oberen Schicht und MSCs in einer unte-ren Schicht. In dem neu entwickelten Hyaluronsäure (HA)-basierten Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) wurde die chondrogene Differenzierung von ACPCs und MSCs ebenfalls in Monokultur und in zonal geschichteter Kokultur, wie im Agarose-Hydrogel, analysiert. Außerdem wurde der Beitrag des biologisch aktiven Moleküls Hyaluronsäure zur chondro-genen Genexpression von MSCs in 2D-, 3D-Pellet- und HA-SH-Hydrogel-Kulturen unter-sucht. Diese Arbeit zeigte, dass sowohl ACPCs als auch MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen chondrogen differenzieren konnten. ACPCs produzierten im Agarose-Hydrogel ein Gewebe, das dem Gelenkknorpel ähnlicher war als das von MSCs produzierte Gewebe, da es mehr Glykosaminoglykane (GAG), weniger Typ I Kollagen und nur geringe Aktivität der Alkalinen Phosphatase (ALP) aufwies. Hypoxische Bedingungen konnten die Produktion von extrazellulärer Matrix (ECM) durch ACPCs und MSCs nicht erhöhen, aber sie verbesserten die Qualität des von MSCs produzierten Gewebes. Die Herstellung von zon-alen Agarose-Konstrukten mit ACPCs in der oberen Schicht und MSCs in der unteren Schicht führte zu einer ECM-Produktion in zonalen Hydrogelen, die im Allgemeinen zwi-schen der ECM-Produktion der ACPC-Monokultur und der MSC-Monokultur lag. Zonale Kokultur von ACPCs und MSCs führte zwar nicht zu einer erhöhten ECM-Produktion, al-lerdings beeinflussten die beiden Zelltypen sich gegenseitig und modulierten zum Beispiel die Intensitäten der Typ II und Typ I Kollagen Färbungen im Vergleich zu Monokulturen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen. Im HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel produzierten die MSCs mehr ECM als die ACPCs, allerdings war die Verteilung der gebilde-ten ECM bei beiden Zelltypen auf den perizellulären Bereich beschränkt. Zonale HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogele führten zu einer zonalen Verteilung von ECM, die der natürli-chen Struktur von Gelenkknorpel ähnlich war, da die MSCs in der unteren Schicht mehr ECM produzierten als die ACPCs in der oberen Schicht. Anscheinend wurde die chondroge-ne Differenzierung von ACPCs von Hydrogelen unterstützt, die, so wie Agarose, keine bio-logischen Bindestellen aufwiesen, und die Chondrogenese von MSCs profitierte von Hydro-gelen mit biologischen Signalen wie HA. Da HA ein attraktives Material für Tissue Engineering von Knorpel darstellt und das HA-basierte Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) anscheinend die chondrogene Differenzierung von MSCs begünstigte, wurde der Beitrag von HA zur chondrogenen Genexpression in MSCs untersucht. Eine Hochregulation der chondrogenen Genexpression ließ sich in 2D- und 3D-Pellet-Kulturen von MSCs als Reaktion auf HA beobachten, während die Genexpression von osteogenen oder adipogenen Transkriptionsfaktoren nicht hochreguliert wurde. Der Ein-schluss von MSCs in einem HA-basierten Hydrogel führte zu einer Erhöhung der Genex-pression von chondrogenen, osteogenen, adipogenen und Stemness-Markern. Ein 3D-Druck-Prozess mit dem HA-basierten Hydrogel veränderte die Genexpression von MSCs in den meisten Fällen nicht. Dennoch wurde die Expression von drei getesteten Genen (COL2A1, SOX2, CD168) in gedruckten im Vergleich zu gegossenen Konstrukten herunterreguliert. Dies unterstrich die Wichtigkeit einer genauen Kontrolle des Verhaltens der Zellen während und nach dem Druck-Prozess. Zusammenfassend ließen sich ACPCs als vielversprechender neuer Zelltyp für das Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe bestätigen. ACPCs haben Vorteile gegenüber MSCs, vor allem, wenn sie in einem passenden Hydrogel wie Agarose kultiviert werden. Die Leis-tung der Zellen war stark von den verschiedenen Hydrogelen und der Umgebung beeinflusst, die diese den Zellen darboten. Die unterschiedliche chondrogene Leistung von ACPCs und MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen zeigte deutlich die übergeordnete Relevanz der Auswahl von passenden Hydrogelen für die verschiedenen Zelltypen, die im Tissue Engineering von Gelenkknorpel Verwendung finden. Hydrogele mit einem hohen Polymergehalt, wie das eingesetzte HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel, können die Verteilung der gebildeten ECM auf den perizellulären Bereich beschränken und sollten weiterentwickelt werden, um einen niedrigeren Polymergehalt und damit eine homogenere ECM-Verteilung durch die kultivierten Zellen zu erreichen. Der Einfluss von HA auf die chondrogene Gen-expression und auf die Balance zwischen Differenzierung und Erhaltung der Stemness in MSCs ließ sich aufzeigen. In Zukunft sollten weitere Studien die Signalfunktionen von HA und den Einfluss des 3D-Drucks in HA-basierten Hydrogelen genauer zu untersuchen. Zusammengenommen erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit das Wissen im Bereich des Tissue Engineerings von Gelenkknorpelgewebe, vor allem in Bezug auf eine rationale Kom-bination von Zelltypen und Hydrogel-Materialien, und eröffnen neue Ansätze zur Knorpel-regeneration.

Chondrozyten stellen die zelluläre Komponente von hyalinem Knorpel dar, der die Gelenkflächen diarthrotischer Gelenke bedeckt. Über die perizelluläre Matrix (PZM) sind sie mit der extrazellulären Matrix des Knorpelgewebes, die im Wesentlichen aus Wasser, Kollagen-Typ-II (Koll-II) und Glykosaminoglykan (GAG) gebildet wird, verbunden. Die PZM gilt als wichtiges modulatorisches und protektives Element in der Signal- und Mechanotransduktion sowie für die Homöostase innerhalb des Knorpelgewebes. Degenerative und inflammatorische Prozesse führen zu irreparablen Schäden der Gewebearchitektur und -funktionalität. Die Regenerative Medizin strebt den Ersatz destruierter Gelenkflächen durch mittels Tissue Engineering hergestellten Neoknorpel an. 3D-Bioprinting gilt hier als attraktive Methode, nimmt jedoch über Scherkräfte während des Druckvorgangs auch schädigenden Einfluss auf das Überleben oder die Funktionalität der Zellen. Zielsetzung dieser Arbeit war es, den möglichen protektiven Einfluss der PZM während des Druckvorgangs zu untersuchen. Aus porcinem Frischknorpel isolierte Chondrozyten wurden nach cast bzw. 3D-Bioprinting in Agarose-Biotinte hinsichtlich ihres Überlebens und ihrer Syntheseleistung von knorpelspezifischem Koll-II und GAG untersucht. Chondrozyten ohne PZM wurden mit Chondrozyten verglichen, die nach enzymatischer Isolation noch perizellulär Kollagen-Typ-VI als Marker der PZM aufwiesen. Chondrozyten mit PZM zeigten allgemein eine stärkere Produktion von Koll-II als Chondrozyten ohne PZM. Nach 3D-Bioprinting konnte für Chondrozyten ohne PZM eine signifikant geringere Produktion von GAG nachgewiesen werden als in der cast-Vergleichsgruppe, während dies für Chondrozyten mit PZM nicht gezeigt werden konnte. Der gezeigte protektive Einfluss der PZM gegenüber Scherkräften während des Druckvorgangs eröffnet neue Methoden für das Cartilage Tissue Engineering. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um dies zu bestätigen und die Translation in die klinische Forschung ermöglichen. / Chondrocytes are the cellular component of the hyaline cartilage that lines the articular surfaces of diarthrotic joints. They are bound to the extracellular matrix of the cartilage tissue by the pericellular matrix (PCM), which consists mainly of water, collagen type II (coll-II) and glycosaminoglycan (GAG). PCM is considered to be an important modulatory and protective element in signalling, mechanotransduction and homeostasis within cartilage tissue. Degenerative and inflammatory processes cause irreparable damage to tissue architecture and functionality. Regenerative medicine aims to replace damaged joint surfaces with neocartilage produced by tissue engineering. 3D bioprinting is considered to be an attractive method for this purpose, but also has a detrimental effect on the survival or functionality of the cells due to shear forces during the printing process. The aim of this study was to investigate the potential protective effect of PZM during the printing process. Chondrocytes isolated from fresh porcine cartilage were analysed after casting or 3D bioprinting in agarose bioprinting for their survival and their ability to synthesise cartilage-specific Coll-II and GAG. Chondrocytes without PCM were compared with chondrocytes that still had pericellular collagen type VI as a marker of PCM after enzymatic isolation. Chondrocytes with PCM generally showed a higher production of Coll-II than chondrocytes without PCM. After 3D bioprinting, chondrocytes without PCM showed significantly lower GAG production than the control group, whereas chondrocytes with PCM did not. The demonstrated protective effect of PCM against shear forces during the printing process opens up new possibilities for cartilage tissue engineering. Further studies are needed to confirm this and to enable translation into clinical research.

Einleitung: Die Osteoarthritis ist für einen Großteil der Lahmheiten beim Pferd verantwortlich. Durch die starken Belastungen der equinen Gelenke schreitet die Osteoarthritis unweigerlich fort und setzt diese Tiere einem hohen Leidensdruck aus. Bisherige Therapien reichen nicht aus, um in osteoarthritischen Gelenken die physiologische Integrität des Knorpels wiederherzustellen. Humane und caprine nasale Knorpelzellen zeigten in präklinischen und klinischen Studien ein hohes Regenerationspotential und eine hohe Integrität nach autologer Implantation in Defekte des Gelenkknorpels. Dies wurde auf ihr „Hox-Gen-negatives“ Expressionsprofil zurückgeführt, das sich nach der Implantation dem des artikulären Knorpels anpasste. Ziel der Studie: Das Hox-Genexpressionsprofil nasaler Chondrozyten sollte mit denen artikulärer Chondrozyten in der Zellkultur verglichen werden, um den nasalen Knorpel auch beim Pferd als mögliche autologe Knorpelquelle zu identifizieren. Tiere, Material und Methoden: Knorpelgewebe wurde von 7 verstorbenen Pferden aus dem Nasenseptum und einem vorderen sowie hinterem Fesselgelenk entnommen, Chondrozyten isoliert und bis zur vierten Passage zweidimensional kultiviert. Während der Kultivierung wurden die Chondrozyten alle 3 bis 4 Tage mittelseines eigens erstellten Beurteilungsbogens evaluiert. Zellen aus der ersten (T1) und der dritten (T2) Subkultivierung wurden lysiert, die RNA extrahiert und in cDNA umgeschrieben. Es folgte eine qPCR, um die Expressionslevel von drei Hox-Genen (A3, D1, D8) und zwei knorpeltypischen Genen (SOX9, Kollagen II) an den drei verschiedenen Lokalisationen während T1 und T2 zu bestimmen. Die Quantifizierung der relativen Genexpression erfolgte anschließend mit der ΔΔCT-Methode unter Verwendung von RPL32 und GAPDH als Housekeeping-Gene. Zur statistischen Auswertung wurden die Multiple Lineare Regression, eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) und ein zweiseitiger t-Test herangezogen. Die Signifikanzniveaus aller statistischen Tests wurden auf α= 0,05 festgesetzt. Ergebnisse: Die Hox-Genexpressionen unterschieden sich in Bezug auf die drei Lokalisation und die Messzeitpunkte nicht signifikant voneinander. Die nasalen Chondrozyten wiesen während der ersten Subkultivierung gegenüber den artikulären Chondrozyten signifikant höhere Kollagen-II-Expressionen auf. Eine „Hox-Gen-negative“ Expression konnte für die Tierart Pferd nicht bestätigt werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Pferde wahrscheinlich ein speziesspezifisches Hox- Gen-Expressionsmuster aufweisen und dass die equinen Hox-Genexpressionsprofile statistisch signifikanten individuellen Einflüssen unterliegen. Schlussfolgerung: Das equine Hox-Genexpressionsprofil unterliegt statistisch signifikanten individuellen Einflüssen, die bei einer potenziellen Zelltherapie zu beachten sind. Nasale Chondrozyten eignen sich beim Pferd aufgrund ihrer genetischen Ähnlichkeit, bezogen auf die Expressionen der untersuchten Hox-Gene, zu artikulären Chondrozyten und ihrer hohen Bereitschaft zur Kollagen-II-Bildung wahrscheinlich als potenzielle Quelle für die autologe chondrozytäre Implantation (ACI).:1. Einleitung ...................................................................................................... 1 2. Literaturübersicht .......................................................................................... 2 2.1 Knorpel ..................................................................................................... 2 2.1.1 Allgemeiner Überblick ....................................................................... 2 2.1.2 Chondrogenese und Regeneration .................................................. 3 2.1.3 Intraartikulärer Hyaliner Knorpel ....................................................... 3 2.1.4 Extraartikulärer Hyaliner Knorpel....................................................... 6 2.2 Osteoarthritis bei Mensch und Pferd ........................................................ 8 2.2.1 Bedeutung und Ätiologie ................................................................... 8 2.2.2 Pathogenese ..................................................................................... 9 2.2.3 Diagnostik ........................................................................................ 10 2.2.4 Bisherige Therapieansätze .............................................................. 12 2.3 Knorpelgewebe in der Forschung .............................................................13 2.3.1 Kultivierung von Chondrozyten ......................................................... 13 2.3.2 Tiermodelle in der Osteoarthritisforschung ....................................... 15 2.3.3 Neue Therapieansätze ..................................................................... 17 2.3.3.1 Stammzellbasierte Verfahren ...................................................... 17 2.3.3.2 Artikuläre autologe Chondrozyten .............................................. 19 2.3.3.3 Nasale Chondrozyten ................................................................. 21 2.4 Hox-Gene ................................................................................................ 22 2.4.1 Allgemeiner Überblick ..................................................................... ..22 2.4.2 Regulation der Hox-Gene ................................................................. 23 2.4.3 Erkrankungen im Zusammenhang mit Hox-Genen ........................... 25 3. Ziel der Studie ........................................................................................... 27 4. Publikation ................................................................................................ 28 5. Diskussion................................................................................................. 45 5.1 Primer ....................................................................................................46 5.2 Auswahl der Messzeitpunkte und Proben ............................................. 47 5.3 Hox-Genprofile kultivierter equiner Chondrozyten ................................ 49 5.4 Individuelle Hox-Genprofile ................................................................... 50 5.5 SOX9 und Kollagen II .............................................................................51 5.6 Hox-Genprofile im Vergleich verschiedener Spezies ............................. 53 5.7 Ausblick ................................................................................................ 53 6. Schlussfolgerung ...................................................................................... 55 7. Zusammenfassung ................................................................................... 56 8. Summary .................................................................................................. 58 9. Referenzen .............................................................................................. 60 9.1 Literaturverzeichnis .............................................................................. 60 9.2 Abbildungsverzeichnis.......................................................................... 71 10. Anhang .................................................................................................. 72 10.1 Evaluierungsbogen Chondrozytenkulturen ........................................ 72 10.2 Auszug aus der Korrelationsmatrix ..................................................... 73 10.3 Publikationsverzeichnis Christiane Storch .......................................... 74 11. Danksagung .......................................................................................... 75 / Introduction: Osteoarthritis is responsible for most of the lameness in horses. Due to severe stress on equine joints, osteoarthritis inevitably progresses and results in a high degree of suffering. Current therapeutic options are not sufficient to restore the physiological integrity of the cartilage in osteoarthritic joints. Human and caprine nasal chondrocytes demonstrated high regenerative potential and integrity after autologous implantation into articular cartilage defects in preclinical and clinical studies. This was attributed to their “Hox gene negative” expression profile, matching the profile of articular cartilage after implantation. Aim of the study: The Hox gene expression profile of nasal chondrocytes was compared with those of articular chondrocytes in a cell culture to address nasal cartilage as a possible autologous source also in horses. Animals, Material and Methods: Cartilage was harvested from the nasal septum, one anterior and one posterior fetlock joint of deceased 7 horses, chondrocytes were isolated and cultured two-dimensionally until the fourth passage. During cultivation, chondrocytes were evaluated every 3 to 4 days using a specially designed assessment sheet. Cells were harvested during the first (T1) and third (T2) subcultivation. RNA was extracted and transcribed into cDNA. Subsequently, qPCR was performed to determine the expression levels of three Hox genes (A3, D1, D8) and two tissue-identifying genes (SOX9, collagen II) of the three locations after T1 and T2. Quantification of relative gene expression was performed with the ΔΔCT method using RPL32 and GAPDH as housekeeping genes. Multiple linear regression, one-way analysis of variance (ANOVA), and two-tailed t-test were used for statistical analysis. The significance levels of all statistical tests were set at α= 0.05. Results: Hox gene expressions were not significantly different in terms of localization and measurement time points. Nasal chondrocytes exhibited significantly higher collagen II expression than articular chondrocytes during the first subcultivation. 'Hox gene negative' expression could not be confirmed in horses. This study demonstrates that equine Hox gene expression pattern is likely species-specific and that equine Hox gene expression profiles are subject to statistically significant individual influences. Conclusion: The equine Hox gene expression profile is subject to statistically significant individual influences that should be considered in potential cell therapy. Nasal chondrocytes are probably suitable as a potential source for autologous chondrocyte implantation (ACI) in horses due to their genetic similarity, in terms of the expressions of the examined Hox genes, to articular chondrocytes and their high propensity for collagen II formation.:1. Einleitung ...................................................................................................... 1 2. Literaturübersicht .......................................................................................... 2 2.1 Knorpel ..................................................................................................... 2 2.1.1 Allgemeiner Überblick ....................................................................... 2 2.1.2 Chondrogenese und Regeneration .................................................. 3 2.1.3 Intraartikulärer Hyaliner Knorpel ....................................................... 3 2.1.4 Extraartikulärer Hyaliner Knorpel....................................................... 6 2.2 Osteoarthritis bei Mensch und Pferd ........................................................ 8 2.2.1 Bedeutung und Ätiologie ................................................................... 8 2.2.2 Pathogenese ..................................................................................... 9 2.2.3 Diagnostik ........................................................................................ 10 2.2.4 Bisherige Therapieansätze .............................................................. 12 2.3 Knorpelgewebe in der Forschung .............................................................13 2.3.1 Kultivierung von Chondrozyten ......................................................... 13 2.3.2 Tiermodelle in der Osteoarthritisforschung ....................................... 15 2.3.3 Neue Therapieansätze ..................................................................... 17 2.3.3.1 Stammzellbasierte Verfahren ...................................................... 17 2.3.3.2 Artikuläre autologe Chondrozyten .............................................. 19 2.3.3.3 Nasale Chondrozyten ................................................................. 21 2.4 Hox-Gene ................................................................................................ 22 2.4.1 Allgemeiner Überblick ..................................................................... ..22 2.4.2 Regulation der Hox-Gene ................................................................. 23 2.4.3 Erkrankungen im Zusammenhang mit Hox-Genen ........................... 25 3. Ziel der Studie ........................................................................................... 27 4. Publikation ................................................................................................ 28 5. Diskussion................................................................................................. 45 5.1 Primer ....................................................................................................46 5.2 Auswahl der Messzeitpunkte und Proben ............................................. 47 5.3 Hox-Genprofile kultivierter equiner Chondrozyten ................................ 49 5.4 Individuelle Hox-Genprofile ................................................................... 50 5.5 SOX9 und Kollagen II .............................................................................51 5.6 Hox-Genprofile im Vergleich verschiedener Spezies ............................. 53 5.7 Ausblick ................................................................................................ 53 6. Schlussfolgerung ...................................................................................... 55 7. Zusammenfassung ................................................................................... 56 8. Summary .................................................................................................. 58 9. Referenzen .............................................................................................. 60 9.1 Literaturverzeichnis .............................................................................. 60 9.2 Abbildungsverzeichnis.......................................................................... 71 10. Anhang .................................................................................................. 72 10.1 Evaluierungsbogen Chondrozytenkulturen ........................................ 72 10.2 Auszug aus der Korrelationsmatrix ..................................................... 73 10.3 Publikationsverzeichnis Christiane Storch .......................................... 74 11. Danksagung .......................................................................................... 75