Orientador: Carlos Alan Candido Dias Junior / Resumo: Durante a gestação, diversas adaptações fisiológicas ocorrem para suportar o feto em desenvolvimento. Em algumas mulheres, falhas nesses mecanismos podem causar desordens hipertensivas da gestação. A pré-eclâmpsia (PE) é uma desordem hipertensiva da gestação caracterizada por um de novo aumento na pressão arterial (> 140x90 mmHg), após a 20ª semana gestacional. É normalmente acompanhada de proteinúria e acomete 5-7% das gestantes. Atualmente é amplamente aceito que a fisiopatologia da PE envolve dois diferentes estágios: o primeiro, relacionado à má placentação e consequente isquemia/hipóxia placentária e liberação de fatores bioativos, e o segundo, relacionado à promoção de danos às células endoteliais. A disfunção endotelial é caracterizada por um aumento na liberação de substâncias vasoconstritoras, como a endotelina, e concomitante redução na liberação de substâncias vasodilatadoras, como o óxido nítrico (NO). Recentes estudos apontam para a importância do sulfeto de hidrogênio (H2S), uma molécula que apresenta diversas semelhanças com o NO, como a natureza gasosa e a produção por enzimas de localização endotelial. No sistema cardiovascular, o H2S exerce várias funções, como modulação da angiogênese e efeitos vasodilatadores, entretanto, poucos trabalhos avaliaram seu papel na hipertensão gestacional. Para a realização dos trabalhos, ratas Wistar prenhes foram utilizadas. Inicialmente a hipertensão gestacional foi induzida com o uso do inibidor da NO sintase (NOS), Nω-nit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Throughout gestation, several physiological adaptations occur to support the growing fetus. In some women, fails in these mechanisms may cause gestational hypertensive disorders. Preeclampsia (PE) is a gestational hypertensive disorder characterized by a de novo increase in arterial blood pressure (> 140x90 mmHg) after the 20th gestational week. It is normally accompanied by proteinuria and affects 5-7% of pregnant women. It is currently accepted that the physiopathology of PE involves two different stages: the first one is related to a bad placentation process, consequent placental ischemia/hypoxia and release of bioactive factors; and the second stage is related to the occurrence of endothelial cell damage. Endothelial dysfunction is characterized by an increased release of vasoconstrictors substances, such as endothelin, and a concurrent reduction in the release of vasodilators substances, such as nitric oxide (NO). Recent studies point to the importance of hydrogen sulfide (H2S), a molecule that shows several similarities with NO, such as its gaseous nature and the enzymatic production in endothelium. In cardiovascular system, H2S exerts numerous functions, such as angiogenesis modulation and vasodilators effects, however only a few studies evaluated H2S role in gestational hypertension. For the accomplishment of the works, pregnant Wistar rats were used. Initially, gestational hypertension was induced with the use of NO synthase (NOS) inhibitor, Nω-nitro-L-arginina-metil... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A better understanding of these structural changes that occur before Hypertension (HTN) could ultimately result in a treatment that can prevent or reverse this disease state before its onset. T cells have been shown essential for the development of HTN. The aim of these murine studies was to investigate the role of the T-helper CD4⁺ lymphocytes in initiating vascular remodeling and HTN in the absence of an increased mechanical load and to investigate the role of T-helper 17 (Th17) CD4⁺ lymphocyte initiating vascular remodeling and HTN by stimulating Lysyl Oxidase (LOX). LOX is known to cross-link collagen and elastin and. Excess synthesis of collagen and elastin results in a stiffer artery and hypertension. We established L-NAME-induce HTN in wild type (WT) mice. CD4⁺ splenic lymphocytes were isolated from these mice and adoptively transferred into naïve syngeneic severe combined immunodeficient (SCID) mice. The SCID mice receiving these cells became hypertensive. Cytokine analysis demonstrated an increase in both Th1 and Th17 cytokine in HTN donor mice and of lymphocytes in the aortic infiltrates of the HTN recipient mice. The increased collagen and LOX expression in recipient mice suggest that the adoptively transfer CD4⁺ lymphocytes are associated with vascular extracellular matrix remodeling. Furthermore we examined the role of Th17 lymphocyte in aortic LOX regulation in Angiotensin II-induced hypertension. The Increase in blood pressure and Velocity Time Integral (VTI) was measured in WT Angiotensin II treated mice whereas no change was detected in the Th17 deficient (RORT KO) Angiotensin II treated group. When compared to the control group the WT group infused with Angiotensin II had higher LOX protein expression, LOX fluorescent Immunohistochemical stain and LOX activity. This group also had increased hydroxyproline levels, collagen stain, hyperplasia and aortic thickening. In contrast, the Th17 deficient mice Angiotensin II treated group had no changes in these parameters. The results provide evidence that IL-17 mediates Angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction by the overstimulation of LOX. Potentially targeting T17 cells will allow for a drug-specific therapeutic approach and delay the progression of hypertension pathology.

Orientador: Carlos Alan Candido Dias Junior / Resumo: As desordens hipertensivas gestacionais são complicações que acometem em torno de 5-10% das gestações. Essas desordens são as maiores causas de morbidade e mortalidade tanto materna quanto fetal. Estudos demonstram redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) em doenças hipertensivas gestacionais, tornando uma das condições responsáveis por agravar a disfunção endotelial durante o curso desta doença. Neste sentido, trabalhos demonstram que a administração oral de nitrito de sódio (NaNO2) e a administração de citrato de sildenafil podem reverter a redução da biodisponibilidade de NO e potencializar a via de sinalização NO-GMPc respectivamente. Para realização dos trabalhos foram utilizadas ratas Wistar, no qual, após confirmação da prenhez receberam L-NAME i.p para indução da hipertensão e tratamentos com nitrito de sódio e/ou citrato de sildenafil via oral entre os dias 14-21 de prenhez. A pressão arterial sistólica foi aferida pelo método de pletismografia de cauda. Parâmetros materno-fetais como: peso fetal e placentário, número de fetos viáveis e reabsorvidos foram realizados após a morte das ratas no 21º dia gestacional. O plasma das ratas foram armazenados para dosagens dos níveis plasmáticos de nitrito+nitrato, guanosina monofosfato cíclico (GMPc), mieloperoxidase (MPO), peroxidação lipídica (TBARS), TEAC, MTT sFlt-1 e VEGF. Além disso o plasma das ratas foram incubadas com células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVECS) para avaliar a produção de NO endo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Gestational hypertensive disorders are complications that affect around 5-10% of pregnancies. These disorders are the major causes of both maternal and fetal morbidity and mortality. Studies have demonstrated a reduction in the bioavailability of nitric oxide (NO) in gestational hypertensive diseases, making it one of the conditions responsible for aggravate the endothelial dysfunction during the course of this disease. In this sense, studies demonstrate that oral administration of sodium nitrite (NaNO2) and administration of sildenafil citrate may reverse the reduction of NO bioavailability and potentiate the NO-cGMP signaling pathway, respectively. Wistar rats were used to perform the study, in which, after confirmation of pregnancy, they received L-NAME i.p for induction of hypertension and treatments with sodium nitrite and/or sildenafil citrate orally between days 14-21 of pregnancy. Systolic blood pressure was measured by the tail plethysmography method. Maternal-fetal parameters such as: fetal and placental weight, number of viable and reabsorbed fetuses were performed after the death of the rats on the 21st gestational day. Plasma of the rats were stored for plasma levels of nitrite + nitrate, cGMP, myeloperoxidase (MPO), lipid peroxidation (TBARS), TEAC, MTT sFlt-1 and VEGF. In addition the plasma of the rats were incubated with human umbilical vein endothelial cells (HUVECS) to evaluate endothelial NO production. In both studies, we found reduction of systolic blood... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Victor Hugo Gonçalves Rizzi (victor.rizzi@hotmail.com) on 2018-09-06T18:30:07Z No. of bitstreams: 1 tese victor.pdf: 3098588 bytes, checksum: c82c3535b448e04bc144e33e93ef47f9 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-09-11T19:49:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rizzi_vhg_dr_bot.pdf: 3098588 bytes, checksum: c82c3535b448e04bc144e33e93ef47f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-11T19:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rizzi_vhg_dr_bot.pdf: 3098588 bytes, checksum: c82c3535b448e04bc144e33e93ef47f9 (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As desordens hipertensivas gestacionais são complicações que acometem em torno de 5-10% das gestações. Essas desordens são as maiores causas de morbidade e mortalidade tanto materna quanto fetal. Estudos demonstram redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) em doenças hipertensivas gestacionais, tornando uma das condições responsáveis por agravar a disfunção endotelial durante o curso desta doença. Neste sentido, trabalhos demonstram que a administração oral de nitrito de sódio (NaNO2) e a administração de citrato de sildenafil podem reverter a redução da biodisponibilidade de NO e potencializar a via de sinalização NO-GMPc respectivamente. Para realização dos trabalhos foram utilizadas ratas Wistar, no qual, após confirmação da prenhez receberam L-NAME i.p para indução da hipertensão e tratamentos com nitrito de sódio e/ou citrato de sildenafil via oral entre os dias 14-21 de prenhez. A pressão arterial sistólica foi aferida pelo método de pletismografia de cauda. Parâmetros materno-fetais como: peso fetal e placentário, número de fetos viáveis e reabsorvidos foram realizados após a morte das ratas no 21º dia gestacional. O plasma das ratas foram armazenados para dosagens dos níveis plasmáticos de nitrito+nitrato, guanosina monofosfato cíclico (GMPc), mieloperoxidase (MPO), peroxidação lipídica (TBARS), TEAC, MTT sFlt-1 e VEGF. Além disso o plasma das ratas foram incubadas com células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVECS) para avaliar a produção de NO endotelial. Em ambos os trabalhos, nós encontramos redução da pressão arterial sistólica com nitrito e sildenafil, tanto isolado quanto em associação. Somente o sildenafil foi capaz de aumentar o peso fetal, enquanto o peso placentário foi melhorado por ambas as drogas. Tanto nitrito quanto sildenafil foram capaz de reduzir a reabsorção, possivelmente por aumentar a viabilidade fetal. Foi encontrado aumento de NO plasmático em todos os grupo que receberam nitrito, enquanto curiosamente a síntese de NO em HUVECS incubadas com plasma das ratas foi aumentada em ambas as drogas. Ainda em relação a cultura celular, nós encontramos aumento da viabilidade celular em ratas hipertensas tratadas com sildenafil. A concentração plasmática de GMPc estava aumentada em ratas normotensos que receberam sildenafil. Ambas as drogas apresentam efeito antioxidante, mas somente o sildenafil foi capaz de reduzir a atividade plasmática da MPO. Fatores angiogênicos (VEGF) e anti-angiogênicos (sFlt-1) presentes em doenças hipertensivas gestacionais estavam aumentados em ratas que receberam L-NAME, porém o nitrito de sódio foi capaz de reduzir esses fatores. Nosso dados sugerem que o nitrito e o sildenafil, tanto isolado 2 quanto em associação apresentam efeitos anti-hipertensivos e antioxidantes. Portanto, nossos resultados sugerem que a ativação da via NO-GMPc aumentou o fluxo sanguíneo na interface materno-fetal e protegeu contra a hipertensão e a restrição do crescimento fetal induzidas pelo L-NAME. / Gestational hypertensive disorders are complications that affect around 5-10% of pregnancies. These disorders are the major causes of both maternal and fetal morbidity and mortality. Studies have demonstrated a reduction in the bioavailability of nitric oxide (NO) in gestational hypertensive diseases, making it one of the conditions responsible for aggravate the endothelial dysfunction during the course of this disease. In this sense, studies demonstrate that oral administration of sodium nitrite (NaNO2) and administration of sildenafil citrate may reverse the reduction of NO bioavailability and potentiate the NO-cGMP signaling pathway, respectively. Wistar rats were used to perform the study, in which, after confirmation of pregnancy, they received L-NAME i.p for induction of hypertension and treatments with sodium nitrite and/or sildenafil citrate orally between days 14-21 of pregnancy. Systolic blood pressure was measured by the tail plethysmography method. Maternal-fetal parameters such as: fetal and placental weight, number of viable and reabsorbed fetuses were performed after the death of the rats on the 21st gestational day. Plasma of the rats were stored for plasma levels of nitrite + nitrate, cGMP, myeloperoxidase (MPO), lipid peroxidation (TBARS), TEAC, MTT sFlt-1 and VEGF. In addition the plasma of the rats were incubated with human umbilical vein endothelial cells (HUVECS) to evaluate endothelial NO production. In both studies, we found reduction of systolic blood pressure with nitrite and sildenafil, both alone and in combination. Both nitrite and sildenafil were able to reduce reabsorption, possibly by increasing fetal viability. No increase in plasma NO was found in all groups receiving nitrite, while curiously NO synthesis in HUVECS incubated with plasma from rats was increased in both drugs. Still in relation to cell culture, we found increased cell viability in hypertensive rats treated with sildenafil. Plasma cGMP concentration was increased in normotensive rats receiving sildenafil. Both drugs have an antioxidant effect, but only sildenafil was able to reduce plasma myeloperoxidase activity (MPO). Angiogenic (VEGF) and anti-angiogenic (sFlt-1) factors present in gestational hypertensive diseases were increased in rats receiving L-NAME, but sodium nitrite was able to reduce these factors. Our data suggest that both nitrite and sildenafil, both alone and in combination, have antihypertensive and antioxidant effects. Therefore, our results suggest that activation of the NO-cGMP pathway increased blood flow at the maternal-fetal interface and protected against hypertension and fetal growth restriction induced by L-NAME. / FAPESP 16/18782-3 / FAPESP 12/21305-1

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6356.pdf: 1279539 bytes, checksum: bba9a716eb38004d198f80a231efcc1b (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / Universidade Federal de Sao Carlos / Low and high LPS doses (endotoxin) have been used as models to study fever and endotoxic shock, respectively. In rats, systemic nitric oxide (NO) directly affects thermogenesis, but does not mediate those responses. Even though few studies in birds suggest NO as a pyrogenic signalling to brain, there is not enough evidence for confirming this suggestion. We hypothesise that, compared to mammals, systemic NO presents similar thermogenic action during endotoxin challenge in birds, even in early life. As precocial birds, chickens have a developed thermoregulatory capacity immediately after hatching, which constitutes an interesting model to study thermoregulation in early life. Thus, we investigated the role of NO in LPS-induced fever and endotoxic shock in 5-day-old chicks. The doses of 2 (LPS2) and 10 g kg-1 of LPS induced fever 3-5 hours after intramuscular (IM) injection, while 50 and 100 (LPS100) g kg-1 decreased Tc within the first hour followed by fever at 4-5 hours postinjection. Plasma nitrate levels increased 4 hours, but not 1 hour, after treatment with LPS2 and LPS100 (higher increase). There was no correlation between plasma nitrate concentrations and Tc at both LPS doses. L-NAME (non-selective NOS inhibitor; 50 mg kg-1; IM) inhibited LPS2- and LPS100-induced fever and increased the magnitude of the fall in Tc caused by LPS100. In contrast, no effect of L-NAME was observed in LPS-treated chicks in warm conditions. L-NAME decreased oxygen consumption in LPS2- and LPS100-treated chicks, but the response was more pronounced with LPS100. Moreover, LPS-induced huddling (heat conservation behaviour) was accentuated by LNAME. Our results seem to indicate that, like in rats, systemic NO is not a mediator of fever and endotoxic shock in chicks, but does affect thermogenesis in these animals, which may constitute a common effect of NO in the endothermic vertebr. / Doses baixas e altas de LPS (endotoxina de bactéria Gram negativa) são utilizadas como modelo para o estudo da febre e do choque endotoxêmico, respectivamente. Em ratos, o óxido nítrico (NO) sistêmico afeta diretamente a termogênese, mas não constitui um mediador da resposta febril. Alguns poucos estudos em aves, sugere uma sinalização pirogênica do NO no encéfalo, mas não há evidencias suficientes para confirmar essa sugestão. Nossa hipótese é que, em comparação com os mamíferos, o NO sistêmico apresenta ação termogênica similar durante desafio com endotoxinas em aves, mesmo no início da vida Sendo aves de desenvolvimento precoce, os frangos têm capacidade termorreguladora por mecanismos comportamentais e autonômicos imediatamente após a eclosão, o que constitui um modelo interessante para estudar a termorregulação no início da vida. Desse modo, nós investigamos o papel do NO na febre e no choque endotoxêmico induzidos por LPS em pintainhos de 5 dias de idade. LPS nas doses de 2 (LPS-2) e 10 g kg-1 induziu febre 3-5 horas após a injeção, enquanto que 50 e 100 (LPS-100) g kg-1 de LPS causaram queda da Tc na primeira hora seguida por febre 4-5 horas após a injeção. A menor (LPS-2; induz febre) e a maior (LPS-100; induz queda de Tc seguida por febre) doses de LPS foram escolhidas para a realização dos protocolos seguintes. As concentrações plamáticas de nitrito + nitrato aumentaram 4 horas, mas não 1 hora, após as injeções de LPS-2 e LPS-100 (maior aumento com a dose mais elevada). Não houve correlação entre os aumentos de Tc e as concentrações de nitrato nas duas doses de LPS. Injeções intramusculares de 50 mg/kg de L-NAME (inibidor não seletivo de NOS) inibiu a febre induzida por LPS-2 e LPS- 100, e aumentou a magnitude da queda de Tc provocada pelo LPS-100. L-NAME reduziu o consumo de oxigênio dos animais tratados com LPS-2 e LPS-100, sendo a queda mais acentuada nesse último grupo. Além disso, o comportamento de agrupamento (redução da perda de calor) induzido por LPS-100 foi acentuado pelo pre-tratamento com L-NAME. Por outro lado, nos pintainhos mantidos em ambiente quente, que não interferiu com a Tc dos animais, os efeitos do LPS-2 e LPS- 100 sobre a TC não foram afetados pelo L-NAME. Juntos esses resultados indicam que o NO parece não ser um mediador de febre e choque endotóxêmico em pintainhos, mas afeta a termogênese nesses animais, o que pode constituir um efeito comum do NO nos vertebrados endotérmicos.

Nitric oxide (NO) is a neurotransmitter which is synthesized on demand from L-arginine by the enzyme nitric-oxide-oxidase, and is implicated in a variety of physiological functions, including release and uptake of dopamine. Amphetamine induces stereotyped behavior via release of dopamine from dopaminergic neurons in the striatum and related structures, while apomorphine induces such behavior via activation of central dopaminergic receptors. Recently we have demonstrated that a NO donors and a NO-synthase inhibitor modify the response of some central dopaminergic receptors to their agonists and antagonists. In the present study we examined the effect of two NO donors and one NO-synthase inhibitor on stereotyped behavior induced in rats by amphetamine and apomorphine, and the sex-selectivity of this effect. A highly significant dose-dependent sexual differentiation was recorded in the stereotyped behavior of amphetamine, as the duration and intensity of this effect was shortened by L-NAME but not by L-arginine and Molsidomine. Differences in the stereotyped behavior between female and male rats administered apomorphine were dose-dependent, but were not affected by any of the three drugs tested. It is concluded that while nitric oxide is involved in the reactivity of central dopamine receptors, the intensity and duration of this effect is drug- and sex-dependent.

No / Cortical spreading depression (CSD) is a temporary disruption of local ionic homeostasis that propagates slowly across the cerebral cortex. Cortical spreading depression promotes lesion progression in experimental stroke, and may contribute to the initiation of migraine attacks. The purpose of this study was to investigate the roles of the marked increase of nitric oxide (NO) formation that occurs with CSD. Microdialysis electrodes were implanted in the cortex of anesthetized rats to perform the following operations within the same region: (1) elicitation of CSD by perfusion of high K+ medium; (2) recording of CSD elicitation; (3) application of the NO synthase inhibitor, NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME); and (4) recording of dialysate pH changes. The primary effect of L-NAME (0.3 to 3.0 mmol/L in the perfusion medium) was a marked widening of individual CSD wave, resulting essentially from a delayed initiation of the repolarization phase. This change was due to NO synthase inhibition because it was not observed with the inactive isomer D-NAME, and was reversed by L-arginine. This effect did not appear to be linked to the suppression of a sustained, NO-mediated vascular change associated with the superposition of NO synthase inhibition on high levels of extracellular K+. The delayed initiation of repolarization with local NO synthase inhibition may reflect the suppression of NO-mediated negative feedback mechanisms acting on neuronal or glial processes involved in CSD genesis. However, the possible abrogation of a very brief, NO-mediated vascular change associated with the early phase of CSD cannot be ruled out.

A úlcera gástrica é uma doença crônica, de alta prevalência, e a eficácia dos tratamentos farmacológicos disponíveis é limitada pela alta incidência de efeitos adversos. Neste trabalho é mostrado o mecanismo de ação terapêutica e os efeitos toxicológicos da molécula indol-tiazolidínica LYSO-7 em diferentes modelos experimentais de úlcera gástrica. Camundongos Swiss machos foram tratados com veículo, LYSO-7 (5, 25 ou 50 mg/kg, v.o.) ou bezafibrato (25 ou 50 mg/kg, v.o.) 1 hora antes da administração oral de Et/HCl (60%/0,03 M) ou indometacina (100 mg/kg). Em outro conjunto de ensaios, animais foram pré-tratados com GW9962, um antagonista PPARγ (2 mg/kg, i.p.); anticorpo anti-granulócito (50 µL, i.p.), ou L-NAME (70 mg/kg, i.p) 1 hora antes dos tratamentos com veículo ou LYSO-7. Uma hora após administração da solução de Et/HCl, os neutrófilos foram quantificados no sangue e medula óssea, a rede microcirculatória gástrica foi estudada em in situ, utilizando a técnica de microscopia intravital; o tecido gástrico foi utilizado para quantificar a percentagem de área lesada, atividade da MPO, a expressão gênica e proteica de PPARγ, expressão proteica de iNOS e eNOS, e a atividade das enzimas catalase, SOD, GPx, GR e GST. Uma hora após a administração de indometacina, o tecido gástrico foi removido para avaliar a eficácia do tratamento e a secreção de mediadores inflamatórios. Ensaio de úlcera crônica, induzida por ácido acético, foi realizado em camundongos Balb/c WT ou ANXA1-/-, aplicando-se 20µL de ácido acético na camada subserosa do estômago e 24 horas após a indução, os animais foram tratados, uma vez ao dia, durante sete dias com LYSO-7 (50 mg/kg), bezafibrato (50 mg/kg) ou veículo. Foram realizados ensaios com macrófagos recrutados para o peritônio pela ação do tioglicolato de sódio (3%, i.p.) e com neutrófilos recrutados pela ação do glicogênio de ostra (1%, i.p.). Ensaios de toxicologia aguda, crônica e mutagenicidade também foram realizados. Os resultados obtidos mostram que o tratamento com LYSO-7 reduz a área lesada, o influxo de neutrófilos e a estase da rede microcirculatória provocada pela administração de Et/HCl. Os efeitos protetores foram revertidos em animais pré-tratados com GW9962, indicando a participação do PPARγ no efeito. O influxo de neutrófilos é determinante para a lesão, uma vez que a depleção destas células reduziu a ulceração gástrica, e indica que o bloqueio da mobilização de neutrófilos da medula óssea para o sangue e destes para o tecido lesado pela LYSO-7 pode ser um mecanismo de ação gastroprotetora desta molécula. A reversão da estase vascular na microcirculação, mas não o influxo de neutrófilos, é mediado pelo NO, pois o pré-tratamento com L-NAME aboliu os efeitos da LYSO-7 no restabelecimento do fluxo sanguíneo da microcirculação. Este efeito pode ser dependente da maior e menor expressão proteica de eNOS e iNOS, respectivamente. A LYSO-7 foi capaz de alterar favoravelmente a atividade das enzimas antioxidantes no tecido gástrico. Ainda, a LYSO-7 diminuiu a área lesada e reduziu a concentração de TNFα e aumentou a de IL-10 no tecido gástrico lesado pela indometacina. Na resolução do processo inflamatório, o tratamento com LYSO-7 diminuiu a percentagem de área lesada, aumentou a apoptose de neutrófilos e a eferocitose de neutrófilos por macrófagos peritoneais, inibiu a secreção de TNFα e aumentou a secreção de IL-10, TFG-1β e VEGF para o sobrenadante de macrófagos em fagocitose. A resolução de lesão gástrica, bem como a indução da fagocitose pela LYSO-7 foi reduzida em animais ANXA1-/-. As investigações destes últimos dados mostraram a relação da ANXA1 e PPARγ, já que a expressão do receptor é reduzida em macrófagos obtidos de animais depletados de ANXA1. Os estudos toxicológicos mostraram que a LYSO-7 apresenta baixa toxicidade aguda e crônica in vivo, além de não ocasionar mutagenicidade em eritrócitos da medula óssea. Os dados obtidos mostram que a molécula LYSO-7 atua como agonista PPARγ na modulação da úlcera gástrica e modula a migração de neutrófilos e o fluxo sanguíneo na microcirculação. A transativação e transrepressão de eNOS e iNOS, respectivamente, o bloqueio da migração de neutrófilos para a lesão e a inibição da atividade de enzimas oxidativa, ativação de enzimas antioxidantes no epitélio gástrico e a inibição da secreção de mediadores inflamatórios parecem ser os mecanismos de ação da LYSO-7 na citoproteção gástrica. Adicionalmente, a LYSO-7 atua na resolução do processo inflamatório promovendo downregulation na secreção de mediadores inflamatórios, aumento na apoptose de neutrófilos e eferocitose de neutrófilos apoptóticos. / Gastric ulcer is a chronic disease that presents high prevalence, and effectiveness of pharmacological treatments available is limited by several adverse effects. In this study is shown the mechanism of action and toxicological effects of the molecule indole-thiazolidine LYSO-7 in different models of gastric ulcer. Male Swiss mice were treated with vehicle LYSO-7 (5, 25, or 50 mg/kg, p.o.) or bezafibrate (25 or 50 mg/kg, p.o.) 1 hour before the oral administration of Et/HCl (60%/0.03 M) or indomethacin (100 mg/kg). In another set of assays, animals were pre-treated with GW9962, a PPARγ antagonist (2 mg/kg, i.p.), anti-granulocyte antibody (50 µL, i.p.) or L-NAME (70 mg/kg, i.p.) 1 hour before the treatment with vehicle or LYSO-7. One hour after administration of the Et/HCl solution, neutrophils were quantified in the blood and bone marrow, the gastric microcirculatory network was studied in situ by intravital microscopy, in the gastric tissue were quantified the percentage of injured area, MPO activity, PPARγ gene and protein expression, iNOS and eNOS protein expression, and catalase, SOD, GPx, GR and GST activity. One hour after indomethacin administration, gastric tissue was removed to verify the efficacy of LYSO-7 on inflammatory mediator secretion. Chronic ulcer assay induced by acetic acid was carried out in Balb/c WT or ANXA1-/-, applying 20µL of acetic acid in the subserosal layer of the stomach and 24 hours after induction, animals were treated during seven days, once a day, with LYSO-7 (50 mg/kg), bezafibrate (50 mg/kg) or vehicle. Assays were performed with macrophages recruited to the peritoneum by sodium thioglycollate (3%, i.p.) and neutrophils by oyster glycogen (1%, i.p.). Acute and chronic toxicological and mutagenicity assays were also conducted. The results obtained show that LYSO-7 treatment decrease the injured area, neutrophil influx and microcirculatory stasis evoked by Et/HCl administration. Protective effects were reversed in animals pretreated with GW9962, indicating the involvement of PPARγ. Neutrophil influx is a determinant of the gastric lesion, once the depletion of these cells decreased the gastric damage, indicating that in the neutrophil mobilization blockade from the bone marrow to blood and to injured tissue may be a gastroprotective mechanism of LYSO-7. The vascular stasis reversion in the microcirculation is mediated by NO, but not the neutrophil influx, since the pretreatment with L-NAME abolished the effects of LYSO-7 on blood flow. This effect was dependent on increase and decrease of eNOS and iNOS protein expression, respectively. LYSO-7 positively altered the activity of antioxidant enzymes in the gastric tissue. Furthermore, LYSO-7 reduced the injured area and the concentration of TNFα and increased IL-10 in the gastric tissue in the indomethacin-induced ulcer model. In the resolution of inflammation, LYSO-7 treatment decreased the percentage of the injured area, increased the neutrophils apoptosis and the efferocytosis of apoptotic neutrophils by peritoneal macrophages, inhibited the TNFα release and increased the secretion of IL-10, IL-1β and VEGF in the supernatant of phagocytosis assay. The resolution of gastric lesions, as well as, the induction of phagocytosis by LYSO-7 was reduced in animals ANXA1-/-. This data shown the relation of PPARγ and ANXA1, as PPARγ expression is reduced in macrophages obtained from ANXA1-/- animals. Toxicological studies showed that LYSO-7 has low acute and chronic toxicity in vivo, and did not cause mutagenicity in bone marrow erythrocytes. The data obtained show that LYSO-7 acts as PPARγ in the modulation of gastric ulcer and modulate neutrophil migration and blood flow in the microcirculation. The transactivation and transrepression of eNOS and iNOS, respectively, blocking the neutrophil influx into the injury, antioxidant enzymes activation in the gastric epithelium and inhibition of inflammatory mediators release seem to be the mechanisms action of LYSO-7 in gastric cytoprotection. Additionally, LYSO-7 operates in the resolution of inflammation promoting downregulation in the secretion of inflammatory mediators and increases the neutrophil apoptosis and efferocytosis of apoptotic neutrophils.

A úlcera gástrica é uma doença crônica, de alta prevalência, e a eficácia dos tratamentos farmacológicos disponíveis é limitada pela alta incidência de efeitos adversos. Neste trabalho é mostrado o mecanismo de ação terapêutica e os efeitos toxicológicos da molécula indol-tiazolidínica LYSO-7 em diferentes modelos experimentais de úlcera gástrica. Camundongos Swiss machos foram tratados com veículo, LYSO-7 (5, 25 ou 50 mg/kg, v.o.) ou bezafibrato (25 ou 50 mg/kg, v.o.) 1 hora antes da administração oral de Et/HCl (60%/0,03 M) ou indometacina (100 mg/kg). Em outro conjunto de ensaios, animais foram pré-tratados com GW9962, um antagonista PPARγ (2 mg/kg, i.p.); anticorpo anti-granulócito (50 µL, i.p.), ou L-NAME (70 mg/kg, i.p) 1 hora antes dos tratamentos com veículo ou LYSO-7. Uma hora após administração da solução de Et/HCl, os neutrófilos foram quantificados no sangue e medula óssea, a rede microcirculatória gástrica foi estudada em in situ, utilizando a técnica de microscopia intravital; o tecido gástrico foi utilizado para quantificar a percentagem de área lesada, atividade da MPO, a expressão gênica e proteica de PPARγ, expressão proteica de iNOS e eNOS, e a atividade das enzimas catalase, SOD, GPx, GR e GST. Uma hora após a administração de indometacina, o tecido gástrico foi removido para avaliar a eficácia do tratamento e a secreção de mediadores inflamatórios. Ensaio de úlcera crônica, induzida por ácido acético, foi realizado em camundongos Balb/c WT ou ANXA1-/-, aplicando-se 20µL de ácido acético na camada subserosa do estômago e 24 horas após a indução, os animais foram tratados, uma vez ao dia, durante sete dias com LYSO-7 (50 mg/kg), bezafibrato (50 mg/kg) ou veículo. Foram realizados ensaios com macrófagos recrutados para o peritônio pela ação do tioglicolato de sódio (3%, i.p.) e com neutrófilos recrutados pela ação do glicogênio de ostra (1%, i.p.). Ensaios de toxicologia aguda, crônica e mutagenicidade também foram realizados. Os resultados obtidos mostram que o tratamento com LYSO-7 reduz a área lesada, o influxo de neutrófilos e a estase da rede microcirculatória provocada pela administração de Et/HCl. Os efeitos protetores foram revertidos em animais pré-tratados com GW9962, indicando a participação do PPARγ no efeito. O influxo de neutrófilos é determinante para a lesão, uma vez que a depleção destas células reduziu a ulceração gástrica, e indica que o bloqueio da mobilização de neutrófilos da medula óssea para o sangue e destes para o tecido lesado pela LYSO-7 pode ser um mecanismo de ação gastroprotetora desta molécula. A reversão da estase vascular na microcirculação, mas não o influxo de neutrófilos, é mediado pelo NO, pois o pré-tratamento com L-NAME aboliu os efeitos da LYSO-7 no restabelecimento do fluxo sanguíneo da microcirculação. Este efeito pode ser dependente da maior e menor expressão proteica de eNOS e iNOS, respectivamente. A LYSO-7 foi capaz de alterar favoravelmente a atividade das enzimas antioxidantes no tecido gástrico. Ainda, a LYSO-7 diminuiu a área lesada e reduziu a concentração de TNFα e aumentou a de IL-10 no tecido gástrico lesado pela indometacina. Na resolução do processo inflamatório, o tratamento com LYSO-7 diminuiu a percentagem de área lesada, aumentou a apoptose de neutrófilos e a eferocitose de neutrófilos por macrófagos peritoneais, inibiu a secreção de TNFα e aumentou a secreção de IL-10, TFG-1β e VEGF para o sobrenadante de macrófagos em fagocitose. A resolução de lesão gástrica, bem como a indução da fagocitose pela LYSO-7 foi reduzida em animais ANXA1-/-. As investigações destes últimos dados mostraram a relação da ANXA1 e PPARγ, já que a expressão do receptor é reduzida em macrófagos obtidos de animais depletados de ANXA1. Os estudos toxicológicos mostraram que a LYSO-7 apresenta baixa toxicidade aguda e crônica in vivo, além de não ocasionar mutagenicidade em eritrócitos da medula óssea. Os dados obtidos mostram que a molécula LYSO-7 atua como agonista PPARγ na modulação da úlcera gástrica e modula a migração de neutrófilos e o fluxo sanguíneo na microcirculação. A transativação e transrepressão de eNOS e iNOS, respectivamente, o bloqueio da migração de neutrófilos para a lesão e a inibição da atividade de enzimas oxidativa, ativação de enzimas antioxidantes no epitélio gástrico e a inibição da secreção de mediadores inflamatórios parecem ser os mecanismos de ação da LYSO-7 na citoproteção gástrica. Adicionalmente, a LYSO-7 atua na resolução do processo inflamatório promovendo downregulation na secreção de mediadores inflamatórios, aumento na apoptose de neutrófilos e eferocitose de neutrófilos apoptóticos. / Gastric ulcer is a chronic disease that presents high prevalence, and effectiveness of pharmacological treatments available is limited by several adverse effects. In this study is shown the mechanism of action and toxicological effects of the molecule indole-thiazolidine LYSO-7 in different models of gastric ulcer. Male Swiss mice were treated with vehicle LYSO-7 (5, 25, or 50 mg/kg, p.o.) or bezafibrate (25 or 50 mg/kg, p.o.) 1 hour before the oral administration of Et/HCl (60%/0.03 M) or indomethacin (100 mg/kg). In another set of assays, animals were pre-treated with GW9962, a PPARγ antagonist (2 mg/kg, i.p.), anti-granulocyte antibody (50 µL, i.p.) or L-NAME (70 mg/kg, i.p.) 1 hour before the treatment with vehicle or LYSO-7. One hour after administration of the Et/HCl solution, neutrophils were quantified in the blood and bone marrow, the gastric microcirculatory network was studied in situ by intravital microscopy, in the gastric tissue were quantified the percentage of injured area, MPO activity, PPARγ gene and protein expression, iNOS and eNOS protein expression, and catalase, SOD, GPx, GR and GST activity. One hour after indomethacin administration, gastric tissue was removed to verify the efficacy of LYSO-7 on inflammatory mediator secretion. Chronic ulcer assay induced by acetic acid was carried out in Balb/c WT or ANXA1-/-, applying 20µL of acetic acid in the subserosal layer of the stomach and 24 hours after induction, animals were treated during seven days, once a day, with LYSO-7 (50 mg/kg), bezafibrate (50 mg/kg) or vehicle. Assays were performed with macrophages recruited to the peritoneum by sodium thioglycollate (3%, i.p.) and neutrophils by oyster glycogen (1%, i.p.). Acute and chronic toxicological and mutagenicity assays were also conducted. The results obtained show that LYSO-7 treatment decrease the injured area, neutrophil influx and microcirculatory stasis evoked by Et/HCl administration. Protective effects were reversed in animals pretreated with GW9962, indicating the involvement of PPARγ. Neutrophil influx is a determinant of the gastric lesion, once the depletion of these cells decreased the gastric damage, indicating that in the neutrophil mobilization blockade from the bone marrow to blood and to injured tissue may be a gastroprotective mechanism of LYSO-7. The vascular stasis reversion in the microcirculation is mediated by NO, but not the neutrophil influx, since the pretreatment with L-NAME abolished the effects of LYSO-7 on blood flow. This effect was dependent on increase and decrease of eNOS and iNOS protein expression, respectively. LYSO-7 positively altered the activity of antioxidant enzymes in the gastric tissue. Furthermore, LYSO-7 reduced the injured area and the concentration of TNFα and increased IL-10 in the gastric tissue in the indomethacin-induced ulcer model. In the resolution of inflammation, LYSO-7 treatment decreased the percentage of the injured area, increased the neutrophils apoptosis and the efferocytosis of apoptotic neutrophils by peritoneal macrophages, inhibited the TNFα release and increased the secretion of IL-10, IL-1β and VEGF in the supernatant of phagocytosis assay. The resolution of gastric lesions, as well as, the induction of phagocytosis by LYSO-7 was reduced in animals ANXA1-/-. This data shown the relation of PPARγ and ANXA1, as PPARγ expression is reduced in macrophages obtained from ANXA1-/- animals. Toxicological studies showed that LYSO-7 has low acute and chronic toxicity in vivo, and did not cause mutagenicity in bone marrow erythrocytes. The data obtained show that LYSO-7 acts as PPARγ in the modulation of gastric ulcer and modulate neutrophil migration and blood flow in the microcirculation. The transactivation and transrepression of eNOS and iNOS, respectively, blocking the neutrophil influx into the injury, antioxidant enzymes activation in the gastric epithelium and inhibition of inflammatory mediators release seem to be the mechanisms action of LYSO-7 in gastric cytoprotection. Additionally, LYSO-7 operates in the resolution of inflammation promoting downregulation in the secretion of inflammatory mediators and increases the neutrophil apoptosis and efferocytosis of apoptotic neutrophils.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Hypertension is a multifactor clinical condition, which is accompanied by a low-grade inflammation and alterations in platelet function. These modifications may be related to an imbalance in the regulation of adenine nucleotides (ATP, ADP and AMP), adenosine and acetylcholine (ACh) levels. This regulation is performed by purinergic [NTPDases, ecto-5 - nucleotidase and adenosine deaminase (ADA)] and cholinergic [Acetylcholinesterase (AChE) and Butyrylcholinesterase (BuChE)] system enzymes, present in blood, respectively. These enzymes can be modulated by regular practice of physical exercise, which has been recommended for the treatment of hypertension. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of six swimming training weeks on blood pressure, on purinergic and cholinergic systems enzymes activities in blood as well as on platelet aggregation and classic inflammatory markers in rats with hypertension induced by methyl Nω-nitro-L-arginine ester hydrochloride (L-NAME) administration. In order to better understand chronic changes, we also evaluated the effect of a single acute bout of exercise on the activity of the enzymes already mentioned. The animals were divided into four groups (n = 10): control, exercise, LNAME and exercise L-NAME. After 60 days of treatment, animals were euthanized and platelets, lymphocytes, whole blood and serum were used for experimental determinations. The results showed that swimming training was able to reduce blood pressure in hypertensive rats, and to prevent the increase in NTPDase, ecto-5'-nucleotidase and ADA activities in lymphocytes and platelets. This probably contributed in preventing platelet aggregation. Chronically, swimming was also effective in preventing the increase in AChE (in lymphocytes and whole blood) and BuChE (in serum) activities. Regarding to the expression of NPTDase1, exercise per se triggered a reduction in the expression of this enzyme, but had no significant effects in hypertensive rats. The prevention of the increase in cholesterol, triglycerides, C-reactive protein levels and myeloperoxidase activity generated by swimming practice reinforces the fact that exercise reduced inflammation in hypertensive rats. In response to a single acute bout of exercise, was observed an increase in the activity of cholinergic system enzymes in whole blood, lymphocytes and serum, and purinergic system enzymes in platelets. However, there was a decrease in the activity of NTPDase and ADA in lymphocytes. It can be concluded that this study allowed us to unveil, in part, the mechanisms related to the protective processes arising from regular physical exercise on hypertension related to inflammation and platelet aggregation. The results also reinforce the importance of measuring the purinergic and cholinergic systems enzymes as parameters of inflammatory response. Also, it is concluded that regular physical exercise has antithrombotic and anti-inflammatory effects by modulating the activity purinergic and cholinergic systems enzymes in hypertension. It is suggested that these responses have been derived from the adaptations that occur in the body due to each acute stimulus that promotes enough impact to break homeostasis and promote beneficial adaptations. Thus, moderate aerobic exercise has a key role in acting as an adjuvant in the treatment of hypertension. / A hipertensão é uma condição clínica multifatorial que, na maioria dos casos, está acompanhada de um quadro inflamatório de baixo grau e alterações nas funções plaquetárias. Essas modificações podem estar relacionadas a um desequilíbrio na regulação dos níveis de nucleotídeos de adenina (ADP, ADP e AMP), da adenosina e da molécula acetilcolinesterase (ACh), que é realizada pelas enzimas do sistemas purinérgico [NTPDases, ecto-5 -nucleotidase e adenosina desaminase (ADA)] e colinérgico [Acetilcolinesterase (AChE) e Butirilcolinesterase (BuChE)] presentes no sangue, respectivamente. A atividade dessas enzimas pode ser modulada pela prática regular de exercícios físicos, a qual tem sido recomendada para o tratamento da hipertensão. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi verificar o efeito de seis semanas de natação sobre a pressão arterial, a atividade de enzimas dos sistemas purinérgico e colinérgico em sangue, bem como sobre a agregação plaquetária e marcadores inflamatórios clássicos em ratos com hipertensão induzida através de administração de metila Nω-Nitro-L-arginina cloridrato de éster (L-NAME). Com o objetivo de melhor compreender as alterações crônicas, avaliouse, também, o efeito de uma única sessão aguda de exercício sobre a atividade das enzimas já mencionadas. Os animais foram divididos em quatro grupos (n = 10): Controle, Exercício, L-NAME e L-NAME Exercício. Após 60 dias de tratamento, os animais foram submetidos à eutanásia e as plaquetas, os linfócitos, o sangue total e o soro foram usados para as determinações experimentais. Os resultados obtidos mostraram que o treinamento com natação foi capaz de reduzir a pressão sanguínea em ratos hipertensos, além de prevenir o aumento da atividade das enzimas NTPDase, ecto-5 -nucleotidase e ADA em linfócitos e plaquetas, o que provavelmente contribuiu para prevenir a agregação plaquetária. Cronicamente, a natação também foi eficaz na prevenção do aumento da atividade das enzimas AChE em linfócitos e sangue total e BuChE em soro. Com relação à expressão da NPTDase1, o exercício per se gerou a redução da expressão desta enzima, mas não apresentou efeitos significativos nos ratos hipertensos. A prevenção do aumento dos níveis de colesterol, triglicerídeos, proteína C-reativa e mieloperoxidase gerada pela prática da natação reforça o fato de que o exercício reduziu a inflamação em ratos hipertensos. Como resposta a uma única sessão aguda de exercício, verificou-se o aumento da atividade das enzimas dos sistemas colinérgico em sangue total, linfócitos e soro e do sistema purinérgico em plaquetas. Entretanto, ocorreu a diminuição da atividade da NTPDase e da ADA em linfócitos. Pode-se concluir que este estudo permitiu desvendar em parte os mecanismos relacionados aos processos protetores advindos da prática regular de exercício físicos na hipertensão relativos aos processos inflamatórios e à agregação plaquetária. Os resultados ainda reforçam a importância da dosagem das enzimas dos sistemas purinérgico e colinérgico como parâmetros da resposta inflamatória. Conclui-se, também, que a prática regular de exercício físico possui efeitos antitrombóticos e antiinflamatórios através da modulação da atividade das enzimas dos sistemas purinérgico e colinérgico na hipertensão. Sugere-se que estas respostas tenham sido provenientes das adaptações ocorridas no organismo decorrentes de cada estímulo agudo, que gerou estímulos suficientes para quebrar a homeostase do organismo e promover adaptações benéficas. Desta forma, o exercício físico aeróbico moderado possui um papel fundamental na atuação como coadjuvante no tratamento da hipertensão.