Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5859.pdf: 8428715 bytes, checksum: 1818210d95744ce8daf3a59dda0bf966 (MD5) Previous issue date: 2014-03-21 / Financiadora de Estudos e Projetos / Marine microorganisms are living beings with extraordinary abilities, once they have developed physiological and metabolic capabilities that allow them to survive in an environment filled with adverse conditions, such as high pressure, excessive salinity and extreme temperatures. Thus, these living beings have great potential for the production of metabolites which normally cannot be produced by soil bacteria. The overall objective of this study was to elucidate the metabolite profile of the bacterium Streptomyces cebimarensis SS99BA-2 isolated from marine sediment in São Sebastião, a city located in the northern coast of São Paulo State, using the LC-SPE/NMR hyphenated technology. Ethyl acetate and butanol extracts of bacterial fermentation broths showed, respectively, biological activity against Escherichia coli and Candida albicans, and cytotoxic activity against tumour cells SF-295 (central nervous system). The optimization of the chromatographic conditions, together with the optimization of parameters for SPE retention, and for NMR acquisition and processing, led to the identification of at least eight known substances. This strategy did not require bench isolation methods, from very small amounts, approximately 3 mg, of crude extracts and permited to identify: maltol, 5-hydroximaltol, 4-hydroxibenzoic acid, N-acetyltyramine, isomaltol, 3-(N)-propanesulfonic acid, dehydroxinocardamine and nocardamine. In addition, six new compounds were isolated, including four belonging to a rare class of pyrazin-2(1H)-onic secondary metabolites named: giovaninone A, giovaninone B, giovaninone C and giovaninone D, and two belonging to an extremely cytotoxic class of antitumor phosphated polyketides: thomasicine A and thomasicine B. The results show that the LC-SPE/NMR coupling technology is extremely useful in the natural products field, since organic compounds can be identified in a rapid, safe and reproductible way. Moreover, it can be observed that the chemistry of marine microorganisms is still very little explored and reveal a promising field in the obtaining of potential candidates for pharmaceuticals, since these organisms are able to be cultivated in large scale through the use of bioreactors. / Micro-organismos marinhos são seres com habilidades extraordinárias, uma vez que apresentam características fisiológicas e metabólicas que lhes permitem sobreviver num ambiente repleto de condições adversas, como alta pressão, salinidade excessiva e temperaturas extremas. Muitos deles também apresentam um grande potencial para a produção de metabólitos que normalmente não podem ser produzidos por bactérias terrestres. Diante disso, o objetivo geral do presente estudo foi elucidar o perfil metabólico de uma linhagem de bactéria isolada de sedimento marinho em São Sebastião, litoral norte do estado de São Paulo, Streptomyces cebimarensis SS99BA-2, utilizando a técnica hifenada LC-SPE/NMR. Extratos de acetato de etila e butanólicos dos caldos fermentativos dessa bactéria apresentaram, respectivamente, atividade biológica contra Escherichia coli e Candida albicans e atividade citotóxica contra células tumorais SF-295 (sistema nervoso central). A otimização da separação cromatográfica, somada à otimização dos parâmetros de retenção por SPE e de aquisição e processamento de RMN, levou à identificação de pelo menos oito substâncias conhecidas sem a necessidade de isolamento de bancada a partir de quantidades muito pequenas, aproximadamente 3 mg, de extratos brutos: maltol, 5-hidróximaltol, ácido 4-hidróxibenzóico, isomaltol, N-acetiltiramina, ácido 3-(N-morfolino)-propanossulfónico, dehidróxinocardamine e nocardamine, além de seis compostos inéditos na literatura, sendo quatro pertencentes à uma classe rara de metabólitos secundários pirazin-2(1H)-ônicos: giovaninona A, giovaninona B, giovaninona C e giovaninona D e dois pertencentes à uma classe de policetídeos fosfatados antitumorais com potencial citotóxico: thomasicina A e thomasicina B. Os resultados mostram que a técnica hifenada LC-SPE/NMR é extremamente valiosa na área de produtos naturais, uma vez que substâncias orgânicas podem ser identificadas de forma rápida, segura e reprodutível. Além disso, verifica-se que a química de micro-organismos marinhos ainda é muito pouco explorada e revela um campo promissor na obtenção de possíveis candidatos a fármacos, uma vez que esses organismos são passíveis de cultivos em larga escala através do uso de bioreatores.

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-09-20T13:59:34Z No. of bitstreams: 1 DissAIR.pdf: 2674916 bytes, checksum: ce7235eb0ec52019719941436fc35728 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:34:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAIR.pdf: 2674916 bytes, checksum: ce7235eb0ec52019719941436fc35728 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:34:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAIR.pdf: 2674916 bytes, checksum: ce7235eb0ec52019719941436fc35728 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-21T12:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAIR.pdf: 2674916 bytes, checksum: ce7235eb0ec52019719941436fc35728 (MD5) Previous issue date: 2015-03-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Among the various diseases which attack citrus worldwide, the gummosis is caused by species of the genus Phytophthora. The various species present in the literature, the most severe in Brazil is P. nicotianae. This pathogen produces resistance’s structures in the soil, thus the best control method is the exclusion. There are other ways to preventive, as is the case of the use of synthetic fungicides which help in the combat, however , the widespread use thereof, can favor the emergence of resistant strains to the active ingredient , as well as being damaging to the environment. In this context, one of saprobes fungi (Memnoniella levispora) found in the Brazilian semi -arid region, has received special attention as a biological control agent that proves to be an alternative and effective method. Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of the growth of this fungus in solid and liquid, through five different culture media (PD, PDY, PDM, CZA, CC), perform isolation and identification of metabolites from the most suitable means and then submit them to the mycelial growth tests of the P. nicotianae. After a comparative by HPLC-DAD, HPLC-UV and NMR of this media, the CC proved to be the most productive. For showing good results this medium was reproduced on a large scale in liquid medium. After partitioning and fragmentation of the material, the extracts were analyzed and biologically tested against mycelial growth of P. nicotianae, in order to realize a biomonitored study. The fraction of ethyl acetate liquid of the carrot and corn medium, was considerably inhibited the pathogen growth. Therefore, by the technique LC-SPE-NMR along with the other techniques mentioned, it was possible to identify and isolate eight structures of this fraction, which griseofulvina and analogues, 3 of which purports to be unpublished yet. The Griseofulvin was tested and showed about 72% of the inhibition of mycelial growth of Phythophtora, which leads us to research on the antifungal activity of this and other secondary metabolites in the fight against P. nicotianae and other pathogens. / Dentre as várias doenças que atacam os citros em todo o mundo, a gomose, causada por espécies do gênero Phytophthora se encontra entre as mais importantes. Dentre as espécies, a que se destaca é a Phytophtora nicotianae, mais severa aqui no Brasil. Devido ao fato do patógeno produzir estruturas resistentes no solo, a exclusão é o melhor método de controle. Existem outras maneiras preventivas, como é o exemplo do uso de fungicidas sintéticos que auxiliam nesse combate, no entanto, o uso indiscriminado do mesmo, pode favorecer o surgimento de linhagens resistentes ao principio ativo, além de ser prejudicial ao meio ambiente. Neste contexto, um dos fungos sapróbios (Memnoniella levispora) encontrado no semi-árido brasileiro tem recebido atenção especial como agente de controle biológico que demonstra ser um método alternativo e eficaz. Sendo assim, o objetivo deste trabalho consistiu em avaliar o efeito do crescimento do fungo em meio sólido e líquido em cinco diferentes meios de cultivo, realizar isolamento e identificação de metabólitos provenientes do meio mais propício e posteriormente submetê-los a testes do crescimento micelial da P. nicotianae. Para isso, foi feito o crescimento de M. levispora no meios de Batata Dextrose (BD), BD suplementada com 1% de extrato de levedura (BDL), BD suplementado com 1% de extrato de malte (BDM), Czapeck (CZA), e cenoura e milho (CM). Após um comparativo por HPLC-DAD, HPLC-UV e RMN desses extratos, o CM demonstrou ser o mais produtivo. Por apresentar bons resultados este extrato foi reproduzido em escala ampliada em meio líquido. Após partição e fracionamento desse material, os extratos foram analisados e testados biologicamente frente ao crescimento micelial da Phytophtora, afim de se realizar um estudo biomonitorado. O fração acetato de etila do meio líquido de cenoura e milho, foi o que inibiu consideravelmente o crescimento do patógeno. Assim, através da técnica LC-SPE-NMR em conjunto com as demais técnicas citadas, foi possível identificar e isolar 8 metabólitos secundários dessa fração, sendo eles griseofulvina e análogos, dos quais 3 propõe-se ser inéditas. O teste de inibição do crescimento micelial da Phythophtora nicotianae foi refeito e a griseofulvina apresentou resultado satisfatório de 72% de inibição que nos leva à pesquisar sobre a atividade antifúngica desta e dos outros metabólitos secundários no combate à P. nicotianae e a outros patógenos.

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The methodology developed in the present work, through chromatographic fingerprint by LC-DAD and Principal Component Analysis (PCA), was adequate for the chemical differentiation of Lippia alba (Mill) NE Brown accessions, considering the extraction method (infusion and maceration hydroalcoholic) and the collection season (summer and winter), allowing to evaluate the influence of these variables on the chemical composition of extracts obtained. In addition, all extracts were submitted to cytotoxic tests against two tumor cell lines, HL-60 (human leukemia) and HepG2 (human hepatocellular carcinoma), and to inhibition tests against the enzyme acetylcholinesterase (AChE) in order to evaluate the form of extraction and which access is the most promising from a pharmacological point of view. Among the extracts analyzed against tumor cells, eight of them, two from the infusion: 01IW and 02IW and six from the hydroalcoholic extraction: 02HW, 24HW, 39HW, 54HW, 01HS and 24HS, presented better cell inhibition performances against HL-60, with percentage of inhibition between 40.0 and 52.0%, suggesting that these extracts are potentially promising against this lineage. With respect to the anticholinesterase tests, all extracts studied had low AChE inhibitory effect when compared to galantamine (87.4%), highlighting only the samples 01HW (28.4%), 02HW (27.2%), 54HW (29.3%), 01HS (32.7%), 02HS (27.4%) and 24HS (30.3%). Through the analyzes performed by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) it was possible to identify the structures of some compounds isolated from this species: flavone tricin and phenylpropanoid verbascoside/isoverbascoside. In addition, the classes of three other metabolites were proposed: two phenylpropanoid derivatives and one flavonoid diglucoside. / A metodologia desenvolvida no presente trabalho, utilizando fingerprint cromatográfico por CL-DAD e Análise de Componentes Principais (PCA), se mostrou adequado para a diferenciação química de acessos de Lippia alba (Mill) N. E. Brown, considerando o método de extração (infusão e maceração hidroalcoólica) e a época de coleta (verão e inverno), permitindo, ainda, avaliar a influência destas variáveis na composição química dos extratos obtidos. Adicionalmente, todos os extratos foram submetidos a testes citotóxicos frente a duas linhagens de células tumorais, HL-60 (leucemia humana) e HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), e de inibição enzimática frente a acetilcolinesterase (AChE) com o intuito de avaliar qual a forma de extração e qual acesso é o mais promissor do ponto de vista farmacológico. Entre todos os extratos analisados frente as células tumorais, dois provenientes da infusão: 01II e 02II e seis da extração hidroalcoólica: 02HI, 24HI, 39HI, 54HI, 01HV e 24HV, apresentaram melhores desempenhos de inibição frente a HL-60, com percentual de inibição entre 40,0 e 52,0%, sugerindo que estes extratos são potencialmente promissores contra esta linhagem. Com relação aos testes anticolinesterásicos, todos os extratos estudados apresentaram baixo efeito inibidor da AChE quando comparados a galantamina (87,4%), com destaque para os extratos 01HI (28,4%), 02HI (27,2%), 54HI (29,3%), 01HV (32,7%), 02HV (27,4%) e 24HV (30,3%). Através das análises realizadas por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foi possível identificar as estruturas de alguns dos compostos isolados a partir desta espécie: a flavona tricina e o fenilpropanóide verbascosídeo/isoverbascosídeo. Além disso, foram propostas as classes de outros três metabólitos: dois derivados de fenilpropanóides e um flavonóide diglicosilado. / São Cristóvão, SE