Submitted by Joana Gabriela Desiderato null (desideratojg@gmail.com) on 2017-07-27T15:07:00Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Joana_Gabriela_Desiderato.docx: 4912171 bytes, checksum: 639bcf495fee38479e4632b0ce8d12d8 (MD5) / Rejected by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Por favor, corrija o formato do arquivo e realize uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2017-07-28T13:12:00Z (GMT) / Submitted by Joana Gabriela Desiderato null (desideratojg@gmail.com) on 2017-07-28T13:22:09Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Joana_Gabriela_Desiderato.pdf: 2639616 bytes, checksum: a7f3656945cfe28767c4a7ff73745655 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-08-01T16:56:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 desiderato_jg_me_jabo.pdf: 2639616 bytes, checksum: a7f3656945cfe28767c4a7ff73745655 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-01T16:56:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 desiderato_jg_me_jabo.pdf: 2639616 bytes, checksum: a7f3656945cfe28767c4a7ff73745655 (MD5) Previous issue date: 2017-07-04 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A indústria sucroalcooleira gera elevado número de resíduos de origem da biomassa lignocelulósica que apresentam grande potencial para produção de biocombustíveis, em particular o etanol de segunda geração. Uma das formas promissoras para a desconstrução da biomassa lignocelulósica é através da utilização de consórcios bacterianos que produzem enzimas altamente específicas com a capacidade de quebrar a estrutura da lignocelulose. Porém, para a otimização desse processo é importante entender as funções metabólicas presentes nesses consórcios degradadores de biomassa. Portanto, esse estudo objetivou identificar e classificar a composição de uma comunidade bacteriana proveniente de consórcio oriundo de solo contendo bagaço de cana-de-açúcar em decomposição e avaliar sua capacidade metabólica através de sequenciamento genômico de alto rendimento e análises de bioinformática. Esse consórcio foi cultivado durante vinte semanas, sendo que amostras de DNA foram extraídas para sequenciamento a cada sete dias. O sequenciamento da subunidade 16S do operon ribossomal (16S rRNA) foi realizado utilizando a plataforma Ion PGM™, enquanto que o sequenciamento do DNA total foi realizado na plataforma HiSeq 2500, Illumina®. Os resultados do sequenciamento do 16S rRNA indicam 5 diferentes famílias bacterianas ao longo das 20 semanas, sendo Burkholderiaceae (73%) e Rhodanobacteraceae (24%) as mais abundantes. Análises do potencial funcional do consórcio realizadas através dos programas PICRUSt e STAMP, indicam o enriquecimento da função de transportadores, incluindo transportadores do tipo ABC, principalmente na primeira semana, sugerindo um provável papel na metabolização do material lignocelulolítico presente no meio. Os dados gerados pelo sequenciamento total do metagenoma foram montados (“de novo” assembly) e permitiram recuperar a sequência genômica de um dos organismos mais abundantes presentes no consórcio (24%). Esse genoma foi finalizado e circularizado, apresentando 4.758.639 pb e GC% de 65,25, e similaridade de 99% da sequência do 16S rRNA e 90,77% de identidade de suas sequências codificadoras com o genoma da bactéria Dyella jiangningensis SBZ3-12 (Rhodanobacteraceae). A anotação realizada através da plataforma RAST, indicou 4.194 genes codificadores de proteínas, dentre os quais 36 Glicosil Hidrolases potencialmente envolvidas com a degradação da biomassa lignocelulósica. Portanto, esse estudo permitiu a elucidação da diversidade microbiana e perfil metabólico de um consórcio bacteriano, revelando um novo genoma pertencente ao gênero Dyella, potencialmente relacionado com o processo de degradação da biomassa lignocelulósica. Em linhas gerais, os resultados obtidos também corroboraram o potencial que ferramentas de sequenciamento de alto rendimento, metagenômica e bioinformática apresentam para o estudo de comunidades microbianas com potencial biotecnológico, mostrando-se como uma valiosa alternativa para a investigação de novos alvos para a pesquisa em bioenergia. / The sugarcane ethanol industry generates a number of residues related to the lignocellulosic biomass which exhibit potential for the production of biofuels, in particular second generation ethanol. One of the promising ways for the deconstruction of lignocellulosic biomass to valuable products is through the use of bacterial consortia. These consortia encode a specific set of enzymes capable to metabolize and decompose the lignocellulose structure. However, to optimize this process, the metabolic functions present in a biomass-degrading consortia must be well known. Therefore, this study aimed to unravel the taxonomic composition, and to evaluate the metabolic profile of a bacterial consortium from a sugar-cane derived soil containing decomposing straw, through high-throughput genomic sequencing and bioinformatics analyzes. The selected consortium was cultivated in laboratory for twenty weeks, and DNA samples were extracted for sequencing every seven days. The 16S subunit of the ribosomal operon (16S rRNA) and total DNA sequencing were performed through the Ion PGM™ (Thermo Fischer) and HiSeq 2500 (Illumina) platforms, respectively. The 16S rRNA sequencing indicate at least 5 different bacterial families during the 20 weeks of cultivation. The Burkholderiaceae (73%) and Rhodanobacteraceae (24%) are the most abundant. Functional analyses, indicate an enrichment of the transporter-related function, including ABC-transporters mainly in the first week of cultivation, suggesting a probable role related with the decomposing of the lignocellulolytic material. The whole metagenome sequencing uncover the genomic sequence of one of the most abundant organisms present in the consortium (abundance ~24% of the sequenced reads). This genome was finished and circularized, exhibiting 4,758,639 bp, GC% of 65.25, and 99% of similarity of the 16S rRNA and 90.77% identity of the coding sequences to the genome of the bacterium Dyella jiangningensis SBZ3- 12 (Rhodanobacteraceae). The annotation revealed 4,194 proteins coding genes, among which 36 Glycosyl Hydrolases potentially involved with the degradation of lignocellulosic biomass. Therefore, the microbial diversity and metabolic profile of the consortium was revealed. In addition a new genome belonging to the Dyella genus potentially involved with degradation of the lignocellulosic biomass were also uncovered. Overall, the results also corroborated the potential of high-throughput metagenomic sequencing and bioinformatic aproach for the elucidation of microbial communities with biotechnological potential, proving to be a valuable alternative for the bioenergy research. / CNPq: 132532/2015-8

Orientador: Daniela Alonso Bocchini Martins / Coorientador: Eleni Gomes / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: João Cláudio Thoméo / Resumo: Devido à ampliação das aplicações industriais das celulases e hemicelulases, é crescente o interesse na produção destas enzimas por micro-organismos através de processos que promovam altos rendimentos a baixo custo. Assim, o cultivo de fungos filamentosos por fermentação em estado sólido (FES) utilizando-se resíduos lignocelulósicos como substratos tem sido frequentemente citado na literatura. Os fungos termofílicos tem se destacado neste sentido, por produzirem enzimas geralmente mais ativas e estáveis sob altas temperaturas, uma vantagem do ponto de vista das aplicações industriais. No presente trabalho, foram isolados 32 fungos termofílicos do ambiente a partir de amostras de silagem, compostagem e outros materiais orgânicos. Uma triagem inicial dos melhores produtores foi feita pelo cultivo dos isolados, por FES, em mistura de bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo (1:1 p/p) como substratos, por 96h. A partir destes cultivos foram pré-selecionados 7 isolados, os quais foram então cultivados por FES em diferentes misturas de resíduos agro-industriais, por 96h, a fim de se avaliar a influência dos mesmos na produção das enzimas, buscando-se maiores rendimentos. Foram então selecionados para dar continuidade ao trabalho os isolados que mais se destacaram na produção das enzimas: Myceliophthora thermophila JCP 1-4 (endoglucanase, -glicosidase, xilanase e avicelase) e DABM 11/45 (-glicosidase, xilanase e avicelase). A influência do tempo de cultivo na produção das enzimas pelos dois isolados selecionados foi avaliada e as enzimas foram caracterizadas físico-quimicamente. O extrato enzimático produzido por M. thermophila, por FES, em mistura de bagaço de cana-de-açúcar e farelo de soja (1:1 p/p) foi utilizado para a sacarificação de bagaço de cana in natura e pré-tratado glicerol e explosão à vapor. Os bagaços in natura e pré-tratados foram... / Abstract: Due to the expansion of industrial applications of cellulases and hemicellulases, there is increasing interest in the production of these enzymes by micro-organisms through processes that promote high yields at low cost. Thus, the cultivation of filamentous fungi by solid state fermentation (SSF) using lignocellulose residues as substrates has been frequently cited in the literature. The thermophilic fungi has excelled in this regard, since they produce enzymes usually more active and stable under high temperatures, an advantage from the point of view of industrial applications. In this work, 32 thermophilic fungi were isolated from the environment, from samples of silage, composting and other organic materials. An initial screening of the best producers was made by cultivation of isolates, by SSF, in a mixture of sugar cane bagasse and wheat bran (1:1 w/w) as substrates, for 96h. From these cultivations 7 isolates were pre-selected, which were then cultured by SSF in different mixtures of agro-industrial residues, for 96h, in order to assess the influence of these substrates in enzymes production, seeking higher yields. Then, were selected to give continuity to the work the isolates that stood out in the production of enzymes: Myceliophthora thermophila JCP 1-4 (endoglucanase, -glucosidase, xylanase and avicelase) and DABM 11/45 (-glucosidase, xylanase and avicelase). The influence of the time on the enzymes production by the two selected isolates was assessed and the enzymes were characterized physico-chemically. The enzymatic extract produced by M. thermophila, by FES, in a mixture of sugar cane bagasse and soybean meal (1:1 w/w) was used for the saccharification of in natura and pre-treated glycerol and steam exploded sugarcane bagasse. The in natura and pre-treated bagasse were characterized regarding the content of cellulose, hemicellulose and lignin. The enzymatic extract produced by newly isolated fungus Myceliophtora... / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Banca: João Claudio Thomeo / Banca: Mauricio Boscolo / Banca: Sandra Helena da Cruz / Banca: Sarita Cândida Rabelo / Resumo: O presente estudo foi dividido em duas etapas, a primeira propôs a produção de enzimas lignocelulósicas por linhagens do gênero Trichoderma por fermentação em estado sólido sob diferentes condições físico-químicas. Após seleção inicial, quatro dentre dez linhagens analisadas, apresentaram resultados satisfatórios quanto à atividade enzimática. Dentre as quatro, foram identificadas as espécies T. virens, T. harzianum e T. aspereloides. A maior atividade de CMCase (23 U/g), foi obtida do cultivo de T. asperelloides e a maior atividade de β-glicosidase (4 U/g) e xilanase (1640 U/g) do cultivo de T. virens. Na segunda etapa deste estudo, foi avaliada a eficiência do pré-tratamento com e sem o uso de micro-ondas associado a soluções de ácido fosfórico (0,05 M), hidróxido de sódio (0,01 M), glicerol (10%) e água no tratamento do bagaço de cana. Dos tratamentos ao qual o bagaço foi submetido, o que resultou em maior liberação de compostos fenólicos totais (4,24 mg/g) e açúcares redutores (0,06 ± 0 mg/g), foram os tratamentos por micro-ondas associados ao NaOH e glicerol, respectivamente. Os resultados de perda de massa após o tratamento foram significativos no tratamento com micro-ondas e NaOH (14%). O bagaço de cana pré-tratado foi incubado com o preparo enzimático de Trichoderma virens, T. asperelloides, T. harzianum ou a enzima comercial Celluclast. Após 24 horas de incubação foram liberados 535 mg/g de açúcar redutor na hidrólise da espécie T. virens. As análises termogravimétricas e morfológicas do bagaço de cana tratado com micro-ondas e NaOH, apontaram mudanças na estrutura do material evidenciando a eficiência do tratamento na desestruturação da biomassa / Abstract: This study was divided in two steps, the first investigated the production of lignocelullosic enzymes for specimens of Trichoderma cultivated by state solid fermentation under different conditions physical-chemical. For ten specimens available, four showed satisfactory results of enzymatic production, being identified three species. T. virens, T. harzianum e T. aspereloides). The greatest production of CMCase (23 U/g), was obtained by T. asperelloides and the greatest production of β-glicosidase (4U/g) and xilanase (1640U/g) were obtained by T. virens. In the second investigation, was tested the efficiency of pre-treatment of bagasse sugar cane with microwave radiation in presence of acid phosphoric (0.05M), sodium hydroxide (0.01M), glycerol (10%) all diluted in water in fiber structure. About the treatments of the bagasse, the most efficient in the liberation of phenolic compounds (4.24 mg/g) and reducing sugars (0.06±0 mg/g) was the solution in microwave with NaOH and glycerol, respectively. The dry weight results after the treatment were significant, with a maximum of 14% loss of the initial in treatment with NaOH. The thermogravimetry and morphological analysis of treated bagasse with a microwave and NaOH, showed changes in the structure of the material showing the effectiveness of treatment in biomass breakdown / Doutor

Orientador: Rubens Maciel Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-13T23:08:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Polowski_NataschaVigdis_D.pdf: 3937033 bytes, checksum: 67463e72c2fe6b2c2bf718ee1aefe5cd (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Neste trabalho foram desenvolvidos três modelos para predição de Número Kappa (Modelo Determinístico, Modelo Neural e Modelo Híbrido). O Modelo determinístico inclui transferência de massa e reações cinéticas intrínsecas baseadas em reações paralelas de lignina, celulose e hemicelulose. Este divide o processo de deslignificação em 3 estágios ou fases, sendo que as 3 fases correspondem a 3 diferentes tipos de lignina (inicial, principal e residual). O modelo é específico para polpa de eucalipto (fibra curta) e digestor batelada. Umas das contribuições para este modelo proposto foram às inclusões de reações para lignina, hemicelulose e celulose total, carboidratos, além do Número Kappa. Para Modelo Determinístico foram utilizados dados experimentais coletados no RAIZ - Instituto de Investigação da Floresta e Papel e dados gerados pelas simulações. As variáveis operacionais utilizadas como dados de entrada foram: espessura, temperatura inicial, álcali efetivo, relação licor madeira, tempo de cozimento, densidade e porosidade. O Modelo Determinístico também foi desenvolvido para digestor contínuo e foi validado com dados industriais para fibra curta de eucalipto. A modelagem feita para um digestor batelada é a mesma que para um digestor contínuo, sendo que no contínuo existem de 3 a 4 etapas dentro do equipamento. Por conseguinte, o digestor contínuo é modelado como se fosse um batelada só que fracionadamente (temperaturas e tempos para cada estágio do equipamento e de forma seqüencial). Neste trabalho foi empregado um método de otimização (Programação Quadrática Sucessiva) para definir o procedimento de operação no digestor contínuo permitisse a obtenção do produto (polpa) com teores inferiores a 1,5 % de lignina residual. Industrialmente este valor está em torno de 3 % de lignina residual. O Modelo Neural proposto é do tipo "feedforward" e com treinamento por retropropagação. Para este modelo as variáveis de entrada (inputs) foram temperatura, álcali efetivo e Fator H. A variável de saída (output) é o Número Kappa. A quantidade de neurônios ocultos foi definida pelo modelo neural que apresentou o menor erro para o conjunto de validação e treinamento. O número de interações também foi definido a partir do menor erro gerado pelas simulações. Este modelo foi validado com dados industriais e experimentais. O Modelo Híbrido utilizou como variáveis de entrada Kappa Neural e Teórico, temperatura e Fator H e a variável de saída é o Número Kappa Híbrido. Este foi validado com dados industriais. Os modelos apresentados (Determinístico, Neural e Híbrido) são ferramentas úteis para as fábricas de celulose e papel, uma vez que existe a possibilidade de serem aplicados para simulação de processos, otimização e controle. Os modelos podem ser testados para diferentes condições operacionais sem alterar a produção. Além de possibilitarem melhor controle de algumas variáveis no processo fabril, isto, sem perda de qualidade do produto. Neste estudo a rede neural e os modelos cinéticos apresentaram resultados equivalentes. Palavras-chaves: Número Kappa, Modelo Determinístico, Modelo Neural e Modelo Híbrido / Abstract: In this work three models were developed for prediction of Kappa number (Deterministic Model, Neural and Hybrid Model). The Deterministic Model includes mass transfer and reaction kinetics based on intrinsic parallel reactions of lignin, cellulose and hemicellulose. This divides the process of Delignification in 3 stages or phases, with the 3 phases correspond to 3 different types of lignin (initial, bulk and residual). The model is specific to the eucalyptus pulp (short fiber) and batch digester. One of the contributions to this proposed model were the inclusion of reactions for lignin, cellulose and hemicellulose total, carbohydrates, than the Kappa number. Deterministic model was used for experimental data collected in the RAIZ - Instituto de Investigação da Floresta e Papel and data generated by simulations. The operating variables used as input data were: thickness, initial temperature, effective alkali, liquor ratio wood, the cooking time, density and porosity. The Deterministic Model was developed for continuous digester, and was validated with industrial data for short fiber eucalyptus. The modeling done for a batch digester is the same as for a continuous digester, which are continuous in 3 to 4 steps inside the equipment. Wherefore the continuous digester is modeled as a single batch that fractionation (temperatures and times for each stage of the equipment and sequential manner). This study employed a method of optimization (Successive Quadratic Programming) to define the procedure for operation in continuous digester allowed to obtain the product (pulp) with levels below 1.5% of residual lignin. Industrially this value is around 3% of residual lignin. The Neural Model is proposed as "feedforward" and training by backpropagation. For this model the input variables were temperature, effective alkali and H-Factor. The variable output is the Kappa number. The number of hidden neurons was defined by the neural model that showed the smallest error for the set of validation and training. The number of interactions was also determined from the smallest error generated by simulations. This model was validated with experimental and industrial data. The hybrid model used as input variables and Kappa Neural theoretical, temperature, and factor H and the output variable is the number Kappa Hybrid. This was validated with industrial data. The models presented (deterministic, Neural and Hybrid) are useful tools for the manufacture of pulp and paper, since there is the possibility to be applied to simulation of processes, optimization and control. The models can be tested for different operating conditions without changing the output. Besides, allowing better control of some variables in the manufacturing process, ie without loss of quality of product. In this study, the neural network and the kinetic models showed similar results. Keywords: Kappa number, Deterministic Model, Neural Model and Hybrid Model / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:05:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Temer_Beatriz_M.pdf: 9784134 bytes, checksum: 1bdd018cb932c19745ec5d68cf0f0755 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Um dos principais desafios a serem superados para que a produção de etanol lignocelulósico seja viável é a obtenção de um micro-organismo capaz de fermentar pentoses e hexoses de maneira eficiente. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o principal micro-organismo utilizado nas fermentações industriais, devido à sua alta eficiência no consumo de glicose e tolerância às altas concentrações de etanol. Entretanto, linhagens selvagens dessa levedura não são capazes de consumir pentoses naturalmente. Desta maneira, a expressão heteróloga de genes que possibilitem o consumo de pentoses em S. cerevisiae é uma abordagem interessante que vem sendo desenvolvida por diversos grupos de pesquisa. A xilose é o açúcar de cinco carbonos presente em maior porcentagem nos materiais lignocelulósicos e é consumida pelos organismos através de duas vias principais, a via da xilose isomerase (XI) e a via oxi-redutiva. A bactéria Propionibacterium acidipropionici, industrialmente interessante por produzir ácido propiônico, foi estudada neste trabalho com relação à sua capacidade de consumir xilose. A partir dos ensaios de fermentação realizados, foi possível comprovar que ela é capaz de consumir este açúcar na msma proporção que a glicose. A análise de dados genômicos de P. acidipropionici indicou que a via da XI é a utilizada para o consumo de xilose. Assim, o gene xylA, que codifica a XI de P. acidipropionici, foi expresso em uma linhagem industrial de S. cerevisiae. Após a realização de testes fermentativos foi possível constatar que a linhagem construída não apresentou consumo de xilose. Apesar da expressão do gene xylA ser comprovada, não foi possível detectar atividade enzimática da XI, resultados que fornecem indícios de que a proteína pode não estar sendo sintetizada ou, caso esteja sendo sintetizada, não é funcional. Mais de 36 XIs provenientes de organismos diferentes já foram expressas em S. cerevisiae, dentre essas apenas 12 foram funcionalmente expressas. As causas da não funcionalidade na maioria das tentativas de expressão heteróloga das XIs são desconhecidas. Entretanto, alguns trabalhos afirmam que esse fenômeno pode estar relacionado ao enovelamento incorreto da xilose isomerase em S. cerevisiae. Desta forma, a expressão de genes que codificam chaperonas específicas é uma estratégia promissora para a obtenção de uma xilose isomerase funcional / Abstract: One of the main challenges to be overcome to enable the production of lignocellulosic ethanol is the development of a microorganism capable of fermenting pentoses and hexoses efficiently. Currently the yeast Saccharomyces cerevisiae is the main microorganism used in industrial fermentations due to its high efficiency in glucose uptake and tolerance to high concentrations of ethanol; however, it is not able to consume pentoses naturally. Thus the heterologous expression of genes that allow the pentose consumption in S. cerevisiae is an interesting approach that has been developed by several research groups. Xylose is the main component in lignocellulosic biomass, and is consumed by organisms through two main pathways, the xylose isomerase (XI) pathway and the oxy-reductive pathway. The bacterium Propionibacterium acidipropionici is industrially interesting for its production of propionic acid, and was studied in this work with respect to its ability to consume xylose. Fermentation assays conducted proved that these bacteria can consume xylose in the same proportion as glucose. The analysis of genomic data from P. acidipropionici indicated that the XI pathway is used to ferment xylose, in this manner the xylA gene encoding this species XI was expressed in an industrial strain of S. cerevisiae. After conducting fermentation tests it was found that the strain developed was not able to consume xylose even though the XI gene was expressed in the yeast. Moreover, it was not possible to detect enzymatic activity of XI, indicating that the protein is probably not being synthesized or it is not functional. Over 36 XIs from different organisms have been expressed in S. cerevisiae, among these only 12 were functionally expressed. The causes of non-functionality in most attempts at heterologous expression of the XIs are unknown, however, some studies claim that this event may be related to the absence of chaperones, which assist the correct folding of proteins. Thus the expression of genes that encode specific chaperone is a promising strategy to obtain functional expression of these XIs / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

A parede celular das plantas inclui componentes polissacarídeos complexos, e a sacarificação destes polímeros necessita da ação de conjuntos de enzimas que atuem em sinergia. Enzimas podem formar complexos multi-enzimáticos que possuem mais de uma atividade catalítica derivada de domínios distintos de uma mesma cadeia polipeptídica. O objetivo deste trabalho foi construir uma enzima bifuncional com os domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) para desconstrução de material lignocelulósico de cana-de-açúcar. Para isso, dois diferentes domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) oriundos de Clostridium thermocellum foram fundidas para criar a quimera feruloil esterase/acetil-xilano esterase (FaeAxe). O desenho racional da quimera foi feito utilizando-se de métodos computacionais, que permitiram a criação de um modelo estrutural da enzima. A construção da quimera foi feita por overlap PCR, clonada em vetor pET-SUMO e expressa em Escherichia coli. As duas enzimas parentais (Fae e Axe) foram clonadas em vetor pET28 e expressas em E. coli. Durante a etapa de expressão, observou-se que todas as enzimas foram expressas na forma solúvel. As enzimas feruloil esterase e acetilxilano esterase têm como substrato o polímero arabinoxilano, cuja degradação é uma etapa chave na sacarificação de biomassa. Dessa forma, as atividades da quimera, bem como das enzimas parentais foram testadas contra polímeros arabinoxilano de trigo e arabinoxilano de cana-de-açúcar após a hidrólise pela endoxilanase GH11 de Bacillus Subtilis e analisadas por meio de espectrometria de massas. A atividade desacetilase da enzima parental acetil-xilano esterase e da quimera FaeAxe foram confirmadas, evidenciando que a quimera preservou essa atividade catalítica. A atividade da enzima feruloil esterase e da quimera FaeAxe na remoção de ácido ferúlico dos oligossacarídeos gerados pela endoxilanase GH11 não foi observada / The plant cell wall is comprised of a matrix of polysaccharides and saccharification of these polymers requires the joint action of diverse enzymes. Enzymes may form multi-enzymatic complexes that have more than one catalytic activity derived from different domains of a single polypeptide chain. The aim of this work was to construct a bifunctional enzyme with two catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) for degradation of sugar cane lignocellulosic material. The two different catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) from Clostridium thermocellum were fused to generate a bifunctional chimera feruloyl esterase/acetylxylan esterase (FaeAxe). A molecular model was created by rational design using a 3D-structure guided strategy. The fusion was created using overlap PCR, and the resulting product was cloned into the pETSUMO vector. The chimeric protein and the parental enzymes were expressed in Escherichia coli and purified and the enzymes were expressed in soluble form. Xylanases, feruloyl esterases and acetylxylan esterases degrade arabinoxylan polymers and their activity is a key step in the saccharification of biomass. The catalytic properties of the chimera and of the parental enzymes were tested against wheat and sugarcane arabinoxylan polymers after hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis and analyzed by mass spectroscopy. The deacetylase activity of acetyl-xylan esterase parental enzyme and FaeAxe chimera were confirmed, showing that the chimera kept the deacetylase activity. After hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis the feruloyl esterase and FaeAxe chimera activities on ferulic acid removal were not observed

Submitted by Johnny Rodrigues (johnnyrodrigues@ufcg.edu.br) on 2018-03-21T17:37:53Z No. of bitstreams: 1 CLOTILDES ALVINO LEITE - DISSERTAÇÃOPPGEQ 2015..pdf: 1530644 bytes, checksum: 4f0be9aad8cd441b5b8a8799de442296 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-21T17:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CLOTILDES ALVINO LEITE - DISSERTAÇÃOPPGEQ 2015..pdf: 1530644 bytes, checksum: 4f0be9aad8cd441b5b8a8799de442296 (MD5) Previous issue date: 2015-02-03 / Capes / Apesar da ampla utilização das celulases, o seu elevado custo tem tornado alguns processos onerosos. Estudos vêm sendo desenvolvidos com objetivo de produzir essa enzima através de um processo de fermentação em estado sólido a partir de resíduos agroindustriais lignocelulósicos, diminuindo assim os custos de produção da enzima, e agregando valor ao resíduo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção enzimática de celulases pelo fungo filamentoso Trichoderma reesei LCB 48 por fermentação em estado sólido utilizando a fibra de sisal como substrato. Foi realizada a caracterização da fibra de sisal visando conhecer sua composição física, físico-química e química. A caracterização mostrou que este substrato tem potencial para ser utilizado na fermentação para produção de enzimas celulolíticas, principalmente por ter apresentado um percentual de alfacelulose satisfatório (58,40%), que é indutor dessas enzimas e pH ácido ideal para a produção de enzimas em fermentação em estado sólido com fungos (4,35). Foi realizada a fermentação utilizando o microrganismo Trichoderma reesei LCB 48 com uma concentração de 107 esporos/g, a uma temperatura de 28 ºC, em substrato com 70, 80 e 90% de umidade e suplementação com os meios básico indutores da atividade enzimática de Mandels e Weber. Amostras foram coletas ao longo do processo para análises de pH, umidade, açúcares redutores e atividade enzimática, expressa em carboximetilcelulase, até um tempo de 474 horas. A maior atividade enzimática obtida para a fibra de sisal foi de 1,21 U/g em 450 horas de fermentação, em substrato com 70% de teor de água, sendo um fator positivo devido a redução do uso de água no processo fermentativo. / Despite the wide use of cellulases, the high cost has made some expensive processes, studies have been developed in order to produce this enzyme through a process of solid state fermentation from lignocellulosic agroindustrial residues, thereby reducing the production costs of enzyme, and adding value to waste. The objective of this study was to evaluate the enzymatic production of cellulases by the filamentous fungus Trichoderma reesei LCB 48 by solid state fermentation using sisal fiber as substrate. The characterization of sisal fiber was performed to meet their physical composition, physico-chemical and chemical. The characterization demonstrated that this substrate has the potential to be used in the fermentation for production of cellulolytic enzymes, especially for introducing a satisfactory alfacelulose percentage (58.40%), which is inducer of these enzymes and acid pH optimum for the production of enzymes in solid state fermentation with fungi (4.35). Fermentation was performed using the microorganism Trichoderma reesei LCB 48 with a concentration of 107 spores/g, at a temperature of 28 °C, substrate at 70, 80 and 90% humidity and supplementation with the basic means of inducing enzyme activity of Mandels and Weber. Samples were collected during the process to pH, moisture, reducing sugars and enzymatic activity, expressed as carboxymethylcellulase, until a time of 474 hours. The higher enzyme activity obtained for sisal fiber was 1.21 U/g in 450 hours of fermentation, in a substrate with 70% water content, a positive factor due to reduction of water use in the fermentation process.

Orientador: Leila Peres / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-11T09:27:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_Deniltonda_D.pdf: 3140539 bytes, checksum: 167c6095412deb4ab1d9dd96d26efcb7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Na indústria de papel e celulose os processos de separação por membranas, como a ultrafiltração (UF) e a nanofiltração (NF), são utilizados para a recuperação de diversas espécies presentes nos resíduos da digestão da madeira que são atrativos para outras aplicações, tais como a lignina e açúcares, e em especial os lignossulfonatos, auxiliando também na recirculação de água do processo e na redução do teor poluente do efluente. Devido à sua gama de aplicações, existe hoje um mercado próprio de industrialização de lignossulfonatos obtidos a partir de subprodutos da indústria de papel, contexto em que se insere o interesse deste trabalho que teve como objetivo o estudo da recuperação por nanofiltração, no retentado, da fração de lignossulfonatos de baixa massa molar (<5000 g/mol) que não é recuperada pelo processo prévio de ultrafiltração do efluente de indústria de papel com processo sulfito, empregando membranas poliméricas comerciais NF e NF270, fornecidas pela Filmtec, Dow Liquid Separations, EUA. Os experimentos e as análises foram realizados de acordo com um planejamento experimental fatorial 2² (duas variáveis, dois níveis), em duplicata, onde as variáveis de processo estudadas foram: tipo de membrana e a pressão. As variáveis de resposta estudadas foram: fluxo de permeado, retenção baseada nos sólidos totais e na absorbância UV-VIS, massa molar média, condutividade e pH. A temperatura utilizada foi de 45°C e a placa suporte com 43,7% de área perfurada. O planejamento experimental possibilitou a determinação de modelos matemáticos para a previsão do fluxo de permeado de água pura e fluxo de permeado de amostra de lignossulfonato em função das variáveis estudadas, e para estes parâmetros os melhores resultados foram alcançados com as variáveis em nível superior: membrana NF270 e pressão 24 bar. A avaliação da retenção de lignossulfonatos, tanto através da análise de sólidos totais (diminuição de até 51,79% no teor de sólidos totais), bem como através da leitura de absorbância UV 280 nm (diminuição de até 84,26%, na absorbância), apresentou os melhores resultados com as variáveis em nível inferior: membrana NF e pressão 18 bar, como era esperado. Na análise da massa molar média de lignossulfonatos, realizada por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC), o processo de nanofiltração apresentou capacidade de fracionamento, com Massa Molar Ponderal Média ( w M ) de 1994 g/mol para a alimentação, 2327 g/mol para o retentado e 1043 g/mol para o permeado. Para o estudo do conteúdo iônico (condutividade e pH) os resultados não apresentaram significância estatística. Estudo preliminar também foi realizado com o objetivo de avaliar a influência da área perfurada da placa-suporte da membrana no fluxo de permeado e permeabilidade hidráulica, utilizando-se três diferentes tipos de placa metálica como suporte para as membranas, todas com área total filtrante de membrana de 15,90 cm², mas com diferentes áreas perfuradas em relação à área total filtrante: 25,3%, 36,5% e 43,7% de área perfurada, respectivamente. Este estudo apresentou melhores resultados de fluxo para a maior área perfurada, indicando que para comparações entre valores de fluxo de permeado obtidos em células de fluxo perpendicular, é fundamental a informação da área perfurada da placa-suporte / Abstract: Membrane separation processes like ultrafiltration (UF) and nanofiltration (NF) are used in the pulp and paper industry to the recovery of several species present in the wood digest waste that are interesting to other applications as lignin, sugars and specially lignosulfonates, improving the recirculation of the water in the pulping process and the reduction of the pollutants in the waste water as well. Due to their wide range of applications, there is presently a specific market for lignosulfonates obtained from paper industry as byproducts, context where this study is inserted. The main objective is to recover by nanofiltration (NF) the low molecular weight lignosulfonates fraction (<5000 g/mol) from the permeate produced in a previous current ultrafiltration process of the paper industry effluent with sulphite process, using polymeric membranes NF and NF270, supplied by Filmtec, Dow Liquid Separations, USA. The assays and the analysis where conducted according to a 22 full factorial design (two variables, two levels), where the studied independent variables were: type of membrane and pressure. The studied dependent variables were: permeate flux, retention based on total solids and on UV-VIS absorbance, average molecular weight, conductivity and pH. The temperature used was 45°C and the perforated area of the support plate was 43.7%. The used full factorial design enabled the determination of mathematical models to predict the permeate flux of pure water and of lignosulfonate samples as a function of the studied variables. The best results to these parameters were achieved with the variables at the superior level values: membrane NF270 and pressure of 24 bar. The evaluation of the lignosulfonates retention using the total solids data (decrease of up to 51.79% in total solids in the permeate) or using the UV 280 nm absorbance data (decrease of up to 84.26% in absorbance in the permeate), as expected presented the best results with the variables at the inferior level values: membrane NF and pressure of 18 bar. In the analysis of the averaged molecular weight of lignosulfonates obtained by Gel Permeation Chromatography (GPC), the nanofiltration process presented fractioning capacity with Averaged Molecular Weight ( w M ) of 1994 g/mol to the sample, 2327 g/mol to the concentrated and 1043 g/mol to the permeated. The results have not presented statistical significance to the ionic content (conductivity and pH). Preliminary study were also conducted to estimate the influence of perforated area (%) of metallic plates used to support the membranes in the permeate flux and hydraulic permeability, using three different types of metallic support plates, each one with a total filtration membrane area of 15.90 cm2, but with different perforated areas (%) related to the total filtration area: 25.3%, 36.5% and 43.7%. This study presented better water permeate flux results to the biggest perforated area, indicating that when comparing permeate flux values obtained in perpendicular flux cells, the information of the perforated area (%) of the support plate is important / Doutorado / Ciencia e Tecnologia de Materiais / Doutor em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:08:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caroline Mariana de Aguiar.pdf: 5014872 bytes, checksum: 64beb98ea03bbb601831a3ce234b8c31 (MD5) Previous issue date: 2010-02-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lignocellulosic materials are the most abundant residues in the world and there is a worldwide concern to use them as raw material for bioethanol production. This is possible because these materials are rich in cellulose. Cellulose is a biopolymer composed of glucose molecules linked by ß-1-4 glycosidic bonds. Glucose can be converted into ethanol by fermentation and can be obtained from cellulose by enzymatic hydrolysis using cellulases. The cellulases can be produced by several microorganisms under appropriate environmental conditions. Amongst these microorganisms is the fungus Aspergillus niger. In this work, cellulases were obtained by fermentation cultivating A. niger in broth containing pretreated lignocellulosic materials such as sugarcane bagasse, corn straw or wheat straw as the only carbon source. The fermentation kinetic was observed when the pretreated sugarcane bagasse was used as the carbon source. Several variables that affect the enzymatic hydrolysis were analyzed using the three pretreated lignocellulosic materials as hydrolysis substrate. The variables analyzed were: pH, temperature, time of the hydrolysis, mass fraction of the substrate and dilution of the enzymatic broth. The pretreatment of the lignocellulosic materials is paramount for exposing the cellulose chain. Pretreatment consisted of using 4%w/w NaOH solution or 1%w/w H2O2 and their efficiency for removing the lignin from the residues were evaluated. The enzymatic activity also was evaluated by submeting the lignocellulosic materials to successive enzymatic hydrolysis. The enzyme deactivation was evaluated by cooling or freezing the enzymatic broth. It was concluded that Aspergillus niger produces cellulases when grown on medium with pretreated lignocellulosic materials as carbon source. Considering the fermentation kinetic, the ideal time to collect the enzymatic broth with maximum productivity was about 7 days. The cellulase complex does not suffer considerable deactivation when stored at -18°C (freezer) for 43 days, however, the broth activity drops by 43% after 48 hours when stored at 4°C (fridge). The corn straw showed better results as carbon source in fermentation and as substrate hydrolysis, compared with the other materials, with enzymatic activity of 0.895 U/ml. The ideal pH to conduct the enzymatic hydrolysis was 4.8 at 50°C for 50 minutes. The mass fraction of the substrate and enzyme concentration affects the enzymatic activity by a linear dependence. The pretreated materials provided higher enzymatic activity results than the untreated materials. The highest activity enzymatic results were obtained with H2O2 treated substrates, with enzymatic activity of 0.655 U/ml for the sugarcane bagasse, 0.892 U/ml for the corn straw and 0.801 U/ml for the wheat straw. Also, the results show that the H2O2 pretreated materials can be submitted up to, at least, four successive hydrolysis with the second one yielding the highest enzymatic activity for all pretreated residues. / Os resíduos lignocelulósicos são os mais abundantes no mundo e atualmente há uma preocupação mundial em aproveitá-los como matéria-prima na produção de bioetanol. Isto é possível visto que tais resíduos são ricos em celulose. A celulose é um biopolímero composto por moléculas de glicose unidas por ligações glicosídicas ß-1-4. A glicose pode ser transformada em etanol por via fermentativa e pode ser obtida da celulose via hidrólise enzimática utilizando as enzimas celulases. As celulases podem ser produzidas por diversos micro-organismos sob condições adequadas. Dentre esses micro-organismos, destaca-se o fungo Aspergillus niger. Neste trabalho, celulases foram obtidas cultivando-se A. niger em meio de cultura com os resíduos lignocelulósicos bagaço de cana-de-açúcar, palha de milho e palha de trigo pré-tratados com NaOH 4% como única fonte de carbono. Observou-se a cinética da fermentação com bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com NaOH 4% como fonte de carbono. Foram analisadas diversas variáveis que afetam a hidrólise enzimática utilizando os três resíduos lignocelulósicos pré-tratados com NaOH 4% como substrato. As variáveis analisadas foram: pH, temperatura, tempo de hidrólise enzimática, fração mássica de substrato e diluição do caldo enzimático. Avaliou-se a eficiência dos pré-tratamentos dos resíduos com NaOH 4% e com H2O2 1%. Avaliou-se o comportamento da atividade enzimática submetendo os resíduos lignocelulósicos a hidrólises enzimáticas sucessivas. A desativação enzimática foi avaliada nas condições de resfriamento e congelamento do caldo enzimático. Nas condições estudadas, foi concluído que o Aspergillus niger produz celulases quando cultivado em meio com resíduos lignocelulósicos pré-tratados como fonte de carbono. O tempo ideal para coleta do caldo enzimático, com produtividade máxima, foi de aproximadamente 7 dias. O complexo celulásico não sofre desativação se armazenado a temperatura de -18°C (freezer) por 43 dias, mas perde sua atividade em 43% após 48 h se armazenado a 4°C (geladeira). A palha de milho apresentou melhores resultados como fonte de carbono na fermentação e como substrato na hidrólise, comparada com os outros resíduos, com atividade enzimática de 0,895 U/mL. O pH ideal para se conduzir a hidrólise foi 4,8 na temperatura de 50ºC por 50 minutos. A fração de substrato e a concentração das enzimas afetam linearmente a atividade enzimática. Os resíduos pré-tratados proporcionaram melhores resultados de atividade enzimática do que os resíduos não tratados. Os melhores resultados de atividade foram obtidos com os resíduos tratados com solução de H2O2 1%, com atividade de 0,655 U/mL para o bagaço de cana, 0,892 U/mL para a palha de milho e 0,801 U/mL para a palha de trigo. Além disso, os resíduos tratados com H2O2 podem sofrer quatro processos de hidrólise sucessivos, com o segundo processo rendendo a maior atividade enzimática para todos os resíduos pré-tratados.