Overexpression of Phosphoenolpyruvate carboxykinase - cytosolic (PEPCK, encoded by Pck-1 gene) has been found to be associated with the prevalence of hyperglycemia in Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) patients. The Pck-1 enzyme catalyzes the rate limiting step in endogenous glucose production. The aims of this study are to develop a Pck-1:eGFP reporter zebrafish and validate it as a potential tool for the screening of novel anti-diabetic compounds. 3.6 kb zebrafish Pck-1 promoter fragment was cloned and a Pck-1:eGFP expression vector was constructed. After DNA microinjection, we generated Pck-1:eGFP reporter zebrafish with strong eGFP expression in developing liver. Validation studies confirmed that Pck-1:eGFP zebrafish embryos responded to treatment of glucose, cAMP and dexamethasone, metformin and rosiglitazone similarly to that of humans. This novel Pck-1:eGFP reporter fish line can serve as a tool for the screening and development of novel anti-diabetic drugs that may have potential in the treatment of T2DM.

Studies of individual cells via microscopy and microinjection are a key component in research on gene functions, cancer, stem cells, and reproductive technology. As biomedical experiments become more complex, there is an urgent need for robotic systems to: improve cell manipulation, increase throughput, reduce lost cells, and improve reaction detection. Automation of these tasks using visual servoing creates significant benefits for biomedical laboratories including repeatability of experiments, higher throughput, and a controlled environment capable of operating 24 hours a day. In this work the design and development of a new five degree-of-freedom biomanipulator designed for single-cell microinjection, is described. The biomanipulator employs three degrees of linear motion and two degrees of rotation. This provides the ability to manipulate/micro-inject cells at varying orientations, thereby increasing flexibility in dealing with complex operations such as injecting clustered cells. The capability of the biomanipulator is shown with preliminary experimental results using mouse myeloma cells.

La miniaturisation des pièces est une étape importante pour la progression de la microtechnologie dans plusieurs domaines (connectique, médical, optique, microsystèmes mécaniques). Pour cela, le moulage par microinjection, semble être la solution clé pour la production à grande échelle de micro-composants de polymères. Pour les polymères semi-cristallins, la cristallisation, sous fort taux de cisaillement et sous des vitesses de refroidissement élevées (about 100 K/s), induit des morphologies et des propriétés spécifiques. Elle prend donc une importance considérable dans le processus de microinjection par rapport au moulage par injection classique où les épaisseurs injectées sont généralement supérieures à 1 mm. Ces microstructures ont une grande influence sur les propriétés mécaniques du produit final. La prédiction de ces propriétés à partir de la description de la microstructure est un défi technique et scientifique. Durant cette thèse, deux polymères semi-cristallins ont été microinjectés, le polyéthylène haute densité et le polyamide 12. Les analyses obtenues par la microscopie otiques montrent que les morphologies cristallines varient entre les micro- et les macro-pièces. Tandis que la morphologie de 'peau-cœur' est présente dans les macropièces, les micropièces présentent une morphologie plutôt particulière. Les analyses combinées de diffusion et de diffraction des rayons X (SAXS et WAXS) avec un microfaisceau synchrotron, nous ont permis de déterminer la microstructure induite par le processus de microinjection dans toute l'épaisseur des pièces. Nous avons constaté que la morphologie et les orientations cristallines induites sont très dépendantes des conditions d'injection ou de microinjection. Une diminution de l'épaisseur, de la vitesse et de la température du moule, augmente l'orientation cristalline en limitant la relaxation des chaînes de polymères.

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Reproductive containment in farmed fish is highly desired for sustainable aquaculture to prevent genetic introgression with wild conspecifics and enhance productivity by suppressing sexual maturation. A number of strategies have already been implemented or have been tested in commercially important fish (e.g. triploidy, monosexing, hormonal therapies); however, they either do not result in 100% containment, or they cannot be applied to all species. One promising new approach consists in disrupting primordial germ cells (PGCs), at the origin of germline cells, to induce sterility. The work carried out in this doctoral thesis aimed to investigate the genes involved in the survival of germ cells and subsequently conduct a functional analysis of candidate genes using CRISPR/Cas9 gene editing system to ultimately provide the basis for the development of a novel sterilisation technique. Nile tilapia was chosen as the experimental animal as it is a major aquaculture species worldwide and the control of reproduction plays a critical role in the farming productivity in this species. In addition, the species has clear advantages as its whole genome sequence is accessible, the generation time is relatively short and zygotes can be available all year round. Initially, a panel of 11 candidate genes with reported roles in survival of PGCs was investigated during the ontogenic development which led to the selection of piwi-like (piwil) gene as a target for genome editing. Then, high temperature was tested as a means to induce germ cell loss to better understand the mechanism underlying germ cell survival and apoptosis, and this study confirmed the functional importance of piwil genes in relation to germ cell loss and proliferation. In addition, the study suggested potential subfunctionalisation within the Bcl-2 gene family which requires further investigation. The next step aimed to optimise the CRISPR/Cas9 gene editing method by improving the microinjection system and testing different concentrations of sgRNAs. Over 95% of injected embryos showed on-target mutation in piwil2 via zygote injection of CRISPR/Cas9 reagents and complete KO larvae were shown in half of the mutants, producing putative sterile fish. However, there was no clear association between the phenotypes in PGCs and the mutation rate. Further comparative studies of mutant screening methods including T7E1, RGEN, HRMA, fragment analysis and NGS revealed that the genotypes of F0 are highly mosaic, suggesting that deep sequencing is recommended for accurate and high throughput F0 screening and further improvement for predictable genome editing is required for a reliable gene functional analysis in F0. In summary, the current thesis provided new scientific knowledge and supporting evidence for the use of the CRISPR/Cas9 gene editing platform to study gene function associated with sterility, with the ultimate goal to develop an alternative sterilisation method in fish.

Ce travail de thèse, inscrit dans le cadre du projet FUI ConProMi, se propose d'étudier les mécanismes intervenant durant la phase de réplication par micro-injection de pièces en polymères amorphes. Dans ce but, un outil spécifique dénommé « La Rotonde » a été développé, pour réaliser des pièces d'épaisseurs variables, tout en suivant les conditions de pressions et températures locales. Les mesures de ces conditions ont montré que les écoulements de polymère à l'état fondu, dont d'un copolymère d'oléfines cycliques (COC), variaient en fonction de l'épaisseur de la cavité. L'analyse de ces résultats a permis de proposer une nouvelle loi de comportement reliant les pertes de charge dP à l'épaisseur de la cavité, selon une loi Puissance: dP~1/e^a. L'extrapolation de cette loi à des épaisseurs décroissantes nous a permis de prédire la limite physique de fabrication d'objets par micro-injection, connue de façon empirique dans l'industrie de la plasturgie ; la fabrication de pièces d'épaisseurs inférieures à 0.19 mm (ou de facteur de forme supérieur à 45) est en effet impossible du fait des pertes de charges trop importantes lors de l'écoulement du polymère dans la cavité. Il a ainsi été démontré que La Rotonde est un véritable rhéomètre interne, mesurant les viscosités du COC dans la cavité lors de son écoulement, en intégrant l'influence de la compressibilité de la matière. Une attention particulière a enfin été portée sur l'échantillon de plus faible épaisseur injectable (0.27 mm), afin de mieux appréhender les mécanismes s'opposant à l'écoulement du polymère fondu. Ces travaux ont révélé des viscosités élevées et des contraintes de cisaillement supérieures aux valeurs seuils rapportées dans la littérature pour expliquer le phénomène de glissement des chaînes macromoléculaires à l'interface paroi/polymère. Une analyse morphologique fine a été entreprise afin d'observer et identifier les mécanismes impliqués lors du remplissage des pièces. Cette étude spécifique a permis de révéler la présence de multiples écoulements secondaires, localisés à proximité du seuil et dont le nombre croit fortement avec la réduction d'épaisseur. Ces défauts ont tendance à disparaitre le long de l'écoulement et à former des lignes de recollement. Ce résultat original montre que le modèle d'écoulement Fontaine relatif au remplissage des cavités en injection a été mis en défaut dans le cas de la micro-injection. La dernière partie de cette étude a été consacrée à l'analyse des conséquences de ces écoulements secondaires sur les propriétés physiques des pièces en COC. Les mesures de biréfringence ont permis de mettre en évidence des niveaux de contraintes internes particulièrement élevés à proximité du seuil, qui sont favorisées par la phase de maintien. Ces contraintes ont été par ailleurs directement corrélées avec la réduction d'épaisseur. Les variations des propriétés physiques et en particulier mécaniques dynamiques des micro-pièces ont été reliées à l'histoire thermomécanique subie par les échantillons, avec notamment des augmentations des propriétés élastiques et de densité liées aux cinétiques de refroidissement croissantes avec la réduction d'épaisseur. Les variations de mobilité moléculaire à grande distance des chaînes macromoléculaires du polymère considéré ont été corrélées au phénomène de vieillissement physique, ou à la présence de défauts structurels générés lors de l'écoulement. D'un point de vue industriel, une telle étude a permis de proposer des préconisations sur l'optimisation des conditions de mise en œuvre en micro-injection d'objets de tailles réduites, en expliquant l'origine du verrou technologique relevé industriellement. A la lumière de ces résultats, des solutions technologiques pourront être proposées, pour reculer les limites de fabrication de micro-objets en favorisant le glissement des chaines macromoléculaires à l'interface paroi/polymère ou formuler de nouveaux polymères spécifiques pour ce secteur d'activité. / This work, done within the framework of a FUI project (ConProMi), endeavoured to study the mechanisms involved within amorphous polymers during the replication of micro-parts by microinjection moulding. A specific mould called “La Rotonde” has been developed to realise parts with variable thicknesses, and to follow the local pressure and temperature conditions during the moulding phase. The in-situ measurements show that the polymer flow is greatly affected by the cavity thickness, in the particular case of cyclic olefin copolymer (COC). Indeed, the pressure drops dP increases with the thickness e and respect a power law, through the expression dP~e^a. The extrapolation to lower thicknesses gives a physical limit for the manufacturing of micro-parts by injection moulding, known empirically in the plastic industry. The moulding of a 0,19mm thick part (or aspect ratio upper than 45) is impossible due to the pressure drops involved. Therefore, “La Rotonde”, as an internal rheometer, allows measuring the COC viscosity under real process conditions, integrating the material compressibility. A focus has been made for the smaller parts (0,27mm thick) to study the mechanisms involved within the polymer flow. Higher viscosities and shear stresses are found for this cavity, and close to the values corresponding to the appearance of wall-slip phenomenon at the interface between the polymer and the cavity. A morphological analysis of short-shots reveals the presence of multiple secondary flows close to the injection gate, creating weld-lines. This phenomenon is clearly broadened with decreasing thicknesses, but it seems to disappear away from the injection gate. Therefore, this original result show that the classical fountain flow, used to describe the polymer flow behaviour, is not sufficient in the case of polymer flows within micro-cavities. As a consequence, each sample's morphology has been studied and related to the physical properties of COC. A specific analysis of the local birefringence has been developed in order to quantify the residual internal stresses. The internal stresses profiles normal to the flow direction are parabolic for all the samples, and the levels of maximum stresses reached increases with reducing thickness. The dynamic mechanical properties are history-dependent according to the former thermomechanical conditions. The elastic properties tend to increase together with the density when the thickness decreases, partly explained by the enhancement of the cooling rates. The differences observed for the molecular mobility of the macromolecular chains have been correlated to physical ageing and/or at the presence of structural defects during the moulding phase. With regards to the results observed, some recommendations are drawn regarding the optimization of the process conditions for the manufacturing of parts by micro-injection moulding. At last, different solutions are given to overcome the physical limitation to produce micro-parts, like controlling the wall-slip phenomenon at the interface between polymer and cavity or compounding new polymers with specific rheological behaviours.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung von Sensoren in einer neuen, großserienfähigen Technologie. Mit dem Mehrkomponentenmikrospritzgießverfahren werden mechanische Sensorstrukturen aus (faserverstärktem) Kunststoff an polymere piezoelektrische Wandler angebunden. Die hergestellten Aufnehmer können über die Weiterverarbeitung mit Hybridtechnologien für die Strukturintegration eingesetzt werden. Diese Dissertation stellt Entwurfsmethoden und Modelle zur Vorausberechnung der neuartigen Sensoren bereit, die zur Qualifizierung der neuen Technologie benötigt werden. Dazu werden bekannte Modellierungsansätze angewandt und wesentliche Erweiterungen für die praktische Nutzung erarbeitet. Entwurfsrelevante technologieabhängige Kenngrößen, wie die elastischen Eigenschaften der verarbeiteten Werkstoffe und die geometrischen Dimensionen der hergestellten Sensorstrukturen werden untersucht und deren Einfluss auf den Entwurfsprozessdargelegt. Die hergestellten Sensoren werden in ihrer Grundfunktion messtechnisch charakterisiert und die System- und Strukturintegration vorgestellt. / The presented work describes the development of sensors in a novel technology approach feasible for large-scale production. By using the multicomponent microinjection molding process, mechanical sensor structures out of (fiber-reinforced) polymers are joined with piezoelectric polymer transducers. The fabricated sensors can be processed further with hybrid manufacturing technologies and adapted for structure integration. This thesis introduces design methods and models for the preliminary calculation of the novel sensors, which are required for a technology qualification. Therefore, existing modelling approaches adapted and essentially extended for practical use. Design relevant parameters related to the technology like the elastic properties of the applied materials or the geometric dimensions of the manufactured sensor structures are characterized and the system and structure integration of the sensors is presented.

活動性拒食症(ABA)とは、食事時間の制限と過剰なランニングによって引き起こされる摂食障害である。本論文では、ABAモデルラットが示す摂食障害に、脳の孤束核がどう関わっているかを検証した。第一実験は、筆者の立てた仮説に基づき、オピオイドの役割が中枢性か末梢性かについて、孤束核にナロキソンを直接投与し、その影響を調べた。第二実験では、第一実験の結果を踏まえ、ABAラットの孤束核を破壊し、その影響を調べた。 / Active anorexia (ABA) is an eating disorder caused by restricted meal times and excessive running. This study examined the involvement of the nucleus of the solitary tract (NST) of the brain in ABA model rats. In the first experiment, based on the hypothesis previously formulated by the author, naloxone was microinjected into the NST. This was to determine whether the opioid worked in the central or peripheral mechanisms. In the second experiment, based on the results of the first experiment, the NSTs of rats were lesioned and the effects were examined. / 博士(理学) / Doctor of Philosophy in Science / 同志社大学 / Doshisha University

No / Advances in micromoulding technology are now allowing mass production of complex, three-dimensional functional products having sub-milligram masses and carefully tailored surface finishes. In order to create a viable manufacturing process for these components, accurate process monitoring and product evaluation are essential in order to highlight process problems and production of substandard parts. The present study describes work implementing a suite of sensors on a commercial micromoulding machine for detailed process interrogation. Evaluation of demoulded products is performed with a single camera based system combined with custom software to allow for three-dimensional characterisation of products during the process.