Les cellules vivantes sont capables de réagir aux signaux mécaniques tels que la rigidité de la surface sur laquelle elles adhèrent, les forces de tractions ou compressions auxquelles elles sont soumises, le flux de liquide à la surface de leur membrane ou encore la géométrie de leurs adhésions ou de leur forme globale. Ces signaux influent sur des processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la migration et la mort cellulaire. Ces processus sont finement régulés par des réactions biochimiques qui forment un réseau de signalisation. La mécanotransduction est la traduction du signal mécanique en signal biochimique.C’est dans le but d’étudier la mécanotransduction que nous avons étudié l’utilisation d’ultrasons pour stimuler mécaniquement les cellules à des fréquences temporelles et spatiales relativement élevées. De nombreux montages expérimentaux et de nombreuses voies ont été considérées dans cette partie très exploratoire. Nous en retenons finalement des pistes prometteuses pour la continuation future de ce projet.Nous avons développé ce que nous nommons des substrats actifs, qui nous permettent de contrôler à la fois spatialement et temporellement la stimulation mécanique appliquée à des cellules vivantes. Ces substrats actifs consistent en des micropiliers de fer incrustés dans un élastomère peu rigide (PDMS) et manipulés par deux électroaimants. Nous pouvons contrôler dynamiquement le déplacement des piliers qui vont déformer localement et de manière continue la surface. Cette déformation va ensuite déformer en traction ou en compression les cellules vivantes étalées sur la surface à proximité. En employant des marqueurs fluorescents nous pouvons réaliser de la Microscopie de Forces de Traction et surveiller la contrainte appliquée par les piliers aux cellules à travers la surface de PDMS, et nous pouvons étudier la réponse mécanique des cellules. De plus, ces substrats sont compatibles avec la microscopie de fluorescence en cellule vivante, ce qui rend possible l’observation de la réponse cellulaire au niveau morphologique (forme des adhésions focales, activité protrusive, …) et surtout biochimique.En effet, pour étudier la réponse biochimique des cellules après une stimulation mécanique, nous observons par microscopie de fluorescence des biosenseurs portant des paires de fluorophores donneur/accepteur. Ces biosenseurs nous permettent d’observer l’activité de protéines impliquées dans la signalisation cellulaire en calculant l’efficacité de Transfert d’Énergie Résonnant de Förster (FRET) de ces biosenseurs. Pour ce faire, les échantillons sont illuminés alternativement aux longueurs d’ondes d’excitation des fluorophores donneurs puis accepteurs. Le signal de fluorescence est collecté simultanément dans un canal d’émission du donneur et un canal d’émission de l’accepteur. Une grande partie de ma thèse a été consacrée à la mise au point d’une méthode quantitative pour analyser les images de fluorescence afin de mesurer une efficacité de FRET qui ne dépende pas de facteurs expérimentaux ni de la quantité de biosenseurs présents dans les cellules. Nous évaluons alors les différentes méthodes pour déterminer les facteurs de correction répandus corrigeant le débordement de spectre du donneur dans le canal accepteur et l’excitation directe de l’accepteur à la longueur d’onde d’excitation du donneur. Pour obtenir des mesures plus quantitatives, nous avons mis au point une nouvelles méthode pour déterminer 2 facteurs de correction supplémentaires. Nous comparons cette méthode à la seule préexistante et évaluons l’influence des paramètres de traitement des images sur les valeurs d’efficacité de FRET mesurées. / Living cells can react to mechanical signals such as the rigidity of the surface they adhere on, the traction or compression forces applied on them, the liquid flow at their membrane surface or the geometry of their adhesions or of their overall shape. Those signals influence cellular processes such as proliferation, differentiation, migration or cell death. Those processes are tightly regulated by biochemical reactions that constitute a signaling network. Mechanotransduction is the translation of the mechanical signal into the biochemical one.In order to study mechanotransduction, we have considered the use of ultrasounds to mechanically stimulate cells at relatively high temporal and spatial frequencies. Numerous setups and options have been considered in this very exploratory project. Finally, we will retain some promising leads for the continuation of this project.We have developed what we call active substrates that allows us to control both spatially and temporally the mechanical stimulation on living cells. Those active substrates consist of iron micropillars embedded in a soft elastomer and actuated by 2 electromagnets. We can control dynamically the displacement of the pillar that will deform locally and continuously the surface. This deformation will then deform in traction or in compression the living cells spread on the surface nearby. Thanks to fluorescent trackers we can perform Traction Force Microscopy and monitor the stress applied by the pillars to the cells through the PDMS surface, and we can look at the mechanical response of the cells. Moreover, those substrates are compatible with live cell fluorescence microscopy, which makes possible the observation of the cellular response at the morphological level (focal adhesions, protrusive activity, …) and most importantly at the biochemical level.Indeed, in order to study the cellular biochemical response after a mechanical stimulation, we use fluorescence microscopy to observe biosensors containing pairs of donor/acceptor fluorophores. Those biosensors allow us to monitor the activity of proteins implied in cellular signaling by computing the Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiency of those biosensors. To do so, samples are alternatively excited at donor and acceptor excitation wavelengths. The fluorescence signal is then simultaneously measured in donor and acceptor emission channels. A substantial part of my thesis has been dedicated to the development of a quantitative method to analyze fluorescence images in order to measure FRET efficiencies that do not depend on experimental factors or biosensors concentration in cells. We assess different methods to compute standard correction factors that account for spectral bleed-through and direct excitation of acceptors at donor excitation wavelength. To obtain more quantitative measurements, we have developed a new method to compute 2 additional correction factors. We compare this method with the only one preexisting, and we assess the influence of image processing parameters on FRET efficiency values.

Ce mémoire rassemble les résultats des travaux de recherche que j'ai menés au cours des dix dernières années au laboratoire Kastler Brossel au sein de l'équipe ``Optique et Biologie''. Nos travaux s'articulent autour de la détection optique de molécules individuelles, notamment pour la biologie. Nous utilisons dans ce but des sondes fluorescentes aux propriétés optiques remarquables : les nanocristaux semi-conducteurs. Je me suis concentré sur la visualisation par microscopie de fluorescence des interactions ADN-protéines à l'échelle de la molécule unique. Notre approche consiste à étendre et à accrocher des molécules d'ADN à une surface en s'inspirant des techniques de peignage moléculaire. Notre but est de visualiser directement le mouvement le long de la molécule d'ADN d'une protéine marquée à l'aide de nanocristaux ou de colorants organiques. La proximité entre la surface et l'ADN nous permet de visualiser ce mouvement par microscopie en onde évanescente. Nous nous sommes concentrés sur l'enzyme de restriction EcoRV, et en particulier sur la ``diffusion facilitée'' de cette enzyme sur l'ADN étiré du bactériophage T7. Nous sommes parvenus à observer la diffusion d'EcoRV, marquée avec des nanocristaux, le long de l'ADN étiré. Nous avons montré que le glissement des protéines le long de la chaîne d'ADN est le mécanisme le plus probable qui sous-tend la diffusion facilitée d'EcoRV. Nous avons observé des sauts de l'enzyme le long de l'ADN sur des distances importantes. L'analyse de la distribution de ces sauts nous a permis de proposer une vision synthétique de la diffusion facilitée.

Certaines protéines qui interagissent avec l'ADN sont capables de trouver rapidement une séquence spécifique de quelques paires de bases. Pour expliquer ce phénomène connu des biologistes depuis longtemps, plusieurs mécanismes de localisation appelés diffusion facilitée ont été proposés. Tous supposent une association initiale à de l'ADN non spécifique, suivie d'une translocation le long de l'ADN jusqu'au site de reconnaissance. Le mécanisme qui sous-tend cette translocation est toujours discuté. Il pourrait impliquer une diffusion linéaire (sliding) et/ou une série de sauts (jumping). <br />Pour élucider ce mécanisme, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence par onde évanescente pour visualiser l'interaction non spécifique de l'enzyme de restriction EcoRV. Dans nos expériences in vitro, l'ADN est étiré au dessus d'une surface et les enzymes sont couplées à des fluorophores. Nous avons ainsi visualisé les processus de sliding et de jumping et mesuré le coefficient de diffusion 1D des enzymes (D1 ~ 0,01 µm2.s-1) ainsi que le nombre de saut par interaction (~ 20). Un modèle simple a permis à partir des résultats expérimentaux de caractériser la diffusion facilitée d'EcoRV.

L'objectif de cette thèse est de définir la chorégraphie de ségrégation des deux chromosomes circulaires de Vibrio cholerae, c'est à dire le positionnement de l'information génétique au cours de la croissance de la cellule, ainsi que les mécanismes dirigeant ces ségrégations. Il a longtemps été supposé que les bactéries étaient trop petites pour avoir une organisation intra-cellulaire, et le manque de techniques appropriées ne permettait pas d'infirmer cette hypothèse. Or la taille des chromosomes comparée à celle de la bactérie impose une compaction et aujourd'hui, de nouvelles techniques de microscopie et d'analyse génétique permettent d'affirmer que les chromosomes bactériens étudiés jusqu'à maintenant ont tous une organisation et une chorégraphie de ségrégation précises et différentes selon les espèces. Toutes les espèces étudiées à ce jour ont un chromosome circulaire unique : la réplication du chromosome commence à une origine unique bidirectionnelle, les deux fourches de réplication se déplacent le long des deux bras de réplication (ou réplichores) et finissent la réplication au terminus, diamétralement à l'opposée de l'origine de réplication sur la carte du chromosome. Peu d'espèces ont été étudiées, et Vibrio cholerae émerge progressivement comme un nouveau modèle : son génome est réparti sur deux chromosomes, et la chorégraphie de plusieurs chromosomes dans une cellule n'a jamais été décrite. De plus, cette espèce semble être au croisement évolutif entre Caulobacter crescentus et Escherichia coli : Vibrio cholerae a d'une part une morphologie en croissant, des systèmes de partition aux origines et un positionnement de l'origine du chromosome I, semblables à C. crescentus, et d'autre part un système de compaction du terminus et un set de gènes impliqués dans la maintenance du chromosome ayant co-évolué, qu'on ne retrouve que dans peu d'espèces proches d'E. coli. Une autre caractéristique intéressante de V. cholerae est que le chromosome II semble avoir été acquis récemment et n'est donc peut être pas gouverné par les mêmes mécanismes que le chromosome I, comme en témoignent le positionnement de son origine et son terminus, inédits pour des chromosomes bactériens. Parmi les Vibrios (environ 60 espèces principalement retrouvées dans les environnements aquatiques), certaines espèces sont des pathogènes dévastateurs pour les poissons, le corail, les crustacés ou les fruits de mer. Mais la plus documentée est Vibrio cholerae, car elle provoque chez l'Humain une maladie provoquée par l'ingestion d'eau contaminée qui peut être mortelle si le patient n'est pas réhydraté à temps. Bien que facilement traitable, le choléra fait encore de nombreuses victimes dans les pays en développement où les structures de santé et les règles d'hygiène font parfois défaut. Ainsi l'étude de Vibrio cholerae présente un intérêt médical, mais également par extension aux autres Vibrios, un intérêt environnemental non négligeable.

Le trafic membranaire est un processus universel qui est essentiel pour la fonction neuronale dans un large spectre de fonctions. De la croissance neuronale et le développement morphologique à la libération des neurotransmetteurs et la plasticité synaptique, il prend en charge l'activité neuronale et donne d'innombrables questions qui animent la recherche sur la neurobiologie d'aujourd'hui. Notamment, l’exocytose des endosomes de recyclage (ER) dans les compartiments somatodendritiques participe à la transmission synaptique et à la potentialisation synaptique à long terme (PLT). Cependant la machine moléculaire sous-tendant l’exocytose des ER reste encore méconnue. Afin d’identifier les protéines SNAREs vésiculaires (v-SNARE) impliquées dans les différentes formes d’exocytose des ER postsynaptiques, nous avons d'abord imagé les protéines VAMP neuronales fusionnées avec la pHluorine, une GFP mutée sensible au pH dans les neurones de l’hippocampe en culture. Nous avons constaté que seulement VAMP2 et VAMP4, mais pas VAMP7, rapportaient des événements d’exocytose somatodendritique dans les neurones matures. Après avoir identifié ces deux protéines candidates, nous avons utilisé la combinaison de différentes techniques de régulation négative chronique ou aiguë pour désactiver leur fonction et observer les conséquences sur l’exocytose des ER, la transmission synaptique basale ou la PLT. Nos résultats suggèrent que VAMP2 est impliqué dans une forme d’exocytose régulée importante pour la PLT, mais pas l’exocytose constitutive des récepteurs AMPA, qui stabilise la transmission basale. VAMP4 est nécessaire pour l'exocytose constitutive d'une grande partie des endosomes, mais l'implication fonctionnelle de ces endosomes doit encore être explorée, car la régulation négative de VAMP4 ne modifie pas la transmission basale. / Membrane trafficking is a universal process that is essential for neuronal function in a wide spectrum of applications. From neuronal growth and morphological development to neurotransmitter release and synaptic plasticity, it supports neuronal activity and gives countless questions that drive today’s neurobiology research. Notably, the trafficking of recycling endosomes (REs) in somatodendritic compartments participates in synaptic transmission and plasticity, such as long-term synaptic potentiation (LTP). However, the fusion machinery mediating RE exocytosis is still unclear. To identify the vesicular SNAREs (v-SNAREs) involved in different forms of postsynaptic RE exocytosis, we first imaged neuronal VAMP proteins fused with pH-sensitive pHluorin in cultured hippocampal neurons, and found that only VAMP2 and VAMP4, but not VAMP7, underwent somatodendritic exocytosis in mature neurons. After identifying these two candidate proteins, we used a combination of different downregulation techniques to chronically or acutely deactivate their function and observe consequences on REs exocytosis, basal synaptic transmission and LTP. Our results suggest that VAMP2 is involved in activity-regulated exocytosis important for LTP, but not constitutive postsynaptic AMPARs exocytosis, supporting basal transmission. VAMP4 is required for constitutive exocytosis of at least a large proportion of REs, but the functional implication of these endosomes still need to be explored, as VAMP4 downregulation did not alter basal synaptic transmission.

Le moteur flagellaire bactérien (BFM) est un complexe moléculaire qui permet aux bactéries de nager dans un milieu liquide. La rotation du moteur est générée à l’interface entre deux éléments clés: les protéines formant le stator (MotA and MoB) et l’anneau C “switching complex” à la base du rotor. Les stators sont des modules du moteur structurellement et fonctionnellement différentiables du reste du moteur, et leurs association et dissociation dynamique autour du rotor contrôle la génération du couple. Quand une protéine fluorescente (PF) est fusionnée à MotB, le moteur est en état de marche mais une réduction générale de la mobilité de la cellule a été observée. La raison précise d’une telle réduction de mobilité n’a pas été étudiée.Le but de cette étude est de comprendre comment la fusion PF de la protéine du stator modifie la génération du couple et le sens de rotation du moteur. C’est particulièrement important car le tag FP se trouve à l’interface entre le stator et le rotor, là où le couple et le changement du sens de rotation sont produits. Trois différentes PFs (eGFP, YPet, Dendra2) ont été fusionnées à la protéine MotB. Malgré la haute similarité de leurs structures, notre analyse a montré que les trois stators fusionnés génèrent des couples différents. Les stators marqués avec YPet produisent un couple moyen similaire au WT (stators sans tag PF), alors que les stators marqués avec eGFP et Dendra2 produisent respectivement 70% et 40% du couple moyen du WT. De plus, les moteurs utilisant les stators fusionnés ont montré des capacités de changement de sens de rotation réduites. Lors d’un changement de sens de rotation, la valeur absolue de la vitesse des moteurs WT ne change pas. Cette “symétrie” de vitesse lors du changement n’apparaît pas avec les moteurs à stators fusionnés et le changement peut être accompagné d’une importante diminution (~30%) de la vitesse absolue.En observant par microcopie TIRF avec détection de molécules uniques, des stators marqués dans un moteur en état de marche, les signaux de fluorescence sont détectés à la membrane comme prévu pour ces protéines, montrant une population de stators diffusant dans celle-ci. Les clusters fluorescents étaient visibles au centre des cellules en rotation, attachés au couvre-glace par une seule flagelle, confirmant que le tag de fluorescence peut être visualisé dans des moteurs en état de marche. Dans un second projet développé dans le laboratoire Bertus Beaumont à TU Delft, en prenant le BFM en tant que système modèle d’évolution expérimentale, sa modularité et son « évolubilité » ont été explorés pour apprendre les détails au niveau moléculaire de l’évolution de ce type de machine. Les stators de E.coli ont été échangés par un set de 21 stators étrangers homologues. L’expérience a révélé que les protéines du stator peuvent être échangées entre espèces de bactéries distantes et certains stators non compatibles peuvent être modifiés positivement par un procédé d’évolution pour devenir fonctionnels. Au cours de cette évolution, les bactéries ont accumulé des mutations avantageuses dans leurs gènes MotA et MotB étrangers, tout particulièrement dans leur domaine fonctionnel. Des mutations identiques dans des stators différents ont été observées, indiquant que l’évolution peut se reproduire. L’analyse fonctionnelle au niveau d’un seul moteur a révélé que ces mutations avantageuses amélioraient la génération du couple et/ou la capacité du moteur à changer de sens. Les investigations détaillées du génotype et du phénotype du BFM modifié par évolution apportés par cette étude, pourraient donner une idée sur la façon dont des machines moléculaires comme le BFM ont évolué, et les effets fonctionnels des mutations bénéfiques qui facilitent l'intégration fonctionnelle. / The bacterial flagellar motor (BFM) is the macromolecular complex which allows bacteria to swim in liquid media. Located at the base of the flagellum, anchored in the cell membrane, this remarkably small (~45nm) yet powerful rotary motor rotates each flagellum of the cell switching between counterclockwise (CCW) and clockwise (CW) direction. The motor rotation is generated at the interface between the two key components of the motor: the stator protein complexes (each composed of 4 MotA and 2 MotB proteins) and the C- ring protein complex at the base of the rotor. The stator complexes are structurally and functionally discernible modules of the motor, and their dynamical association and dissociation around the rotor controls the generation of torque.The first project of this study aims to investigate how the FP tag on the stator protein modifies the torque generation and switching of the motor. This is particularly important because the fluorescent protein tag lies at the interface between stator and rotor, where torque and switching are produced. Three different FPs (eGFP, YPet, Dendra2) were fused to MotB. Interestingly, despite the high similarity of their structures, our analysis revealed that the three fusion stators generate different torque. Furthermore, in the presence of fusion stators, the motor showed significantly impaired switching abilities. When switching direction of the rotation, the absolute value of the speed of WT motors does not change, whereas this symmetry of speed upon switching is not observed in the fusion stator motors, and switching can be accompanied with a significant (~30%) decrease in absolute speed. Both the impaired torque generation and the switching ability were improved by introducing a rigid linker between the stator and the FP tag. Taken together, this study provides a further insight into the dynamics of the stator and rotor interaction at its interface.When the cells carrying the fluorescently labeled stators were observed in a custom made TIRF-fluorescence microscope with single molecule capability, the fluorescence signals were detected as concentrated clusters in the membrane as expected for these membrane proteins around the motors, together with a population of stators diffusing in the membrane. Fluorescent clusters were visible at the center of rotating cells tethered to the glass slide by a single flagellum, confirming that the fluorescent tags can be visualized in functioning motors.In a second project developed in Bertus Beaumont lab at TU Delft, taking BFM as an experimental evolutionary model system, its modularity and evolvability have been explored to learn the molecular details of the evolution of molecular machines. The stators of E.coli have been exchanged by a set of 21 homologue foreign stators. The experiments revealed that the stator proteins can be exchanged between distant bacteria species, and some of the non-compatible stators can be positively modified by evolution to become functional. Those evolved strains accumulated beneficial mutations in their foreign motA and motB genes, especially on their functional domains. Identical mutations in different stators were common, indicating that evolution is repeatable. The functional investigation at the single motor level revealed that those beneficial mutations improved the torque generation and/or the switching ability of the motor. The detailed genotype and phenotype investigations of the evolutionary modified BFM may bring an insight into how molecular machines such as BFM have evolved as well as the functional effects of the beneficial mutations that facilitate functional integration.

L’objectif de mon travail de thèse a été de caractériser l’adhésion de vésicules géantes lipidiques et de cellules vivantes. Dans le but d’obtenir des informations quantitatives sur l’adhésion, j’ai développé deux techniques de nanoscopie de fluorescence basées sur la microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cette technique repose sur création d’une onde évanescente à proximité d’une interface. J’ai développé pour cela un montage optique, qui permet de contrôler finement les caractéristiques de l’onde évanescente (longueur d’atténuation, état de polarisation, etc.). L’adhésion des vésicules a été étudiée par nTIRF (TIRF normalisé) : les images TIRF sont normalisées par des images en épi-fluorescence. J’ai pu ainsi caractériser l’adhésion non spécifique (interaction électrostatique) et spécifique (interaction biotine-streptavidine) de vésicules sur différentes surfaces fonctionnalisées. Pour quantifier l’adhésion des cellules, j’ai utilisé l’approche VA-TIRF (TIRF à angle variable). Cette dernière consiste à enregistrer une série d’images en régime évanescent à différents angles d’incidence. Ceci nous a permis d’établir une cartographie des distances entre la membrane ventrale d’une cellule et la surface pour différents comportements d’adhésion initiés sur divers substrats : chimiques ou protéiques. Ces deux techniques permettent de mesurer la distance membrane-surface avec une précision nanométrique, ≈20nm, ce qui est particulièrement adapté à l’étude du processus d’adhésion / The aim of my thesis was to characterize the adhesion of Giant Unilamellar Vesicles and living cells. In order to obtain a quantitative information about the state of the adhesion, I developed two fluorescence nanoscopy techniques based on microscopy TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). This technique consist of creating an evanescent wave in the vicinity of an interface. I developed the experimental setup, which allows an accurate control of characteristics of the evanescent wave (penetration depth, polarization state, etc.). The vesicles adhesion was studied by nTIRF (normalized TIRF). TIRF images are normalized by epi-fluorescence images. I was able to characterize the nonspecific adhesion (electrostatic interaction) and specific adhesion (biotin-streptavidin interaction) of vesicles on different functionalized surfaces. To quantify the adhesion of cells, I used the VA-TIRF approach (variable angle TIRF). The latter is to record a series of images at different angles of incidence in the evanescent regime. This allowed us to map the distances between the ventral membrane of a cell and the surface for different adhesion behaviors initiated on various substrates: chemical or protein. These two techniques permit to measure the membrane surface-distance with the nanometer precision ≈20nm, which is particularly suitable for the study of the adhesion process

H. pylori est une bactérie à Gram négatif qui infecte l'estomac de près de 50% de la population mondiale. L'infection, en général asymptomatique, peut évoluer vers l'ulcère gastrique (15% des cas) ou le cancer de l'estomac (1% des cas). L'infection à H. pylori est traitée par antibiothérapie mais ces dernières années ont vu une augmentation du nombre de souches résistantes. Cette augmentation et la forte prévalence d'H. pylori sont probablement dues à son importante variabilité génétique qui a pour origine un fort taux de mutagénèse spontanée, associée à une recombinaison efficace et un important transfert horizontal de gènes. H. pylori est en effet naturellement compétente pour la transformation qui est le processus biologique permettant la capture, l'internalisation et l'intégration d'ADN exogène dans le génome de la bactérie. Ce processus favorise la diversité génétique au sein d'une population et peut permettre son adaptation rapide aux changements environnementaux. Durant ma thèse, j'ai participé au développement d'une méthode permettant de visualiser la transformation d'ADN fluorescent dans des cellules de H. pylori vivante. Cette méthode nous a permis, pour la première fois, de visualiser directement l'entrée d'un ADN transformant dans le cytoplasme d'une bactérie compétente. Elle nous a également permis de confirmer le rôle de la protéine ComEC dans l'internalisation de l'ADN dans le cytoplasme. Le travail que j'ai réalisé a également permis de mettre en évidence que le niveau de transformation de H. pylori est déterminé par le niveau d'expression du complexe membranaire d'internalisation. La quantité d'ADN capturée serait alors un facteur limitant pour la transformation. / H. pylori is a Gram negative flagellar bacterium that colonizes nearly 50% of the world population. Infection is generally asymptotic but can evolve to ulcerous gastritis (15% of the cases) or stomach cancer (1% of the cases). H. pylori infection is usually treated with antibiotic but the last years saw a dramatic increase in the number of resistant strains. This increase, and the high prevalence of H. pylori, are probably caused by its huge genetic variability likely due to a strong mutagenesis rate associated with efficient recombination and horizontal gene transfer. H. pylori is indeed naturally competent for transformation which is the biological process allowing capture, internalization and integration of exogenous DNA in the genome of a bacterium. This process promotes genetic diversity in a population and could permit rapid adaptation to environmental changes. During my thesis, I participated to the development of a method to visualize transformation in H. pylori living cells. Using fluorescently labelled DNA, this method allowed us for the first time to follow directly the entry of a transforming DNA into the cytoplasm of competent bacteria. It also allowed us to confirm the role of the ComEC protein in the internalization of the DNA in the cytoplasm. The work I performed also allowed to show that the level of expression of the uptake complex determines the transformation efficiency of H. pylori. The amount of captured DNA would then be a limiting factor for the transformation in this bacterium. Finally, I initiated the biochemical and genetic characterization of the NucT protein, a nuclease associated to the membrane and implicated in the transformation.

Haloferax volcanii est une archée appartenant au phylum euryarchaeota et à la classe des Halobacteriales. Les mécanismes liés à la réplication et à la réparation chez les archées sont très similaires à ceux rencontrés chez les eucaryotes, faisant d’H. volcanii un des organismes modèle pour l’étude de la réplication et de la biologie des archées, notamment car de nombreux outils génétiques sont disponibles chez cet organisme. De plus, H. volcanii possède la particularité de pouvoir avoir toutes ses origines de réplication supprimées, soulevant beaucoup de questions sur les mécanismes impliqués. Plusieurs hypothèses ont été émises sur la façon dont cette souche initie sa réplication, basées soit sur la dérivation des mécanismes liés à la réparation de l’ADN, soit sur un mécanisme d’initiation de la réplication indépendant des origines. Afin d’étudier ces mécanismes liés à la réplication, j’ai construit une souche d’H. volcanii capable d’incorporer des analogues de la thymidine dans l’ADN lors de sa synthèse grâce à la délétion de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la thymidine. Des temps de cultures courts de la souche en présence d’un analogue permet son incorporation au niveau des zones actives de réplication pour marquer spécifiquement l’ADN néosynthétisé. L’immunodétection de l’analogue incorporé à l’ADN, en travaillant en cellule entière avec un microscope à fluorescence, permet la localisation de l’ADN néosynthétisé, reflétant ainsi les régions où la réplication est active. Ces analyses révèlent majoritairement 2 à 3 régions de réplication actives dans des cellules en prolifération, sans localisation particulière. Ces régions ont déjà été observées en étudiant la localisation d’une protéine clé de la réplication (RPA2) fusionnée à la protéine verte fluorescente GFP, confirmant sa localisation aux zones actives de réplication. Une étonnante variabilité observée d’une cellule à l’autre et suggère une initiation probabiliste de la réplication. Il est également étonnant de n’observer qu’aussi peu de zones actives de réplication, comparé au fort taux de polyploïdie de cette souche. Se pose alors la question de ce à quoi correspondent ces zones de réplication. Pour cela, j’ai développé chez H. volcanii la technique de peignage moléculaire permettant d’isoler des molécules individuelles d’ADN et révéler spécifiquement les analogues incorporés pour pouvoir déterminer le nombre de copies du chromosome qui sont actives lors de la réplication, ainsi que le nombre d’origines actives sur chacune des copies. J’ai également développé une technique de Time-lapse dans le but de suivre ces régions au cours du temps en observant les divisions cellulaires directement sous le microscope. / Haloferax volcanii is an archaea belonging to the phylum euryarchaeota and the class Halobacteriales. The mechanisms related to replication and repair in archaea are very similar to those found in eukaryotes, making H. volcanii a relevant model organisms for the study of replication and archaeal biology, especially since many genetic tools are available. Interestingly, all replication origins can be removed from the chromosome of H. volcanii, raising many questions about the mechanisms involved. Several hypotheses have been proposed on how this strain initiates its replication, either relying on recombination-dependent replication initiation or an origin-independent mechanism. In order to study these replication-related mechanisms, I have constructed a strain of H. volcanii able to incorporate thymidine analogues into DNA during its synthesis by deleting genes involved in the thymidine biosynthesis pathway. A short-time cultures of the strain in the presence of an analogue allows its incorporation in nascent DNA. By immunodetection of the analog coupled to fluorescence microscopy observation of whole cells, it is possible to investigate the localization of neosynthesized DNA,which reflect the regions where replication is active. These analyses revealed mainly 2 to 3 active replication regions per cell, without any particular location. These regions had already been observed by studying the localization of a key replication protein (RPA2) fused to the fluorescent green protein GFP, confirming its location in active replication areas. A surprising variability in the number of replication foci from one cell to another was observed, suggesting a probabilistic initiation of replication. It is also surprising to observe so few active replication areas compared to the high polyploidy of this strain. This raises the question of what these replication areas correspond to. For further understanding, I developed for H. volcanii molecular combing, to isolate individual DNA molecules and specifically reveal incorporated analogues to determine the number of copies of the chromosome that are being replicated, as well as the number of active origins on each of the copies. I have also developed time-lapse approach to track these regions over time by monitoring cell proliferation directly under the microscope.

Les suspensions concentrées et les verres colloïdaux forment une classe de matériaux intéressante d'un point de vue de la physique mais également des applications. Ces matériaux présentent des comportements rhéologiques remarquables comme la présence d'un seuil d'écoulement, des phénomènes de glissement ou encore des dynamiques de relaxation très lentes et du vieillissement. Les techniques rhéologiques classiques ne permettant pas à elles seules de remonter à l'origine microscopique de ces phénomènes, il est nécessaire de les associer à des techniques permettant de sonder la structure et la dynamique à des échelles très locales. Dans ce travail nous développons et mettons en œuvre une série d'outils complémentaires utilisant la diffusion multiple de la lumière ou la microscopie par fluorescence et nous les appliquons à l'étude de la dynamique de suspensions concentrées de microgels polyélectrolytes au voisinage de l'équilibre, en cours de vieillissement ou en écoulement. Les principaux résultats portent sur la mesure des propriétés viscoélastiques linéaires dans une fenêtre de fréquences comprises entre des temps browniens et plusieurs heures, sur le vieillissement physique, et sur le rôle des parois dans la structuration des écoulements.