Les champignons sont les principaux agents pathogènes des plantes. Leur étude est donc essentielle pour contrôler les maladies et maintenir un bon rendement de production agricole. La nutrition de ces pathogènes est basée sur l'absorption de nutriments, préalablement dégradés par un arsenal d'enzymes lytiques secrétées. La sécrétion des protéines est assurée par le trafic intracellulaire mettant en jeu de nombreuses vésicules. Chez les champignons filamenteux, ces vésicules ont été visualisées en microscopie électronique mais le processus mis en jeu pour leur biogénèse n'est toujours pas élucidé. L'identification de ce mécanisme est un donc un prérequis pour comprendre la sécrétion de facteurs de virulence. Dans ce but, un mutant non pathogène altéré au niveau de l'expression du gène codant la chaine lourde de la clathrine a été sélectionné parmi une banque de mutants générés chez le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea. Le gène codant pour la chaine lourde de la clathrine est essentiel chez de nombreux organismes, ainsi un mutant dominant négatif de la chaine lourde de la clathrine a été généré et confirme la perte de pathogénicité. La caractérisation du mutant par une approche de protéomique a mis en évidence un défaut de sécrétion de 82 protéines incluant des facteurs de virulence connus. Un défaut de production de vésicules intracellulaires a également été constaté. Par ailleurs, le marquage de la clathrine à la GFP a permis de préciser sa localisation dans les cellules fongiques. Enfin, de façon surprenante, aucun défaut d'endocytose n'a été constaté au sein des mutants déficients en clathrine. Cette étude met en évidence pour la première fois le rôle essentiel de la clathrine dans le processus infectieux d'un champignon pathogène ainsi que son rôle dans a sécrétion de facteurs de virulence / Fungi are the most important plant pathogens on agricultural and horticultural crops. Study of fungal pathogens remains essential to understand pathogenic process and control plant diseases. These organisms secrete high amount of degrading enzymes involved in plant decomposition and they feed by absorption of degraded nutriments. Secretory proteins were described to be transported form Endoplasmic Reticulum and Golgi apparatus to extracellular space through intracellular vesicles. In filamentous fungi, intracellular vesicles were observed using electron microscopy but their biogenesis process is still unknown. Therefore, elucidation of the process and the identification of proteins involved in secretory vesicles biogenesis remains a challenge to understand virulence factors delivery. A nonpathogenic mutant altered in the expression of the gene coding for clathrin heavy chain was selected in a random mutant library generated in the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea,. This gene is essential in many organisms, thus a clathrin dominant negative mutant was generated and confirming the nonpathogenic phenotype observed on several host plant. In eukaryotic cells, clathrin heavy chain is mainly described to be involved in endocytosis, but it is also essential for high density secretory vesicles formation in yeast. Characterization of the mutants using a proteomic approach revealed a secretion defect of 82 proteins including known virulence factors, as Plant Cell Wall Degrading Enzymes and elicitors. Furthermore, the clathrin mutant revealed a strong reduction of intracellular vesicles production. Clathrin was also localized in living cells using fluorescent GFP-tag protein. Endocytosis was also studied and surprisingly, any observable defect was observed for clathrin mutants. This study demonstrated for the first time the essential role of clathrin in the infectious process of a fungal pathogen and its role in virulence factors secretion

Xanthomonas fuscans subsp. fuscans (Xff) est l'un des agents responsables de la graisse commune de haricot, bactériose transmise par les semences. A partir d'une semence contaminée, cet agent pathogène colonise les parties aériennes de son hôte sur la totalité d'un cycle cultural sans enclencher de processus infectieux ; cela aboutit finalement à sa transmission à la graine. Les objectifs de cette thèse ont été d'identifier des déterminants moléculaires de Xff et de caractériser leur rôle dans trois étapes clés de la colonisation asymptomatique du haricot. Deux types de gènes candidats ont été identifiés chez Xff : des gènes induits in planta codant le système de sécrétion de type trois (SST3) et ses effecteurs, des gènes impliqués dans les processus d'adhésion aux surfaces et de formation des biofilms.Contrairement à la phyllosphère, la graine de haricot en germination et les jeunes plantules ne constituent pas des environnements limitant pour la multiplication bactérienne. L'absence d'induction de réactions de défense à cette étape laisse penser que les bactéries se comportent en saprophytes sans dialogue moléculaire avec la plante. La survie de Xff dans la phyllosphère du haricot dépend partiellement des régulateurs HrpG et HrpX du SST3 ; la colonisation active et la transmission aux graines par la voie vasculaire nécessitent quant à elle un SST3 fonctionnel. En situation incompatible non-hôte, X. campestris pv. campestris et ses mutants du SST3 survivent et se transmettent à la graine de haricot, mais peu fréquemment et avec de faibles tailles de populations. Les six adhésines identifiées chez Xff interviennent toutes lors de la colonisation de la phyllosphère ou pour la transmission à la graine de haricot par la voie vasculaire. La transmission à la graine par la voie florale est une voie plus générale, régulée seulement partiellement par HrpG et HrpX.

Pseudomonas aeruginosa est un bacille opportuniste responsable d'infections graves. Sa pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SSTT). Ce système est activé par le contact de la bactérie avec une cellule ou une déplétion calcique et permet l'injection de toxines directement dans le cytosol de la cellule. Différents phénotypes sont observés lors d'une infection pulmonaire dans le cas de la mucoviscidose : un phénotype inductible par le contact cellulaire ou la déplétion calcique et un autre non inductible.<br />En l'absence de mutations, cette dualité de phénotype peut être envisagée sous un aspect épigénétique.<br />A l'aide d'un outil informatique, nous avons déterminé les dynamiques possibles d'un modèle du SSTT supportant l'hypothèse de bistabilité et mis en évidence l'existence possible d'épigénèse. Grâce à cette méthode nous avons également définit les expériences permettant de tester cette hypothèse. Nous avons démontré qu'une modification épigénétique pouvait être à l'origine d'une acquisition stable de l'inductibilité du SSTT in vitro. Ce changement héréditaire de phénotype a été confirmé, in vivo, à l'aide d'un modèle d'infection pulmonaire aiguë.<br />Dans un second temps, nous avons mis en évidence une répression du SSTT à densité cellulaire élevée. Celle-ci est induite par un signal produit et sécrété par la bactérie. L'utilisation de mutants a permis de montrer que les signaux connus du quorum sensing ne sont pas impliqués dans cette répression. Ainsi, l'expression du SSTT dépend de la densité bactérienne et la répression à densité cellulaire élevée est induite par un mécanisme de type quorum sensing non connu.

Cette thèse est composée de deux parties : Le première partie rend compte de l'étude structurale de la protéine RrgA. RrgA est associée au pilus du pathogène Streptococcus pneumoniae et participe aux premières étapes de colonisation chez l'hôte en se liant à plusieurs composés de la Matrice Extra Cellulaire. Nous avons résolu la structure de cette protéine à 1.9 Å par cristallographie aux rayons-X. RrgA possède une structure allongée formée de quatre domaines alignés d'origine eucaryote et procaryote. En effet, trois domaines ayant des similarités structurales avec les IgG et le domaine Cna-B semblent servir de piédestal pour orienter et présenter le domaine fonctionnel de type Intégrine. Nous avons confirmé la formation de deux ponts isopeptidiques stabilisateurs par spectrométrie de masse. De plus, le domaine intégrine possède deux insertions particulières dont la présence pourrait être impliquée dans la reconnaissance des divers substrats par RrgA. La deuxième partie de cette thèse est axée sur l'étude structurale du complexe ATPase et de ExsB, la pilotine présumée du système de sécrétion de type III chez Pseudomonas aeruginosa, bactérie opportuniste et jouant un rôle majeur dans l'infection des patients atteints de mucoviscidose. Pour la première fois, nous avons mis au point un protocole d'expression et de purification sous forme soluble de l'ATPase PscN en complexe avec une protéine partenaire, PscL. Des cristaux de ce complexe ont été obtenus au robot du PSB. Par ailleurs, nous avons confirmé l'expression de la lipoprotéine ExsB chez P. aeruginosa que nous avons localisée au sein de la membrane externe. De plus, nous avons résolu la structure de cette protéine qui présente un nouveau repliement et qui établie les bases structurales pour l'étude des pilotines pour tous les systèmes de sécrétion de type III de la famille Ysc.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d'infections graves chez les personnes immunodéprimées, les grands brûlés et les patients atteints de la mucoviscidose. Cette pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SSTT).Nous avons observé une protéine précédemment identifiée, PsrA, nécessaire pour la pleine activation de l'expression du SSTT chez P. aeruginosa. Les analyses par retard de migration électrophorétique de fragments du promoteur de l'operon régulateur exsCEBA ont montré que la protéine recombinante PsrA pourrait se fixer sur celui-ci. Le mutant DpsrA a montré une diminution marquée de la sécrétion des effecteurs de type III et une faible résistance à la bactéricidie par des cellules de type phagocytaires, PLB-985. L'ensemble des résultats suggèrent que PsrA est un nouvel activateur qui est impliqué dans l'expression du SSTT en augmentant le niveau de la transcription d'exsCEBA.Dans un second temps, nous avons mis en évidence qu'un signal inhibiteur, de type quorum sensing inconnu et produit dans la phase stationnaire de la culture, peut réprimer l'expression du SSTT in vitro. L'analyse de milliers de mutants de transposition a montré que la production de ce signal dépend du tryptophane, qui est le précurseur de nombreux métabolites dont l'acide d'indole-3-acétic (IAA). IAA-Na et un autre membre de cette famille de molécules, le acide 1-naphthalenacétique (NAA-K) aux concentrations millimolaires peuvent en effet inhiber l'expression et la sécrétion du SSTT. L'identification précise de ce signal nécessite des investigations plus poussées.

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pour sécréter divers facteurs de virulence depuis le périplasme vers le milieu extra-cellulaire. La bactérie phytopathogène Dickeya dadanti (ex. Erwinia chrysanthemi) utilise ce système, appelé Out, pour la sécrétion de pectinases responsable de la maladie de la pourriture molle chez de nombreuses plantes. Les deux composants essentiels du système Out, la protéine de membrane interne OutC et la sécrétine OutD, formant un pore dans la membrane externe, sont impliqués dans la spécificité de sécrétion. L'interaction entre OutC et OutD pourrait assurer l'intégrité structurelle et fonctionnelle du système de sécrétion en reliant les deux membranes. Nous avons entrepris une étude structure-fonction de ces deux composants afin d'identifier et caractériser leurs sites d'interaction et de mieux comprendre leurs rôles. Nous avons appliqué une approche intégrative impliquant une analyse in vivo par cystéine-scanning et pontage disulfure, une analyse in vitro par GST pull down et une analyse structurale d'OutC et OutD et de leurs interactions par RMN. Nos résultats indiquent la présence d'au moins trois sites d'interaction entre les régions périplasmiques d'OutC et d'OutD et suggèrent que ces interactions s'établissent par un mécanisme d'addition des brins β. Nous avons démontré qu'un site situé sur le domaine HR d'OutC pouvait interagir avec deux sites distincts d'OutD suggérant un mode d'interaction alternatif. La présence d'exoprotéines et/ou des composants de membrane interne du système OutE-L-M, modifie différemment l'affinité de ces trois sites d'interaction entre OutC et OutD. Nous proposons que ces interactions alternatives entre divers sites d'OutC et OutD pourraient refléter une succession d'étapes fonctionnelles lors du processus de sécrétion. Pour étudier le mécanisme d'adressage et d'assemblage de la sécrétine OutD dans la membrane externe, nous avons exploité les interactions entre OutD et deux composants auxiliaires du T2SS, la protéine de la membrane interne OutB et la lipoprotéine de la membrane externe OutS. Nous avons montré une interaction directe entre le domaine périplasmique d'OutB et le domaine N0 d'OutD. Une analyse structure-fonction du complexe OutS-OutD a révélé que la pilotine OutS interagit fortement avec 18 résidus à l'extrémité C-terminale de la sécrétine, entraînant la structuration sous forme hélicoïdale de cette région initialement non structurée. Ce travail nous permet de mieux comprendre le mécanisme d'assemblage et de fonctionnement du système de sécrétion de type II.

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif. Il permet la sécrétion d'enzymes lytiques et de toxines. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, les pectinases, sécrétées par ce système appelé Out, dégradent la pectine, provoquant les symptômes de pourriture molle. La sécrétion par le T2SS se passe en 2 étapes : les protéines traversent la membrane interne par le système Sec ou le système Tat. Une fois dans le périplasme, elles sont repliées et transloquées par le T2SS à travers la membrane externe. Le système Out est composé de 14 protéines intégrées ou associées à l'une des deux membranes. Son assemblage et son fonctionnement restent obscurs. Une plateforme serait formée dans la membrane interne par OutE, -F, -L, -M et -C. Ces trois derniers composants sont des protéines bitopiques dont la stœchiométrie et le rôle sont inconnus. Pour identifier des interactions entre ses composants, nous avons utilisé le double-hybride bactérien, basé sur la reconstitution de l'activité d'adénylate cyclase. Nous avons démontré que le domaine de type ferrédoxine, situé en C-terminus d'OutL et d'OutM, est directement impliqué dans l'homo- et l'hétérodimérisation de ces protéines. Une interaction entre les régions périplasmiques d'OutC et d'OutD a été aussi détectée (Login et al., 2010). Pour mieux analyser les multiples interactions au sein du T2SS, des expériences de triple-hybride ont été réalisées en co-exprimant différentes combinaisons des régions solubles de trois composants. Nos résultats suggèrent qu'OutL empêche l'interaction entre OutC et OutD. Par ailleurs, OutL est impliquée dans l'activation de l'ATPase OutE, le moteur du système (Camberg et al., 2007). OutL serait donc impliquée dans la transmission du signal entre le périplasme et le cytoplasme et pourrait intervenir dans la dissociation du complexe OutD/OutC. Afin d'analyser le rôle des segments transmembranaires (TMS) de composants du T2SS, nous avons adapté la technique du double-hybride. Le domaine de la protéine rapporteur Cya a été fusionné au N-terminus du TMS et BlaM au C-terminus. BlaM sert à contrôler la topologie correcte des fusions dans la membrane. Plusieurs interactions bi-partenaires entre les TMS d'OutC, OutL et OutM ont été ainsi détectées. Ce travail a été complété par une étude in vitro (pull-down) et par mutagenèse dirigée. Ces interactions TMS-TMS pourraient intervenir dans la transmission du signal du périplasme vers le cytoplasme à travers la membrane interne.

Tau est une protéine associée aux microtubules enrichie dans l’axone. Dans la maladie d’Alzheimer, Tau devient anormalement hyperphosphorylée, s’accumule dans le compartiment somato-dendritique et s’agrège pour former des enchevêtrements neurofibrillaires (NFTs). Ces NFTs se propagent dans le cerveau dans un ordre bien précis. Ils apparaissent d’abord dans le cortex transenthorinal pour ensuite se propager là où ces neurones projettent, c’est-à-dire au cortex entorhinal. Les NFTs s’étendent ensuite à l’hippocampe puis à différentes régions du cortex et néocortex. De plus, des études récentes ont démontré que la protéine Tau peut être sécrétée par des lignées neuronales et que lorsqu’on injecte des agrégats de Tau dans un cerveau de souris, ceux-ci peuvent pénétrer dans les neurones et induire la pathologie de Tau dans le cerveau. Ces observations ont mené à l’hypothèse que la protéine Tau pathologique pourrait être sécrétée par les neurones, pour ensuite être endocytée par les cellules avoisinantes et ainsi propager la maladie. L’objectif de la présente étude était donc de prouver la sécrétion de la protéine Tau par les neurones et d’identifier par quelle voie elle est secrétée. Nos résultats ont permis de démontrer que la protéine Tau est sécrétée par des neurones corticaux de souris de type sauvage ainsi que dans un modèle de surexpression dans des cellules HeLa et PC12. Nos résultats indiquent que la sécrétion de Tau se ferait par les autophagosomes. Finalement, nous avons démontré que la protéine Tau sécrétée est déphosphorylée et clivée par rapport à la protéine Tau intracellulaire non sécrétée. / Tau, a microtubule-associated protein, is enriched in the axon. In Alzheimer’s disease, Tau becomes hyperphosphorylated, redistributes to the somato-dendritic compartment and forms aggregates called neurofibrillary tangles (NFTs). The NFTs propagates in a predictable manner in particular neuronal networks. Indeed, they appear in the trans-entorhinal region and then propagate to the entorhinal cortex where the trans-entorhinal cortex projects. Then, the NFTs propagate to the hippocampus and to different regions of the cortex and neocortex. Recent studies have reported that Tau can be secreted by neuronal cell lines. Besides, when aggregates of Tau protein were injected in mouse brain, they could enter neurons and induced Tau pathology. Based on those observations, it was speculated that Tau could be secreted by neurons and then captured by neighbouring cells to propagate Tau pathology in the brain. The goal of the present study was to prove that Tau can be secreted by neurons and to find the secretory pathway involved in Tau secretion. Moreover, the phosphorylation state of Tau protein was examined and compared to intracellular non-secreted Tau. Our results showed that Tau is secreted by cortical neurons isolated from wild-type mice and by HeLa and PC12 cells overexpressing human Tau. Our results also indicated that autophagosomes would be involved in Tau secretion. Finally, we found that secreted Tau was dephosphorylated and cleaved compared to the non-secreted intracellular Tau.

Le diabète mellitus de type I est une maladie de plus en plus abondante. Cette dernière est caractérisée par la destruction auto-immunitaire des îlots de Langerhans incluant les cellules de type [bêta] qui produisent de l'insuline dans le pancréas endocrinien. Une option de traitement pour les patients atteints de cette maladie est notamment une greffe des îlots de Langerhans. Ce traitement est limité dû au nombre restreint de donneurs d'organes et aussi à la perte de fonctionnalité des îlots suite à la greffe. Les études effectuées tout au long de cette thèse ont pour optique d'adresser ces contraintes par le biais de la science des biomatériaux. La thèse débute avec un survol détaillé des concepts de base et des complexités associés aux interactions de type cellules et surfaces trouvées dans la littérature. II s'agit spécifiquement des interactions physiques et chimiques, des systèmes expérimentaux ainsi que des caractérisations et modifications associés aux interactions entre cellules et surfaces. La première étude de nature expérimentale examine la morphogenèse des cellules progénitrices ductales (PANC-1 cell line) vers des îlots qui produisent des agrégats semblables à des îlots (ILA). Le tout est fait sur des surfaces de carboxyméthyl dextrane (CMD) sur lesquelles le RGD est greffé via un lien covalent. L'expression des marqueurs d'lLAs (cytokeratin-19, Ki67, et E-cadherin) qui peuvent être associés à un changement de phénotype de ces cellules a été évaluée ainsi que la sécrétion et l'expression de l'insuline. La seconde étude de nature expérimentale a pour optique l'immobilisation de la fibronectine (FN) sur les mêmes surfaces de CMD mentionnées auparavant sur lesquelles des cellules ayant un phénotype [bêta] (INS-1 cell line) ont proliféré. Lors du processus d'immobilisation, plusieurs solutions ont été étudiées. L'immobilisation de la fibronectine sur des surfaces de CMD a été validée par la spectrométrie de photoélectrons induits par rayons X. Le mécanisme d'immobilisation a été déterminé par imagerie et mesures de force par microscopie à force atomique, la spectroscopie de dichroïsme circulaire ainsi que par la diffusion dynamique de la lumière. De plus, la croissance des cellules de type INS-1 et la sécrétion d'insuline ont été évaluées. La dernière étude de nature expérimentale visait l'étude de la coculture des cellules endothéliales et des îlots de porc dans un gel de fibrine. L'effet de la présence des cellules endothéliales sur la production d'insuline des îlots a été évalué. De plus, l'apoptose cellulaire en coculture a été évaluée et comparée aux cultures simples.

No description available.