Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

La protéine FADD (Fas associated death domain) est l’adaptateur clé de la voie de signalisation apoptotique dépendante des récepteurs de mort de la famille du TNF (tumor necrosis factor). Au cours des dix dernières années, il est apparu évident qu’au-delà de son rôle majeur dans la mort cellulaire, FADD est impliqué dans d’autres processus biologiques comme le développement embryonnaire, la réponse immunitaire innée ou encore la progression du cycle cellulaire. De même, il est devenu clair que la localisation subcellulaire de FADD est déterminante pour sa fonction. Identifier les voies de régulation de l’expression de la protéine est donc d’une importance capitale. En 2008, notre équipe a mis en évidence, dans un modèle murin de la thyroϊde, un nouveau mécanisme de régulation de l’expression de la protéine via la sécrétion. En parallèle, le laboratoire a rapporté que la présence de FADD dans le sérum de patients cancéreux était corrélée à l’agressivité des tumeurs et l’inflammation. (Tourneur et al, 2012). L’objectif de ce travail de thèse était de comprendre le mécanisme par lequel FADD était sécrété, et de déterminer, le cas échéant, les modalités de sa régulation. Un troisième objectif est apparu au cours de la thèse : identifier de nouveaux modes de régulation de l’expression de FADD. Au moyen d’une lignée modèle humaine, nous avons montré que l’expression de la protéine humaine pouvait être régulée via une voie non-conventionnelle de sécrétion, tout comme dans le modèle murin. En parallèle de la caractérisation de cette sécrétion, nous avons montré que celle-ci pouvait être régulée par la kinase anti-apoptotique CK2 (casein kinase 2). Enfin, nous montrons que la CK2 régule la localisation nucléaire de FADD via une phosphorylation dépendante de la sous-unité régulatrice de la kinase et que la CK2 pourrait interagir directement avec FADD. Ces résultats constituent la première démonstration de la régulation de FADD par sécrétion par des cellules humaines et les premiers à rapporter un nouveau mode de régulation de la localisation subcellulaire de FADD par la CK2. Les conséquences de ces résultats en regard des fonctions connus de FADD sont discutées / The FADD protein (Fas associated death domain) is the key adaptor molecule of the apoptotic signaling pathway triggered by death receptors of the TNF (Tumor necrosis factor) superfamily. During the last decade, it became obvious that, in addition to its major role in cell death, the protein was also involved in other biological processes like the embryonic development, the immune response or even cell cycle progression. Evidence also showed that the protein sub-cellular localization was a key determinant to its functions. Therefore, the identification of underlying regulatory mechanisms dictating FADD expression was of significant importance. In 2008 our laboratory identified, in a thyroid murine model, a new mechanism controlling FADD expression, namely via secretion. We discovered that the loss of FADD expression from tumor cells, by secretion, could be correlated to cancer aggressiveness as well as inflammation (Tourneur 2012). The goal of this thesis work was to apprehend the mechanism by which FADD was secreted and determine, in that case, the modalities of this regulation. A third objective of this work was to identify new potential regulatory pathways of FADD expression. By means of a human cell line model, we showed that, similarly to the mouse model, the expression of human FADD could be regulated via unconventional secretion. In parallel to the characterization of the secretory process itself, we demonstrated that secretion could be negatively regulated by the anti-apoptotic kinase CK2 (casein kinase 2). Finally, we showed that CK2 could regulate FADD nuclear localization via a regulatory sub-unit-dependent phosphorylation and that FADD and CK2 could directly interact. These results are the first to demonstrate that human FADD expression could be regulated via secretion and that FADD sub-cellular localization could be modulated by CK2. The consequences of such regulation with regards to known FADD functions are discussed

La mise au point en 2005 d’un modèle de propagation sur lignée d’hépatocarcinome basé sur la souche hautement réplicative JFH-1 fut une formidable opportunité d’étudier les différentes étapes du cycle infectieux du VHC. Nous avons souhaité étudier les étapes de morphogenèse et de sécrétion du virus, des phases du cycle viral qui sont largement mal connues encore aujourd’hui, mais ou la protéine de capside joue probablement un rôle majeur. Des études comparatives des séquences de capsides de différentes souches du VHC nous ont permis de mettre en évidence 10 résidus spécifiques à la souche JFH-1 qui pourraient expliquer les déficits fonctionnels connus de cette protéine. En effet, le remplacement de ces 10 résidus par ceux plus communément retrouvés dans les souches de génotype 1 et 2 a permis une amélioration significative de l’assemblage et de la sécrétion des particules infectieuses produites. La mise au point de cette souche optimisée pour la production de virus pourrait par ailleurs permettre constituer un atout pour mieux comprendre la structure du virus par des techniques de microscopie électronique ; ce type d’étude n’ayant pas pu être véritablement menée jusqu’à présent, en raison des titres infectieux insuffisants obtenus avec la souche JFH-1 sauvage. / Development and cloning in 2005 of the highly replicative strain JFH-1 was a great opportunity to study the different stages of the infectious cycle of HCV as this strain easily propagate in the hepatocellular carcinoma cell line. Until now, these lates phases of particles assembly remain poorly understood, although the core protein is thought to probably play a major role in initiation of these mechanisms. Comparative studies of the capsid sequences of different strains of hepatitis C have allowed us to identify 10 specific residues in the JFH-1 strain that could explain the functional deficits of this protein. Indeed, the replacement in JFH-1 strain of these 10 residues by those most commonly found in strains of genotype 1 and 2 showed improvement of the assembly and secretion of new infectious particles and new subcellular localization of core. In addition, replacement of these ten residues by most common amino acid found in patients show a great enhancement of in vitro virus production and secretion. As a perspective, development of this optimized virus could also represent a valuable model to better purify and determine viral structure, and true viral assembly site; HCV fields that remain till now largely unknown.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Chez les cellules eucaryotes, la biosynthèse des protéines est essentielle à la vie. Pour accomplir leurs fonctions biologiques, les protéines doivent être acheminées au bon endroit dans la cellule, notamment par la voie de sécrétion. Cette voie de transport est organisée en diverses structures membranaires distinctes. La porte d'entrée des protéines sécrétées et des protéines membranaires dans la voie de sécrétion est le réticulum endoplasmique. À cet endroit, les protéines sont repliées correctement, glycosylées et forment des ponts disulfures. Par la suite, la plupart d'entre elles sont acheminées à l'appareil de Golgi par des vésicules de transport. Dans ce compartiment intracellulaire, les groupements glycosyls des glycoprotéines sont alors modifiés. Finalement, certaines protéines sont transportées à la vacuole ou à la membrane plasmique par une autre série de vésicules de transport. Chez Saccharomyces cerevisiae, la voie de sécrétion des protéines est très semblable à celle des cellules de mammifères dans sa capacité de replier les protéines, de les glycosyler et de les sécréter. Ces propriétés dépendent du bon fonctionnement de la voie de sécrétion. Nos travaux ont consisté à étudier le transport de l'invertase vers l'espace périplasmique chez Saccharomyces cerevisiae W303-lb. Des études antérieures ont démontré que W303-lb manifeste à 37 °C un ralentissement de la sécrétion de l'invertase dans l'espace périplasmique comparativement à SEY6210. Notre hypothèse de travail vise sur l'identification, par complémentation génétique, d'un gène défectueux responsable du phénotype observé chez W303-1 b. De plus, ce défaut de sécrétion est corrigé par la délétion du gène SLA 1 chez W303-1 b. Sial p est une protéine liant l'actine qui semble importante dans le transport de certaines protéines entre le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi. Nous avons montré qu'un fragment d'ADN génomique du chromosome IX restaure la sécrétion de l'invertase chez W303-1 b. Ce fragment contient trois gènes (ECM37, YILJ 45C et TID3) où seul le gène YILJ 45C possède un cadre de lecture ouverte (ORF) entier. Finalement, plusieurs hypothèses ont été émises sur les effets possibles de ces gènes sur la sécrétion de l'invertase, ce qui permettra éventuellement d'élaborer de nouvelles hypothèses concernant l'organisation du système de sécrétion chez Saccharomyces cerevisiae et les liens moléculaires qui peuvent exister entre le cytosquelette et la machinerie protéique régulant le transport des protéines.

Les rouilles des feuilles du peuplier appartenant au genre Melampsora sont considérées comme la maladie la plus importante du peuplier au niveau mondial. Lors de l’infection, les espèces appartenant au genre Melampsora sécrètent une panoplie de protéines effectrices afin de reprogrammer leur hôte dans un état de susceptibilité. Par contre, la reconnaissance par le système immunitaire végétal de certaines protéines effectrices, dites protéines d’avirulence, induit la réponse d’hypersensibilité, une forme de mort cellulaire programmée. Selon les modèles courants de coévolution entre un agent pathogène et son hôte, certains de ces effecteurs, en particulier ceux arborant une fonction d’avirulence, devraient présenter des signatures moléculaires témoignant d’une évolution accélérée. Dans cette thèse, les caractéristiques décrites ci-dessus ont été utilisées afin d’identifier des protéines impliquées au niveau de la pathogénicité des rouilles des feuilles du peuplier, visant comme objectif spécifique l’identification d’effecteurs potentiels. La première partie de cette thèse rapporte le développement d’une approche à multiple facettes afin de tirer profit des banques d’EST déjà disponibles, qui inclut la prédiction de protéines sécrétées à l’aide d’outils informatiques, la génomique comparative à des niveaux tant intra- qu’inter-spécifiques, ainsi que des tests de sélection positive. Il s’est avéré que les protéines sécrétées semblent soumises de façon plus importante à une évolution accélérée, et que la plupart de ces protéines sous pression de sélection positive possède un contenu riche en résidus Cys et sans similarité de séquence dans les banques de données internationales. La seconde partie de cette thèse présente les résultats d’un effort concerté visant la caractérisation du sécrétome entier de M. larici-populina en utilisant une annotation experte, la recherche de gènes sous pression de sélection positive, et différentes approches d’analyse des transcrits. Une portion élevée du sécrétome s’est avérée sous pression de sélection positive, et les caractéristiques énumérées ci-haut ont été observées de nouveau (protéines riches en Cys sans similarité de séquence). Parmi ces protéines, la majorité de celles possédant des évidences d’expression se sont avérées être exprimées spécifiquement in planta, avec une concentration dans la portion C-terminale des sites sous pression de sélection positive. L’immunolocalisation de certains candidats a permis de détecter la présence de ces protéines au niveau de l’haustorium, une première étape vers la caractérisation fonctionnelle de ces candidats. / Poplar leaf rusts belonging to the genus Melampsora are considered as the world’s most important disease of poplars. During infection, Melampsora species secrete a diverse set of effector proteins that aim to reprogram the host into a susceptible state. However, recognition of particular effector proteins by the plant immune system, so-called avirulence proteins, leads to induction of the hypersensitve response, a form of programmed cell death. Based on prevalent models of plant–pathogen coevolution, some of these effectors, notably those with avirulence functions, are predicted to exhibit molecular signatures of accelerated evolution. In this thesis, features described above were used to identify the pathogenicity determinants of poplar leaf rusts with the specific aim of identifying candidate effector proteins. The first part of this thesis includes the development of a multifaceted approach to take advantage of available EST libraries, and included computational prediction of secreted proteins, intra- and interspecific comparative genomics, and testing for the presence of positive selection. Accelerated evolution was found to act more importantly on secreted proteins, and most of those proteins under positive selection were shown to harbour a high number of Cys residues and to share no homology in international databases. The second part of this thesis presents the results of a collaborative effort to characterize the entire secretome of M. larici-populina using expert annotation, screening for positive selection, and transcript profiling approaches. A significant part of the secretome was found to be under positive selection, and commonalities described before were observed again (Cys-rich proteins with no homology in international databases). Most of those with transcript evidence were found to be specifically expressed in planta, and positively selected sites were concentrated in the C-terminal region, consistent with an effector function. As a first step toward a functional characterization, immunolocalization of selected candidates has revealed specific labeling of some proteins in the haustoria periphery.

La voie de sécrétion bactérienne de type V permet l’exportation à la surface cellulaire de protéines dont certaines ont été identifiées comme d’importants facteurs de la pathogénicité bactérienne. Le type V regroupe la sécrétion des autotransporteurs et la sécrétion à deux partenaires (TPS). Les autotransporteurs sont constitués d’un domaine en tonneau β; et d’un domaine passager. L’interaction de l’autotransporteur avec le complexe protéique Bam, dont la pièce centrale est le transporteur BamA, permet l’insertion dans la membrane externe du tonneau β; et la sécrétion du passager. En revanche, la sécrétion à deux partenaires fait intervenir deux protéines, l’une appelée TpsA correspondant à la protéine exportée et l’autre, TpsB, formant un tonneau β qui contrôle le transport à travers la membrane externe. Les protéines TpsB sont spécifiques à leur(s) TpsA associée(s), et font partie de la superfamille des transporteurs Omp85 qui effectuent l’insertion de protéines dans la membrane externe bactérienne comme BamA, et dans celles des organites eucaryotes dont les chloroplastes et les mitochondries. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressé à la sécrétion de l’hémagglutinine filamenteuse (FHA), qui est l’adhésine majoritaire de Bordetella pertussis, l’agent étiologique de la coqueluche. Cette adhésine qui permet à la bactérie de coloniser le tractus respiratoire de l’hôte est une protéine TpsA de 220 kD. Elle est très efficacement sécrétée par la voie de sécrétion à deux partenaires grâce à son transporteur spécifique TpsB nommé FhaC. L’étude cristallographique de FhaC a révélé un tonneau β; à 16 brins qui forme un canal dans la membrane externe obstrué par l’hélice-α; amino-terminale, H1, partagée par la majorité des TpsB, et par une boucle de surface, L6, conservée dans la superfamille Omp85. Cette conformation suggère un état au repos dans lequel le canal bouché ne pourrait pas transporter son partenaire. Afin de comprendre comment la FHA transite à l’intérieur du pore, il est donc nécessaire de connaître les changements de conformations que subit FhaC. Durant mon travail de thèse, nous avons apporté une vision plus dynamique de la sécrétion à deux partenaires en utilisant le couple FHA/FhaC comme modèle d’étude. Pour cela nous avons utilisé principalement la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE). Cette technique de biophysique permet d’étudier FhaC en solution ou réincorporée dans une bicouche lipidique et de rendre compte de la mobilité à un site donné par l’utilisation de sondes paramagnétiques. Ainsi nous avons pu montrer que FhaC est en équilibre entre plusieurs conformations, avec H1 dans le pore ou du côté périplasmique de FhaC. La présence de la FHA déplace cet équilibre, favorisant ainsi la sortie de l’hélice hors du pore. Nous avons, par ailleurs, pu démontrer expérimentalement que la FHA transitait bien à l’intérieur du pore formé par FhaC et que l’hélice H1 se trouvait alors dans le périplasme. L’étude de la boucle L6 nous a permis de montrer que la mobilité de cette boucle était fortement contrainte à l’intérieur du pore même lors de la reconnaissance avec la FHA. Ce ralentissement de mobilité est lié, en autre, à une interaction avec un résidu d’un motif conservé présent sur le brin β13 qui influence la taille du pore. De manière plus générale, cette étude de la dynamique de FhaC contribue à la compréhension des mécanismes moléculaires de la voie TPS et des transporteurs de la superfamille Omp85. / Type V secretion in bacteria mediates the export to the cell surface of proteins, some of which have been identified as important factors of pathogenicity. Type V includes the secretion of autotransporters and the ‘Two-partner Secretion’ (TPS) pathway. Autotransporters consist of a β barrel domain and a passenger domain. The interaction of autotransporters with the Bam complex, of which the BamA transporter is the central component, allows the insertion of the β; barrel in the outer membrane and the secretion of passenger domain. In contrast, the two-partner secretion involves two proteins, the exported ‘TpsA’ protein and its TpsB partner that controls its transport across the outer membrane. TpsB proteins are specific to their associated TpsA(s) and belong to the superfamily of the Omp85 transporters, which carry out the insertion of proteins into the bacterial outer membrane, like BamA, or in the outer membranes of eukaryotic organelles including chloroplasts and mitochondria. For my PhD work, I have been interested in the secretion of filamentous hemagglutinin (FHA), which is the major adhesin of Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough. This adhesin allows the colonization by this bacterium of its host’s respiratory tract. This protein corresponds to a 220kD TpsA protein efficiently secreted by its specific transporter TpsB named FhaC. Crystallographic studies have revealed that FhaC harbours a 16-stranded β;-barrel occluded by both the N-terminal α;-helix, H1, shared by the majority of TpsB proteins, and by a surface loop, L6, that carries a conserved, hallmark motif of the Omp85 superfamilly. This conformation suggests that FhaC is in a resting state in which the channel does not transport its partner. To understand how the FHA passes through the FhaC pore, it is necessary to address the conformational changes undergone by FhaC. During my thesis work, we provided a more dynamic view of the TPS pathway using the FHA/FhaC couple as study model. For this we used Electron Paramagnetic Resonance (EPR). This biophysical technique allows to study of FhaC in solution or reincorporated into a lipid bilayer and it reports the mobility at specific sites of the protein by using paramagnetic probes. Thus we have shown that FhaC is in equilibrium between multiple conformations, with H1 in the pore or at the periplasmic side of FhaC. The presence of FHA displaces the conformational equilibrium, promoting the exit of the helix going from the pore. We have also experimentally demonstrated that FHA does transit through the pore formed by FhaC while helix H1 is then in the periplasm. The study of the L6 loop enabled us to show that the mobility of this loop is highly constrained in the pore and remains so upon the recognition of FHA. Its slow mobility is linked to an interaction between an invariant L6 residue and a conserved motif present on the β; strand 13 of the barrel. This interaction affects the size of the FhaC pore.More generally, the study of the dynamics of FhaC contributes to the understanding the molecular mechanisms of the TPS pathway and of transporters of the Omp85 superfamily.

Les bactéries du genre Shigella sont responsables de la shigellose, une maladie diarrhéique invasive du colon. L’entrée et la dissémination de Shigella à travers l’épithélium colique sont médiées par un système de sécrétion de type III (SST3) codé par un plasmide de virulence. Au sein de ce plasmide se trouve une région de 30-kb comportant les gènes impliqués dans l’entrée de la bactérie dans les cellules hôtes. Ces gènes sont regroupés en deux loci :le locus ipa-ipg qui code pour les protéines sécrétées et leurs chaperons ainsi que le locus mxi-spa codant pour les composants de l’appareil de sécrétion de type III (AST3), constitué d’un bulbe cytoplasmique, d’un corps basal transmembranaire et d’une aiguille se projetant au niveau extracellulaire. Ce système permet la sécrétion ordonnée et hiérarchique de différentes classes de protéines et la translocation de certaines d’entre elles (appelées effecteurs) dans le cytoplasme de la cellule hôte où elles interfèrent avec les voies de signalisation cellulaires. Avant le contact avec la cellule hôte, l’AST3 est inactif et verrouillé par les protéines IpaB et IpaD formant le complexe d’extrémité.<p>Chez Shigella, le gatekeeper MxiC séquestre les effecteurs au niveau du cytoplasme bactérien avant la transmission par l’aiguille du signal d’activation de la sécrétion mais les composants intermédiaires liant l’aiguille à MxiC restaient inconnus. Au cours de ce travail, nous avons montré que MxiC forme un complexe avec la sous-unité de la tige interne, MxiI, afin de bloquer l’entrée du canal de sécrétion et que cette interaction est conservée chez Yersinia et Salmonella. Nous démontrons que, suite au contact cellulaire, la dissociation de ce complexe facilite le switch de sécrétion des translocateurs aux effecteurs. Nos résultats révèlent également que MxiC est capable de s’associer au chaperon IpgC afin de réguler la sécrétion des translocateurs. De plus, nous avons identifié les domaines de MxiC engagés dans la régulation du SST3 et rapporté un nouveau rôle de MxiC dans l’échappement aux macrophage impliquant une possible inhibition de la voie apoptotique classique afin de promouvoir une pyroptose. Chez Shigella, IpaD gouverne la composition du complexe d’extrémité et est impliqué dans la régulation de la sécrétion. Nous avons développé une étude phénotypique de ses régions coiled-coil et centrale et montré que la composition du complexe d’extrémité permet de définir à la fois l’état d’inductibilité de l’AST3 et la sécrétion des effecteurs tardifs. Par ailleurs, notre étude fonctionnelle des domaines de MxiC et IpaD suggère que les capacités de Shigella à échapper au macrophage et à insérer un pore de translocation ne sont pas strictement couplées. <p>La dernière partie de ce travail s’est focalisée sur la caractérisation de la protéine Spa13 de Shigella. Nous avons découvert que le défaut de sécrétion du mutant spa13 est dû à l’instabilité de la sous-unité MxiH de l’aiguille et que Spa13 n’est pas sécrété par le SST3. Nos résultats indiquent également un rôle de Spa13 dans l’escorte de chaperons et l’activation de l’appareil d’exportation afin de promouvoir la sécrétion des substrats./Shigella is the causative agent of shigellosis, also known as bacillary dysentery, an invasive disease of the human colonic epithelium. During infection, Shigella uses a type III secretion system (T3SS) to penetrate enterocytes and to disseminate into the colonic epithelium, leading to destruction of the mucosal lining and shigellosis symptoms. Most of the virulence factors of Shigella are encoded by a large plasmid harboring a 30-kb region that is sufficient to promote bacterial entry into host cells. This entry region is organized in two loci, one corresponding to the the ipa-ipg genes encoding the secreted proteins and their cognate chaperones while the other encodes Mxi-Spa proteins that form the type III secretion apparatus (T3SA), consisting of a cytoplasmic bulb, a basal body spanning the bacterial envelope and a hollow needle. The T3SS allows the ordered and hierarchical secretion of effectors by inserting a translocation pore in the host cell membrane through which effector proteins are injected into the cytosol. Before host cell contact, the T3SA is inactive and plugged by the tip complex proteins IpaB and IpaD. <p>In Shigella, the gatekeeper MxiC is known to sequester effectors within the cytoplasm prior to receiving the activation signal from the needle but the molecules involved in linking the needle and MxiC are unknown. We demonstrated that MxiC and the predicted inner-rod component MxiI form a complex plugging the T3SA entry gate and showed that this interaction is conserved in Yersinia and Salmonella. Dissociation of this complex seems to facilitate the switch in secretion from translocators to effectors upon host cell contact. Our results also revealed that MxiC binds to the chaperone IpgC to regulate translocators secretion. Moreover, we identified the domains of MxiC involved in the T3S regulation and reported a new role in macrophage escape by potential inhibition of the classical apoptosis to promote pro-inflammatory pyroptosis. <p>In Shigella, IpaD rules the composition of the tip complex and is involved in secretion control and translocon insertion. We therefore undertook a phenotypic analysis of its coiled-coil and central regions and showed that the composition of the tip complex defines both the T3SA inducibility state and late effectors secretion. Besides, our functional study on MxiC and IpaD domains suggests that Shigella abilities to escape macrophage vacuole and to insert the translocation pore are uncoupled.<p>The last part of this work is related to the characterization of the Spa13 protein of Shigella. We found that the secretion defect of the spa13 mutant is due to the instability of the needle component MxiH and that Spa13 is not a secreted substrat. Our results also support a dual role of Spa13 as a chaperone escort and as an export gate-activator switch to promote substrates secretion. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les bactéries à Gram négatif sont entourées par une enveloppe cellulaire qui, contrairement aux bactéries à Gram positif, possèdent une organisation membranaire complexe composée d’une membrane interne appelée généralement membrane cytoplasmique, un espace périplasmique contenant une matrice de peptidoglycane et une membrane externe asymétrique constituée d’une monocouche de phospholipides surmontée d’une assise de lipopolysaccharide (LPS). Afin de franchir cette barrière, les bactéries à Gram négatif ont développé différentes voies de sécrétions spécifiques dédiées à l’export des protéines (effecteurs) du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire. Jusqu'à présent, six systèmes de sécrétion ont été identifiés chez ces bactéries. Chez Pseudomonas aeruginosa, une bactérie pathogène opportuniste, le système de sécrétion de type II appelé aussi sécréton Xcp constitue l’un des facteurs principales de sa virulence. Le sécréton Xcp est un complexe macromoléculaire formé par 12 protéines, nommées XcpAO et XcpPC-XcpZM. Ce complexe macromoléculaire est organisé en trois sous-complexes : i) une plateforme d’assemblage ancrée dans la membrane interne formé par les protéines XcpRESFYLZM ii) un pore de sécrétion localisé dans la membrane externe formé par l’oligomérisation d’une protéine appelé la sécrétine XcpQD. Le pore de sécrétion est connecté à la plateforme de la membrane interne par une protéine appelée XcpPC iii) un pseudopilus périplasmique sous forme de fibre hélicoïdale qui est formé par la multimérisation d’une protéine appelée la pseudopiline majeure XcpTG. D’autres protéines appelées les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK intègrent le pseudopilus. La première partie du travail effectué au cours de cette thèse a eu pour but d’étudier et de comprendre par des approches structurales, biochimiques et biophysiques le mécanisme d’assemblage des pseudopilines en pseudopilus. La deuxième partie de ce travail a porté sur l’étude des réseaux d’interactions entre les substrats sécrétés et les composants de la machinerie Xcp. Durant cette thèse, nous avons ainsi i) identifier grâce à l’étude des interactions protéine-protéine l’existence d’un complexe quaternaire entre les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK localisées au sommet du pseudopilus ii) déterminer les structures de la pseudopiline majeure XcpTG par RMN et de la pseudopiline mineure XcpWJ par cristallographie aux rayons X iii) déterminer les différents éléments du sécréton qui interagissent avec les exoprotéines du sécréton. Ce réseau d’interaction nous a permis de proposer un modèle de fonctionnement du sécréton qui élucide le cheminement des exoprotéines dans le sécréton afin qu’elles soient exportées vers le milieu extracellulaire. / Gram-negative bacteria are characterized by a complex organization of their cell envelope composed by the inner membrane (IM) called cytoplasmic membrane, the periplasmic space containing a peptidoglycan layer and the outer membrane (OM) covered by the lipopolysaccharide matrix. Gram-negative bacteria have evolved several specialized machines called secretion systems to export their effectors from the intracellular medium to the extracellular milieu or to the host cells. Up to now, at least six secretion systems have been identified. In the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa, the type II secretion system called the Xcp secreton is the major pathway for the release of virulence factors. The Xcp secreton is a macromolecular complex composed by 12 proteins called XcpAO, XcpPC-XcpZM. This machinery is organized in 3 sub-complexes: i) the assembly platform localized in the IM implicating XcpRESFYLZM proteins ii) the OM pore composed by the oligomerization of the secretin XcpQD. The connection between the assembly platform and the secretin is performed by XcpPC anchored in the IM iii) a periplasmic pseudopilus consisting of the multimerization of the so-called major pseudopilin XcpTG. The pseudopilus is a helicoidally filament spanning the periplasmic area and pushing the substrate into the secretin pore. Four other proteins, the minor pseudopilins XcpUH-VI-WJ-XK, were found in the pseudopilus. In the present work we first focused on the study of the pseudopilus components by biochemical, biophysical and structural strategies to understand their assembly. Secondly, we investigate the protein interactome between periplasmic secreton component and secreted substrates. Thus, we revealed the presence of a quaternary complex composed by XcpUH-VI-WJ-XK located at the tip of the pseudopilus. To understand at atomic scale the regulation of the pseudopilus, we determined the structure of two components of the pseudopilus XcpTG by NMR and XcpWJ by X-ray crystallography. Using systematic protein-protein interaction studies between secreton components and purified exoproteins of Pseudomonas aeruginosa, we identified 5 proteins of the secreton able to interact with exoproteins. This interaction network allowed us to propose a model for the secretion process including the sequential steps followed by exoproteins inside the secreton to leave the cell envelop.