Le système neuro-sensoriel est considéré comme une synapomorphie des eumétazoaires, sur la base de la présence, chez ces organismes, du neurone. Les éponges, en tant que métazoaires non-bilatériens, sont d’un intérêt tout particulier pour comprendre l’origine et l’évolution de nombreux processus développementaux, tels que la mise en place du système neuro-sensoriel. Même si elles ne possèdent pas de neurones, ce ne sont pas des organismes passifs ; elles présentent des formes de communication chimiques et électriques. Cependant, rien n’est actuellement connu concernant les types cellulaires ni les mécanismes précis impliqués dans ces processus. Dans cette perspective de recherche, l’éponge homoscléromorphe Oscarella lobularis a été choisie comme modèle lors de cette thèse. Dans un premier temps, différents travaux pour la caractériser ont été réalisés. L’étude de ses relations phylogénétiques au sein des homoscléromorphes a notamment permis de restaurer une ancienne famille : les Oscarellidae. Je me suis attachée par la suite à identifier des gènes connus pour être impliqués dans la mise en place du système nerveux chez les eumétazoaires. Parmi les mécanismes moléculaires connus, la voie de signalisation Notch semble incontournable chez les bilatériens. Son origine et son évolution ont été étudiées à l’échelle des eucaryotes, révélant ainsi que cette voie est une synapomorphie des métazoaires bien que plusieurs de ses composants soient plus anciens. Mes résultats d’immunolocalisation de la protéine Notch révèlent un marquage dans les choanocytes. En parallèle, j'ai également montré l'expression dans ces cellules d'un facteur de transcription apparenté aux NK6-7, familles jouant un rôle dans la neurogenèse chez les bilatériens. Ces résultats semblent appuyer une hypothèse récente proposant que les choanocytes pourraient avoir des fonctions neuro-sensorielles. L'intégration d’autres données (moléculaires, physiologiques, biochimiques…) reste cependant indispensable à la validation de cette hypothèse et sont en cours de développement. Plus globalement, ces résultats vont dans le sens d'hypothèses récentes qui suggèrent que l'ancêtre commun des métazoaires présentait déjà une relative complexité moléculaire et fonctionnelle, même si ces fonctions devaient être assurées par des cellules multifonctionnelles. / The neuro-sensory system is considered to be a eumetazoan synapomorphy. Indeed, all these organisms share a specifialized cell: the neurone. Sponges, as non-bilateiran, are of special interest to investigate the origin and evolution of developmental processes, such as the emergence of neuro-sensory system. Although they are nerveless, sponges are not passive organisms; they harbour chemical and electric communication. Nevertheless, presently, nearly nothing is known concerning implicated cell types or conduction mechanisms. In the aim of understanding the nervous system origin, the homoscleromorph sponge Oscarella lobularis has been used as a sponge model in this thesis. First, diverse studies have been realised in order to characterise this species. The study of its phylogenetic position among homoscleromorph allowed us to restore an ancient family: the Oscarellidae. Then, I tried to identify genes that are known to be implicated in eumetazoan nervous system patterning. Among them, the Notch signalling pathway is crucial. Its origin and evolution have been investigated at the eukaryotic scale, revealing that this pathway is a metazoan synapomorphy, although several components emerged earlier. Notch protein immunolocalisation results in the staining of choanocytes. In parallel, I have also reported the expression pattern exclusively in this cell type, of a transcription factors related to NK6-7, those families being implicated in bilaterian neurogenesis. These results are in agreement with a recent hypothesis proposing that choanocytes may harbor neuro-sensory functions. The integration of other molecular, physiological and biochemical data is crucial to validate this hypothesis and is in progress. More globally, these results are in agreement with recent hypotheses suggesting a relative molecular and functional complexity of the metazoan common ancestor, although diverse functions may have been assumed by multifunctional cells.

La transplantation de cellules souches de muscle possède un grand potentiel pour la réparation à long terme du muscle dystrophique. Cependant, la croissance ex vivo des cellules souches musculaires réduit de manière significative l'efficacité de leur greffe puisque le potentiel myogénique est considérablement réduit lors de la mise en culture. La voie de signalisation Notch a émergé comme un régulateur majeur des cellules souches musculaires (MuSCs) et il a également été décrit que la sur-activation de Notch est crucial pour le maintien du caractère souche des MuSC. Cette découverte pourrait être traduite comme un bénéfice thérapeutique potentiel. Des MuSCs murines ont été fraîchement isolées et ensemencées sur des boîtes de culture recouverte de Dll1-Fc, le domaine extracellulaire de Delta-like-1 est fusionné au fragment Fc humain, afin d'activer la voie de signalisation Notch et avec un IgG hu-main comme contrôle. Nous avons utilisé le rAAV afin d’exprimer le Dll1 spécifique-ment dans les muscles de souris. Les souris P3 ont été traitées avec de l’AAV pendant 3 semaines et 6 semaines afin d’étudier l'effet de Dll1 au cours du développement postnatal. Afin d’étudier le processus de régénération, l'AAV a également été injecté dans les muscles de souris mdx alors que les souris de type sauvage ont été utilisées comme contrôle. Un potentiel caractère souche supérieur (marquée avec le Pax7) est observé dans les cultures des MuSCs qui sont recouverte de Dll1-Fc par rapport à leurs homologues contrôles, par contre le taux de proliférer est réduit. Au cours du développement postnatal, la sur-activation de la voie de signalisation Notch par Dll1 sur les fibres musculaires a été en mesure d'élargir le pool des cellules Pax7+, cependant elle entraîne une diminution de la masse musculaire avec réduction de la taille des fibres et ceci sans affecter l'accumulation des myonuclei. Dans les MuSCs quiescentes (de type sauvage), la sur-activation de la voie de signalisation Notch ne présente pas de réel effet. La surexpression de Dll1 dans le muscle mdx a diminué la masse musculaire et agrandit le pool de cellules souches musculaires, ce-pendant le taux de régénération n'a pas été affecté. L’augmentation des MuSCs est attribuée à une différenciation entravée des cellules souches musculaires. En étudiant la stimulation de la voie de signalisation Notch dans les MuSCs à la fois in vitro et in vivo, nous démontrons que sur-activation de Notch préserve le caractère souche des cellules via l’inhibition de la prolifération et de la différenciation myogénique des MuSCs. / Muscle stem cell transplantation possesses great potential for long-term repair of dys-trophic muscle. However expansion of muscle stem cells ex vivo significantly reduces their engraftment efficiency since the myogenic potential is dramatically lost in culture. The Notch signaling pathway has emerged as a major regulator of muscle stem cells (MuSCs) and it has recently been discovered that high Notch activity is crucial for maintaining stemness in MuSCs. This feature might be exploited and developed into a novel therapeutic approach.Murine MuSCs were freshly isolated and seeded on culture vessels coated with Dll1-Fc, which fused Delta-like-1 extracellular domain with human Fc, to activate Notch sig-naling and with human IgG as a control. The rAAV gene delivery system was em-ployed to express Dll1 in murine muscles. P3 mice were treated with AAV for 3 weeks and 6 weeks to investigate the effect of Dll1 during postnatal development. To investi-gate the regeneration process, AAV were injected into mdx muscles whereas wild-type mice were used as control.Higher potential stemness (marked by Pax7 positivity) was observed in MuSCs grow-ing on a Dll1-Fc surface as compared to their counterparts on the control surface, while their proliferation rate was reduced. During postnatal development, overstimulation of Notch signaling by Dll1 on the mus-cle fibers was able to enlarge the Pax7+ cell pool, while also resulting in decreased muscle mass and smaller muscle fibers without affecting the accretion of myonuclei into the fiber. In quiescent (wild-type) MuSCs, overstimulation of Notch signaling did not have any discernible effect. Overexpression of Dll1 in mdx muscle decreased the muscle mass and enlarged the muscle stem cell pool, while muscle regeneration re-mained unaffected. By investigating Notch stimulation in MuSCs both in vitro and in vivo, we demonstrate that high Notch activity preserves stemness via inhibition of MuSCs proliferation and myogenic differentiation. Our findings point out that the Dll1 molecule, as a canonical Notch ligand, might have a therapeutic potential in cell-based therapies against muscu-lar dystrophies.

Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer chez les hommes et les femmes dans le monde. Malgré les avancées majeures dans les traitements, les thérapies à base de platine restent la thérapie standard pour les patients atteints du cancer du poumon induit par la mutation KRAS. Bien que les composés de platine aient un premier effet sur ces patients, l’apparition d’une rechute constitue le principal défi au niveau clinique.Dans ce contexte, notre projet actuel vise à caractériser l’activation de la voie Notch dans la réponse aux sels de platines d’adénocarcinomes mutés pour K-Ras ainsi que son rôle dans l’acquisition de la résistance à ce traitement. Nous avons mis en évidence que la voie Notch est activée en réponse à divers agents induisant des dommages à l’ADN dans des lignées de cancer du poumon. Nous avons montré que cette activation est dépendante de la voie de checkpoint de Réponse aux Dommages de l’ADN (DDR) via ATM, ATM qui est une des principales kinases de la réponse cellulaire aux lésions de l’ADN telles que les cassures double-brin, causé notamment par la chimiothérapie conventionnelle. Parmi les nombreux substrats d’ATM en réponse à ces dommages, nous montrons un effet direct de MDM2 dans l’activation de la voie Notch en réponse aux dommages à l’ADN causé par le carboplatine. Nos données montrent une nouvelle interaction entre ATM, MDM2 et Notch, lors du traitement au carboplatine, qui pourrait jouer un rôle dans la cascade de signalisation favorisant la survie des cellules tumorales pulmonaires.En utilisant des xénogreffes dérivées de patients atteints d’adénocarcinomes du poumon, ainsi qu’un modèle cellulaire de xénogreffe résistant à la carboplatine, nous avons montré que l’association d’inhibiteurs de Notch et de MDM2 associé au traitement au carboplatine ont un effet accru sur le ralentissement de la croissance de la tumeur et sur la survie, en comparaison avec le traitement actuel de référence que représente le carboplatine.Nos résultats offrent une nouvelle possibilité de thérapie pour les adénocarcinomes de poumons mutés pour KRAS, et pourrait donc répondre à un besoin clinique urgent notamment pour contrecarrer la résistance aux chimiothérapies conventionnelles à base de sels de platine. / Lung cancer is the leading cause of cancer death among men and women worldwide. Despite the major advances in the treatments, platinum-based therapy remains the standard of care for patients affected by KRAS-driven lung cancer. Even though the platinum-compounds display an initial effect on these patients, the onset of the relapse constitutes the main challenge for the clinic. The molecular mechanisms underlying lung adenocarcinoma (LUAD) relapse are not completely elucidated yet, thus it is fundamental to understand them in order to improve survival of patients. Our data show that upon carboplatin treatment, the Notch pathway is activated in vitro. Since this effect was common for several other DNA damage insults, our driving hypothesis connected the DNA Damage Response (DDR) to the activation of the Notch pathway. Our data demonstrates that protein kinase ataxia telangiectasia-mutated (ATM) is a key mediator in the activation of the Notch pathway during DNA damage signalling. ATM is well-known as the chief mobilizer of the cellular response to the most toxic lesions to the DNA, the double-strand breaks which are also the type of damage caused by the conventional chemotherapy. Among the several substrates of ATM in response to the damage, there is the mouse double minute 2 protein (MDM2) that it is known to interact with the Notch pathway. Our data uncovered a new pathway connecting ATM, MDM2 and NICD during carboplatin treatment in LUAD cells.Using LUAD Patient-Derived Xenografts and a new generated carboplatin resistant cellular model, we show in vivo that the combination of Notch and MDM2 inhibitors with carboplatin showed a therapeutic benefit in tumour growth and survival compared to the standard of care, i.e. carboplatin.Our results can offer a new therapeutic window for KRAS-driven LUAD that become resistant to platinum-based therapy, hence tackling an urgent and unmet clinical need.

La sarcopénie est définie comme la diminution de la masse et de la force musculaires squelettiques au cours du vieillissement.Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse était d’évaluer l’action régulatrice de la vitamine D sur le dialogue entre cellules immunitaires et musculaires et son implication dans les capacités de régénération du muscle âgé.Dans un premier temps, nous avons étudié in vitro la différenciation des cellules musculaires de la lignée L6 co-cultivée ou non avec des cellules immunitaires (PBMC : cellules mononuclées du sang périphérique), et en présence ou non de LPS. Ce modèle a permis d’établir que les PBMC stimulaient bien la différenciation musculaire. La réponse pro-inflammatoire induite par le LPS inhibait l’expression des marqueurs de différenciation. Même en présence de LPS, la stimulation de l’expression ce des marqueurs dans les L6 co-cultivées était conservée. De plus, l’environnement pro-inflammatoire induit par le LPS dans les co-cultures inhibait l’expression musculaire des marqueurs de la voie de la régénération, comme Notch. Nous avons ensuite utilisé le même système de co-cultures afin de déterminer si la vitamine D, ici la 25(OH)D, pouvait moduler les sécrétions cytokiniques des PBMC et ainsi modifier l’expression des marqueurs de différenciation musculaires. Le traitement des co-cultures à la 25(OH)D n’a modifié ni le profil de sécrétion cytokinique des PBMC, ni l’expression des marqueurs de différenciation des L6.Dans un deuxième temps, nous avons étudié à l’aide d’un modèle de rats âgés déplétés en vitamine D les mécanismes pouvant contribuer à l’atrophie musculaire observée. Nous avons mis en évidence que l’activité de la voie de signalisation Notch, voie clé du processus de régénération, ainsi que la prolifération musculaire étaient diminuées chez ces rats, et ceci même en absence de lésion. Nous avons ensuite évalué l’effet du statut en vitamine D sur un processus aigu de régénération au cours de vieillissement chez le rat. L’analyse de cette expérimentation, actuellement en cours, a déjà permis de mettre en évidence qu’au cours du vieillissement, la prolifération musculaire suite à une lésion est diminuée, d’autant plus si le rat âgé est carencé en vitamine D. Le même résultat a été retrouvé pour l’expression d’une cible de la voie Notch (Hes1). En outre, l’expression des marqueurs de différenciation semblaient être altérée chez les animaux âgés résultant probablement en un retard et/ou une inefficacité du processus de différenciation, en particulier chez les rats âgés déplétés en vitamine D. En revanche, la supplémentation en vitamine D ne semblait pas avoir d’effet sur la régénération musculaire du rat âgé.En conclusion, in vitro, la 25(OH)D ne modifiait pas l’expression des marqueurs de différenciation des cellules musculaires co-cultivées avec des cellules immunitaires. En revanche in vivo, la déplétion en vitamine D semblerait aggraver l’effet de l’âge sur la régénération musculaire.La diminution de la capacité de régénération musculaire est un facteur contribuant au développement de la sarcopénie. Ce travail a permis de montrer que le maintien d’un statut optimal en vitamine D serait nécessaire à la conservation des capacités de régénération musculaire. Il semble donc important de maintenir des statuts optimaux en vitamine D afin de limiter l’atrophie musculaire au cours du vieillissement. / One of the most striking effects of ageing is an involuntary loss of skeletal muscle mass known as sarcopenia. The development of sarcopenia appears to be multifactorial and includes anabolic resistance to dietary amino acids and sedentary lifestyle. The diminished ability of aged muscle to self-repair is also a key factor of sarcopenia. During the regeneration process, immune and muscle cells work in a cross-talk leading to an optimal muscle cell proliferation and differentiation. However, with aging, the immune response is impaired, possibly contributing to the reduction in the capacity of regeneration.Muscle and immune cells are both targets of vitamin D action. This vitamin modulates muscle cell proliferation and differentiation and stimulates the anti-inflammatory response of immune cells. With age, vitamin D insufficiencies or deficiencies develop.In this context, the main objective of this thesis was to evaluate the regulatory action of vitamin D on the cross-talk between immune and muscle cells and its implication in the ability of skeletl muscle to regenerate during aging.Initially, we studied in vitro the differentiation of L6 muscle cells co-cultured with or without immune cells (PBMC: peripheral blood mononuclear cells), and in with or without of LPS. From this model, PBMC stimulated muscle cell differentiation. The pro-inflammatory response induced by LPS inhibited the expression of muscle differentiation markers in muscle cells. Of note, these markers were stimulated even in presence of LPS. In addition, the LPS-associated pro-inflammatory environment inhibited the Notch signaling pathway, the key pathway of muscle regeneration process, in L6 cells co-cultured with PBMC. We then used the same system of co-cultures to determine whether vitamin D, in its 25 (OH)D form, could modulate PBMC cytokine secretion and thereby could alter the expression of markers of muscle differentiation. Unfortunately, the treatment of co-culture with 25 (OH) D has changed neither the profile of PBMC cytokine secretion nor the expression of differentiation markers in L6 cells.Secondly, we investigated in a model of old rats the mechanisms that contribute to muscle atrophy following vitamin D depletion. We have demonstrated that the activity of the Notch signaling pathway, as well as muscle proliferation were reduced in old vitamin D-depleted rats, even in the absence of lesions. Then we evaluated the effect of the vitamin D status on an acute muscle regeneration process, i.e. muscle infusion of notexin in old rats. This ongoing experiment has already highlighted that during aging, muscle proliferation is reduced after injury, especially if age is associated with a vitamin D deficiency. In addition, during aging, the expression of differentiation markers was altered resulting in delayed and/or incomplete differentiation process, in particular in vitamin D-depleted old rats. However, vitamin D supplementation seemed to have no beneficial or deleterious effects on muscle regeneration in aged rats.In conclusion, in vitro 25 (OH) D was unable to modulate the differentiation of muscle cells co-cultured with immune cells. However, in vivo, vitamin D depletion appeared to worse the effect of ageing on muscle regeneration.The diminished ability of aged muscle to self-repair is a factor of sarcopenia. Our work has demonstrated the importance of maintening optimal vitamin D status to preserve muscle regeneration capacity and thus to limit muscle atrophy during aging.

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La protéine O-fucosyltransférase 1 (POFUT1) réticulaire, dont le gène est localisé dans la région chromosomique 20q11.21 chez l’Homme, catalyse le transfert d’un fucose qui sera O-lié sur la sérine ou la thréonine présente dans la séquence consensus (C2X4S/TC3), portée par un domaine EGF-like d’une glycoprotéine membranaire ou sécrétée. Le knockdown de Pofut1 (Po -) dans la lignée myoblastique murines C2C12 conduit à la formation de myotubes allongés et minces, à faible nombre de noyaux ainsi qu’à une sous-expression du marqueur myogénique tardif Myf6, suggérant des défauts significatifs dans la fusion secondaire. La signalisation NFATc2/IL-4 est décrite comme la voie principale associée à cette étape. Nous montrons que la moindre expression de Nfatc2 dans les myotubes Po - est corrélée à une baisse de l'IL-4 sécrétée et à une faible quantité de son récepteur (IL-4Rα) présent chez les cellules de réserve qui doivent participer à la fusion avec les myotubes naissants. La neutralisation de l’IL-4Rα sur les C2C12 sauvages provoque des défauts d'accrétion myonucléaire, semblables à ceux observés pour les Po -. Ainsi, POFUT1 pourrait être un nouveau médiateur de la croissance des myotubes au cours du processus myogénique, notamment par la signalisation NFATc2/IL-4. La glycoprotéine WIF1, cible potentielle de POFUT1, est un antagoniste de la signalisation WNT via sa fixation aux protéines WNT. Cette voie est connue pour être impliquée dans la prolifération et la différenciation des myoblastes. Néanmoins, aucune donnée ne concerne le rôle de WIF1 dans le processus myogénique. Par un apport exogène de WIF1, nous avons montré l’augmentation de la prolifération et l’altération de la différenciation myoblastique des C2C12. Lors de la prolifération, une augmentation de l’expression de Myf5 et une diminution de MyoG sont observées. A 7 jours de différenciation, les myotubes Po - ont un diamètre plus petit que les myotubes sauvages et ils sont plus nombreux à avoir un faible nombre de noyaux, traduisant des défauts de fusion. Nous démontrons pour la première fois, l’implication de la protéine WIF1 dans le processus myogénique. Récemment, POFUT1 a aussi été proposé comme nouveau biomarqueur pour certains cancers, mais pas évalué dans le cancer colorectal (CCR). Nous avons donc collecté des données issues de 626 tumeurs et 51 tissus adjacents non tumoraux disponibles dans FireBrowse, celles de lignées cellulaires cancéreuses colorectales et de prélèvements tumoraux provenant du Centre de Ressources Biologiques du CHU de Limoges. Une surexpression de POFUT1 est observée dès le stade I, majoritairement due à une amplification de la région 20q11.21. Elle est significativement associée aux adénocarcinomes non mucineux et à une localisation rectale. De plus, l’expression de POFUT1 est corrélée à celles des récepteurs NOTCH ainsi qu’au processus métastatique, probablement par activation de la voie NOTCH. A ce titre, POFUT1 pourrait être considéré comme un nouveau biomarqueur pour le diagnostic du CCR. / The ER protein O-fucosyltransferase 1 (POFUT1), whose gene is located at the 20q11.21 chromosomic region in humans, catalyzes O-linked fucose addition to serine or threonine present in the consensus sequence (C2X4S/TC3) carried by EGF-like domain of membrane or secreted glycoprotein. Pofut1 knockdown (Po -) in murine myoblast C2C12 cell line leads to formation of elongated and thin myotubes, with a low number of nuclei and to downexpression of the late myogenic marker Myf6, suggesting significant defects in secondary fusion. NFATc2/IL-4 signaling is described as the main pathway associated to this step. We showed that the slightest expression of Nfatc2 in Po - myotubes is correlated with a decrease in IL-4 secretion and a lower quantity of IL 4Rα in reserve cells, which had to fuse with nascent myotubes. IL-4Rα neutralization on wild-type C2C12 causes myonuclear accretion defects, similar to those observed in Po -. Then, POFUT1 could be a new mediator of myotube growth during myogenic process, particularly through NFATc2/IL-4 signaling. The glycoprotein WIF1, potential POFUT1 target, is an antagonist of WNT signaling via its binding to WNT proteins. This pathway is involved in proliferation and differentiation of myoblasts. However, no data are available on WIF1 role in the myogenic process. Through exogenous WIF1 treatment, we showed a proliferation increase and a myoblast differentiation impairment in C2C12. During proliferation, increase in Myf5 and decrease in MyoG expressions are observed. At 7 days of differentiation, Po - myotubes have a smaller diameter than wild-type ones and are more numerous to have a small number of nuclei, reflecting fusion defects. For the first time, we demonstrate the involvement of WIF1 in the myogenic process. Recently, POFUT1 was proposed to be a new biomarker for several cancers, but not evaluated in colorectal cancer (CRC). We used data from 626 tumors and 51 adjacent non-tumor tissues available at FireBrowse, colorectal cancer cell lines and tumor samples from the Biological Resource Centre of Limoges hospital. A POFUT1 overexpression is observed from stage I, mainly due to amplification of 20q11.21 region. It is significantly associated to non-mucinous adenocarcinoma and to rectum location. Moreover, POFUT1 expression is correlated with those of NOTCH receptors as well as the metastatic process, probably by activation of the NOTCH pathway. POFUT1 could therefore be considered as a new biomarker for CRC diagnosis.

Au pic de la réponse effectrice des LT CD8, on retrouve deux sous-populations, soit les effecteurs à demi-vie courte (SLEC) ou les effecteurs précurseurs de cellules mémoires (MPEC). La phase de contraction de la réponse effectrice implique l’apoptose des SLEC et la survie des MPEC, qui se différencient en cellules mémoires pour protéger contre une réinfection. La voie Notch est impliquée dans les choix de différenciation binaire et l’interaction ligand-récepteur mène au clivage du domaine intracellulaire de Notch (NICD), qui migrera au noyau afin d'induire l’expression de gènes cibles. Dans un modèle où l’expression des récepteurs Notch1 et Notch2 est absente uniquement dans les LT CD8 (N1N2∆/∆), le laboratoire a démontré que l’absence du signal Notch favorisait la différenciation en MPEC et affectait l’expression de 217 gènes. Cette étude visait à 1) identifier les gènes cibles de Notch contrôlant la différenciation SLEC-MPEC, et 2) évaluer si l’absence du signal Notch permet un meilleur contrôle tumoral par les LT CD8. Nous avons priorisé les 217 gènes en fonction de différents critères et identifié Il2ra comme une cible importante en aval de la voie Notch. Toutefois, nous avons établis que lors d’une infection aiguë, la surexpression rétrovirale de Il2ra dans les LT CD8 N1N2∆/∆ n’influençait pas la différenciation SLEC-MPEC. Nous avons également déterminé qu’une thérapie adoptive de LT CD8 N1N2∆/∆ limitait le contrôle de la croissance tumorale et impliquait une diminution des fonctions effectrices des LT CD8 N1N2∆/∆, qui étaient moins terminalement différenciés. Une meilleure compréhension du rôle de Notch dans la réponse des LT CD8 permettra de développer de nouvelles stratégies de vaccination et de traitement du cancer. / In response to acute infections, effector CD8 T cells differentiate into short-lived effector cells (SLECs) and memory precursor effector cells (MPECs) capable of generating long-lived memory CD8 T cells. The Notch signaling pathway is a key regulator of cell fate decision. Following ligand- receptor interaction, the Notch intracellular domain (NICD) is cleaved and migrates to the nucleus in order to induce the expression of target genes. In a model in which Notch1 and Notch2 expression is inhibited only in mature CD8 T cells, our team has established that Notch deficiency favors MPEC differentiation in CD8 T cells and influences the expression of 217 gens. This study aims to: 1) identify target genes of the Notch pathway regulating SLEC-MPEC differentiation, 2) evaluate if Notch deficiency can augment tumor control by CD8 T cells. We have prioritized the list of genes differentially expressed in the absence of Notch signaling according to various criteria. We hence identified Il2ra as a target gene, but during an acute infection, overexpression of Il2ra in Notch deficient CD8 T cell was insufficient to modulate SLEC-MPEC differentiation. In addition, we have established that adoptive therapy with Notch deficient CD8 T cell impaired tumor control and implicated a diminution of effector function in Notch deficient CD8 T cell, which were less terminally differentiated. A better understanding of Notch signaling pathway’s role in the CD8 T cell response will allow for improvement of vaccinal strategies and cancer treatment.

Lors d’une infection par un pathogène, des lymphocytes T CD8+ naïfs (LTn) spécifiques de l’antigène sont activés, prolifèrent et se différencient en LT effecteurs (LTe). Les LTe produisent différentes cytokines et acquièrent une activité cytotoxique menant à l’élimination du pathogène. Seulement 5 à 10 % des LTe survivront et se différencieront en LT mémoires (LTm), qui sont capables de répondre plus rapidement lors d’une seconde infection par le même pathogène, contribuant au succès de la vaccination. Toutefois, la compréhension de l’ensemble des mécanismes régulant le développement des LTe et des LTm demeure incomplète. Afin de mieux comprendre les signaux requis pour la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immune, nous avons posé deux hypothèses. Nous avons d’abord proposé que différentes cellules présentatrices d’antigène (CPA) fournissent différents signaux au moment de la reconnaissance antigénique influençant ainsi le devenir des LT CD8+. Vu leur potentiel d’utilisation en immunothérapie, nous avons comparé la capacité d’activation des LT CD8+ par les lymphocytes B activés via le CD40 (CD40-B) et les cellules dendritiques (CD). Nous avons montré que l’immunisation avec des CD40-B induit une réponse effectrice mais, contrairement à l’immunisation avec des CD, pratiquement aucun LTm n’est généré. Les LTe générés sont fonctionnels puisqu’ils sécrètent des cytokines, ont une activité cytotoxique et contrôlent une infection avec Listeria monocytogenes (Lm). Nous proposons qu’une sécrétion plus faible de cytokines par les CD40 B ainsi qu’une interaction plus courte et moins intime avec les LT CD8+ comparativement aux CD contribuent au défaut de différenciation des LTm observé lors de la vaccination avec les CD40-B. Ensuite, nous posé l’hypothèse que, parmi les signaux fournis par les CPA au moment de la reconnaissance antigénique, la voie de signalisation Notch influence le développement des LTe, mais aussi des LTm CD8+ en instaurant un programme génétique particulier. D’abord, grâce à un système in vitro, le rôle de la signalisation Notch dans les moments précoces suivant l’activation du LT CD8+ a été étudié. Ce système nous a permis de démontrer que la voie de signalisation Notch régule directement l’expression de la molécule PD-1. Ensuite, grâce à des souris où il y a délétion des récepteurs Notch1 et Notch2 seulement chez les LT CD8+ matures, un rôle de la voie de signalisation Notch dans la réponse immune des LT CD8+ a été démontré. Nos résultats démontrent que suite à une infection avec Lm ou à une immunisation avec des CD, la signalisation Notch favorise le développement de LTe, exprimant fortement KLRG1 et faiblement CD127, destinés à mourir par apoptose. Toutefois, la signalisation Notch n’a pas influencé la génération de LTm. De façon très intéressante, l’expression des récepteurs Notch influence la production d’IFN- en fonction du contexte d’activation. En effet, suite à une infection avec Lm, l’absence des récepteurs Notch n’affecte pas la production d’IFN- par les LTe, alors qu’elle est diminuée suite à une immunisation avec des CD suggérant un rôle dépendant du contexte pour la voie de signalisation Notch. Nos résultats permettent une meilleure compréhension des signaux fournis par les différentes CPA et de la voie de signalisation Notch, donc des mécanismes moléculaires régulant la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immunitaire, ce qui pourrait ultimement permettre d’améliorer les stratégies de vaccination. / Following an infection with a pathogen, antigen-specific naive CD8+ T lymphocytes (Tn) will proliferate and differentiate into effector (Te) cells. Those Te cells will produce different cytokines and acquire a cytotoxic activity, leading to pathogen clearance. Only 5 to 10 % of Te cells will survive and differentiate into memory CD8+ T lymphocytes (Tm) able to respond rapidly following a second encounter with the same pathogen, contributing to the success of vaccination. However, the mechanisms regulating Te and Tm cells development remain incompletely understood. To better understand the signals required for CD8+ T lymphocytes during an immune response, we proposed two hypotheses. First, we propose that different antigen presenting cells (APCs) can deliver different signals to CD8+ T lymphocytes at the time of priming leading to different outcome. Given their potential for use in immunotherapy, we compared the ability of CD40 activated B lymphocytes (CD40-B) and dendritic cells (DCs) to activate CD8+ T lymphocytes. We have shown that CD40-B cell immunisation leads to an effector response but very few Tm cells are generated compared to DC immunisation. The Te cells generated following CD40-B cell immunisation are functional because they secrete cytokine, are cytotoxic and control a Listeria monocytogenes (Lm) infection. We propose that CD40-B cells secrete less cytokines and interact during shorter period of time with the CD8+ T lymphocytes, without engulfment, contributing to the decreased Tm generation observed following immunisation with CD40-B cells. Second, among the signals provided by APC at the time of CD8+ T lymphocyte priming, we have hypothesised that the Notch signalling pathway influences Te and Tm cell differentiation by inducing a particular genetic program. Using an in vitro system, we first studied the role of the Notch signalling pathway in the hours following CD8+ T lymphocyte priming. We demonstrated that Notch signalling directly regulates PD-1 expression. Then, studying mice where Notch1 and Notch2 receptor genes are deleted only in mature CD8+ T lymphocytes, we characterised the role of the Notch signalling pathway on Te and Tm differentiation during an immune response. Our results show that following Lm infection or a DC immunisation, the Notch signalling pathway promotes the differentiation of short lived effector cells Te cells (KLRG1highCD127low) meant to die by apoptosis. However, the Notch signalling pathway did not influence the generation of CD8+ Tm cells. Most interestingly, IFN- regulation by the Notch signalling pathway depends on the activation context. Indeed, following Lm infection, lack of Notch receptors does not impact IFN- secretion by Te cells while it is significantly decreased following a DC immunisation suggesting a context dependant role for the Notch signalling pathway. Our findings provide a better understanding of the key signals provided by APC as well as the Notch signalling pathway, and thus the molecular mechanisms leading to CD8+ lymphocyte effector and memory generation which is crucial as this knowledge may ultimately lead to improved vaccination.

Les soins pulpaires en denture lactéale sont les soins fréquemment réalisés en odontologie pédiatrique et la réaction pulpaire ainsi que les mécanismes de réparation tissulaire lors d’un traumatisme ne sont pas très bien connus ou investigués. En se référant à la littérature dentaire, on constate que les recherches sont souvent focalisées sur la denture définitive.<p>Objectifs<p>1) Etudier l’influence du traitement avec divers matériaux sur la formation dentinaire, la structure tissulaire et le degré d’inflammation.<p>2) Acquérir des connaissances sur l’interaction à l’interface matériau/tissu.<p>3) Etudier le rôle de la voie de signalisation Notch (1 et 2) dans le processus de remaniement et réparation du tissu pulpaire en cas de traumatisme.<p>Matériels et méthodes<p>Deux types de soins pulpaires, la pulpotomie et le coiffage direct, sont réalisés sur les dents lactéales porcines et les résultats sont étudiés après 3 périodes :7 jours, 21-28 jours et 90 jours.<p>La pulpotomie :8 matériaux, 10 dents par matériau, 2 matériaux par cochon et par période pour un total de 240 dents.<p>Le coiffage direct :10 matériaux, 10 dents par matériau, 2 matériaux par cochon et par période pour un total de 300 dents.<p>Par la suite, différentes techniques ont été utilisées :<p>1. La microscopie optique :étude des coupes histologiques après coloration.<p>2. La microscopie électronique à transmission :observer les caractéristiques morphologiques du tissu pulpaire et analyser les structures cellulaires en détail. L’objectif principal de cette recherche était centré sur les biomatériaux pour la période de 21-28 jours afin d’examiner l’interaction entre le biomatériau et le complexe dentino-pulpaire après leur placement.<p>12<p>3. La voie de signalisation Notch (1 et 2): investiguer l’intervention éventuelle de cette voie dans le processus de régénération tissulaire par différenciation des cellules pour les deux périodes de 7 et 21-28 jours pour tous les matériaux utilisés.<p>Résultats<p>A. Microscopie optique :<p>1. La pulpotomie :les biomatériaux provoquent moins d’infiltrat de cellules inflammatoires au niveau du tissu pulpaire et favorisent la déposition dentinaire.<p>2. Le coiffage direct :on obtient les mêmes résultats que dans le cadre de la pulpotomie.<p>B. Microscopie électronique en transmission :<p>1. L’induction du tissu calcifié ou la formation de néo-dentine s’est seulement produite au niveau du site de l’exposition après le placement des biomatériaux dans les 2 types du traitement (pulpotomie & coiffage direct). En revanche aucune formation du tissu calcifié n’a été observée dans le parenchyme pulpaire à distance du site de l’exposition.<p>2. Cet examen montre que les cellules en contact des biomatériaux ou même à proximité de ces derniers présentent un réticulum endoplasmique élargi parallèle à la longueur de la cellule. Des mitochondries, plusieurs appareils de Golgi et des éléments denses sont observés dans le cytoplasme cellulaire.<p>3. Cet examen a également montré que le MTA et le WPC, considérés par la littérature dentaire comme non-résorbables, sont phagocytés par les cellules histiocytaires.<p>C. Voie de signalisation de Notch :<p>Nos recherches n’ont pas montré de marquage concluant pour aucun de matériaux sauf dans le cadre de coiffage direct pour les dents traitées au MTA et Ca(OH)2 pour la période de 7 jours. Par contre, aucun marquage n’est observé après 21-28 jours. / Doctorat en Sciences dentaires / info:eu-repo/semantics/nonPublished