Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasilia, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-20T17:24:39Z No. of bitstreams: 1 2016_TérciaMariaMendesLousadeCastro.pdf: 1880406 bytes, checksum: b33123ff9110a930e70300103d154ae4 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-05-26T16:15:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_TérciaMariaMendesLousadeCastro.pdf: 1880406 bytes, checksum: b33123ff9110a930e70300103d154ae4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-26T16:15:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_TérciaMariaMendesLousadeCastro.pdf: 1880406 bytes, checksum: b33123ff9110a930e70300103d154ae4 (MD5) / A análise de amostras citológicas é um procedimento de rotina no diagnóstico e seguimento de pacientes com cânceres de baixa incidência e nos de elevada incidência e nos cânceres e morbimortalidade. “Cell block” consiste em uma forma de preparação citológica na qual o precipitado da amostra centrifugada é incluído em parafina e submetido a processamento histológico habitual. Apesar do “cell block” ser considerado um método diagnóstico de grande aplicabilidade na rotina diagnóstica, os estudos que utilizam essa técnica são escassos, com pequeno número de amostras e há variação na descrição dos diferentes métodos de preparo. Além disso, não está bem estabelecida a indicação de cada método, de acordo com os diferentes tipos e aspectos das amostras citológicas. Portanto, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a aplicabilidade do método “plasma-tromboplastina” no preparo de “cell block” de 299 amostras citológicas (líquido pleural, ascíticoe pericárdico, lavados peritoneal e broncoalveolar, líquor, urina e aspirados de lesões císticas) no laboratório de Anatomia Patológica do HUB da UnB. Citocentrifugado, “cell block” e imunocitoquímica foram preparados para cada amostra citológica. O método “plasma-tromboplastina” para preparo do “cell block” foi aplicável, tecnicamente, em amostras sem sedimento ou com pequena quantidade de sedimento e em outras com sedimento de sangue, correspondendo a 88,3% (264/299) delas. As amostras com grande quantidade de sedimento e com anticoagulante, 11,7% (35/299) foram preparadas pelo método “ágar”. Celularidade e distribuição celular adequadas com preservação da morfologia dos agrupamentos e das células foram observadas nas amostras preparadas pelos métodos “plasma-tromboplastina” e “ágar”. O padrão de marcação imunocitoquímica foi semelhante ao geralmente observado em citocentrifugados. Foi observada concordância em 96,9% (290/299), kappa =0,88 (positivo e negativo para malignidade) entre os diagnósticos do “cell block” e do citocentrifugado. O método “plasma-tromboplastina” se aplica na rotina diagnóstica do laboratório de Anatomia Patológica por ser um método tecnicamente viável. A concordância elevada entre o citocentrifugado e o “cell block” preparado pelo método “plasma-tromboplastina” para o diagnóstico de câncer e, principalmente, a detecção de câncer apenas no “cell block” em algumas amostras sugere que o método pode diminuir os resultados falsos-negativos do citocentrifugado. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The cytological analysis is a routine procedure in the diagnosis and management of patients with high incidence and mortality cancers. "Cell block" consists of a form of cytological preparation in which the precipitate of the centrifuged sample is embedded in paraffin and subjected to the usual histological processing. Despite the "cell block" be considered a diagnostic method of wide applicability in routine practice, studies using this technique are scarce, with small numbers of samples and there is variation in the description of the different methods of preparation. Moreover, the indication of each method according to the different types and aspects of cytological samples is not well established. Thus, the aim of this study was to evaluate the applicability of the "plasma-thromboplastin" method in the preparation of "cell block" of cytological samples (pleural effusion, ascites, pericardial fluid, peritoneal and bronchoalveolar lavage, cerebrospinal fluid, urine and aspirated cystic lesions) in the laboratory of Pathological Anatomy of HUB. Conventional cytological smear, "cell block" and immunocytochemistry were prepared for each cytological sample. The "plasma-thromboplastin" method to prepare the "cell block" was applicable, technically, in samples without sediment or small amount of sediment and in sample with sediment of blood, corresponding to 88.3% (264/299) of the samples. Samples with large amount of sediment and anticoagulant, 11.7% (35/299) were prepared by the "agar" method. Adequate cellularity and cellular distribution with preservation of the morphology of groups and cells were observed in the samples prepared by "plasma-thromboplastin" and "agar" methods. The immunocytochemical staining pattern was similar to that usually observed in conventional cytological smears. Agreement was observed in 96.9% (290/299), kappa = 0.88 (positive and negative for malignancy) between the diagnoses of "cell block" and conventional cytological smears. The "plasma-thromboplastin" method is applicable for the routine diagnosis Pathology laboratory to be a viable method technically. The high correlation between conventional cytological smears and "cell block" prepared by the "plasma-thromboplastin" method for diagnosis of cancer and the cancer detection only in the "cell block" in some samples suggests that the method may decrease the false-negatives results of the conventional cytological smears.

Afecções do sistema respiratório estão entre as mais frequentes em equinos, sendo uma das principais causas de baixo desempenho em animais atletas. Dentre essas doenças pode-se citar as afecções inflamatórias das vias aéreas, que apresentam uma prevalência considerável e afetam a saúde e vida atlética do animal. Um dos principais meios de atuação terapêutica no tratamento dessas doenças é a administração de medicamentos corticoides, sendo a dexametasona um dos principais fármacos dessa classe utilizados na medicina equina. No tratamento de doenças semelhantes em humanos preconiza-se a administração dos fármacos por via inalatória, otimizando assim o seu efeito terapêutico e diminuindo os efeitos colaterais. Em equinos existem trabalhos que mostram a deposição pulmonar de medicamentos quando administrados por via inalatória, no entanto, não foram encontrados estudos nesse sentido utilizando a dexametasona. O objetivo desse estudo foi avaliar a deposição pulmonar de dexametasona quando administrada por via inalatória em equinos, bem como fatores que possam interferir no seu nível de deposição e a concentração plasmática do fármaco quando administrada por essa via. Para isso foram utilizados seis equinos que foram submetidos à inalação com dexametasona duas vezes, cada uma utilizando um veículo diferente (aquoso ou oleoso) na formulação do fármaco, e quatro animais foram utilizados para o grupo controle, sendo submetidos à inalação somente com o veículo. Após cada inalação foi realizado um lavado broncoalveolar (LAB) e coletas sanguíneas seriadas para quantificação da dexametasona. Após a inalação o fármaco foi identificado nas amostras de LAB dos animais nos grupos tratados. Não houve diferença significativa entre os veículos utilizados e houve diferença entre os animais agitados e os animais calmos, sendo que os primeiros apresentaram uma concentração significativamente maior de dexametasona no LAB. O fármaco não foi identificado no plasma dos animais. A dexametasona quando administrada via nebulização pneumática atinge a região de bronquíolos e alvéolos respiratórios em equinos, principalmente os de comportamento agitado, e não atinge níveis plasmáticos significativos / Disorders of the respiratory system are among the most frequent deseases in horses and one of the main causes of low performance in athletic animals. Inflammatory diseases of the airways should be mentioned due to its considerable prevalence and to affect the health and athletic life of the animal. One of the main ways of therapeutic action of these diseases is the administration of corticosteroid drugs, being dexamethasone one of the main drugs used in equine medicine. In the treatment of similar diseases in humans it is recommended the administration of drugs by inhalation, which optimizes its therapeutic effect and reduces side effects. In horses, there are studies that show the pulmonary deposition of drugs when administered by inhalation, however, there are no studies using dexamethasone. The aim of this study was to evaluate the pulmonary deposition of dexamethasone when administered by inhalation in horses, as well as factors that may interfere with their level of deposition and the plasma concentration of the drug when administered by inhalation. To that, it was used six horses that were submitted to inhalation of dexamethasone twice, each one using a different vehicle (aqueous or oily) in the drug formulation, and four animals were used as control group, being submmited to inhalation just with the vehicle. After each inhalation a bronchoalveolar lavage (BAL) and serial blood collections for quantification of dexamethasone were performed. After the inhalation, the drug was identified in BAL samples from the animals of the treated groups. There was no significant difference between the vehicles used and there was difference between the agitated animals and calm animals, and the first ones had a significantly higher concentration of dexamethasone in the BAL. The drug was not identified in the plasma of animals. Dexamethasone, when administered via nebulization air, reaches the bronchioles region and respiratory alveoli in horses, especially the agitated behavior ones, and it does not affects plasma levels

Afecções do sistema respiratório estão entre as mais frequentes em equinos, sendo uma das principais causas de baixo desempenho em animais atletas. Dentre essas doenças pode-se citar as afecções inflamatórias das vias aéreas, que apresentam uma prevalência considerável e afetam a saúde e vida atlética do animal. Um dos principais meios de atuação terapêutica no tratamento dessas doenças é a administração de medicamentos corticoides, sendo a dexametasona um dos principais fármacos dessa classe utilizados na medicina equina. No tratamento de doenças semelhantes em humanos preconiza-se a administração dos fármacos por via inalatória, otimizando assim o seu efeito terapêutico e diminuindo os efeitos colaterais. Em equinos existem trabalhos que mostram a deposição pulmonar de medicamentos quando administrados por via inalatória, no entanto, não foram encontrados estudos nesse sentido utilizando a dexametasona. O objetivo desse estudo foi avaliar a deposição pulmonar de dexametasona quando administrada por via inalatória em equinos, bem como fatores que possam interferir no seu nível de deposição e a concentração plasmática do fármaco quando administrada por essa via. Para isso foram utilizados seis equinos que foram submetidos à inalação com dexametasona duas vezes, cada uma utilizando um veículo diferente (aquoso ou oleoso) na formulação do fármaco, e quatro animais foram utilizados para o grupo controle, sendo submetidos à inalação somente com o veículo. Após cada inalação foi realizado um lavado broncoalveolar (LAB) e coletas sanguíneas seriadas para quantificação da dexametasona. Após a inalação o fármaco foi identificado nas amostras de LAB dos animais nos grupos tratados. Não houve diferença significativa entre os veículos utilizados e houve diferença entre os animais agitados e os animais calmos, sendo que os primeiros apresentaram uma concentração significativamente maior de dexametasona no LAB. O fármaco não foi identificado no plasma dos animais. A dexametasona quando administrada via nebulização pneumática atinge a região de bronquíolos e alvéolos respiratórios em equinos, principalmente os de comportamento agitado, e não atinge níveis plasmáticos significativos / Disorders of the respiratory system are among the most frequent deseases in horses and one of the main causes of low performance in athletic animals. Inflammatory diseases of the airways should be mentioned due to its considerable prevalence and to affect the health and athletic life of the animal. One of the main ways of therapeutic action of these diseases is the administration of corticosteroid drugs, being dexamethasone one of the main drugs used in equine medicine. In the treatment of similar diseases in humans it is recommended the administration of drugs by inhalation, which optimizes its therapeutic effect and reduces side effects. In horses, there are studies that show the pulmonary deposition of drugs when administered by inhalation, however, there are no studies using dexamethasone. The aim of this study was to evaluate the pulmonary deposition of dexamethasone when administered by inhalation in horses, as well as factors that may interfere with their level of deposition and the plasma concentration of the drug when administered by inhalation. To that, it was used six horses that were submitted to inhalation of dexamethasone twice, each one using a different vehicle (aqueous or oily) in the drug formulation, and four animals were used as control group, being submmited to inhalation just with the vehicle. After each inhalation a bronchoalveolar lavage (BAL) and serial blood collections for quantification of dexamethasone were performed. After the inhalation, the drug was identified in BAL samples from the animals of the treated groups. There was no significant difference between the vehicles used and there was difference between the agitated animals and calm animals, and the first ones had a significantly higher concentration of dexamethasone in the BAL. The drug was not identified in the plasma of animals. Dexamethasone, when administered via nebulization air, reaches the bronchioles region and respiratory alveoli in horses, especially the agitated behavior ones, and it does not affects plasma levels

A Mannheimia haemolytica é uma importante bactéria relacionada ao Complexo Doença Respiratória dos Bovinos e a essa atribui-se uma evolução para uma forma grave de pneumonia fibrinonecrótica. É considerada um habitante comensal da nasofaringe que em situações de comprometimento da resposta imune adquire um perfil oportunista. O presente estudo buscou observar por meio de modelo de infecção experimental, as possíveis alterações locais e sistêmicas causadas pela M. haemolytica em bezerros experimentalmente inoculados. Dessa forma seria possível de maneira longitudinal, acompanhar a dinâmica dos principais aspectos de defesa das vias aéreas posteriores durante a infecção e após o tratamento com o antimicrobiano norfloxacina associado ou não à flunexina meglumina. Avaliou-se por exame físico acrescido de broncoscopia, alterações funcionais das células de defesa e mediadores inflamatórios, tanto séricos quanto locais e a atividade in vitro da norfloxacina sobre a função dos fagócitos sanguíneos e do lavado broncoalveolar (LBA). Para tal foram utilizados 12 bezerros sadios que foram experimentalmente infectados por M. haemolytica dos quais foram avaliadas as alterações clínicas e, quantitativamente e funcionalmente, as populações leucocitárias no sangue e no LBA, assim como o efeito da norfloxacina sobre a atividade funcional dos fagócitos no sangue e no LBA. Os resultados do presente estudo demonstraram o sucesso da infecção experimental por M. haemolytica pelos achados clínicos, broncoscópicos e citológicos. Ademais, a infecção experimental por M. haemolytica foi associada a alterações nas subpopulações de linfócitos T CD8+ e уδ, na produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ERO), fagocitose e viabilidade pelas células CD14+ sanguíneas e do LBA e granulócitos do sangue e, expressão de L-selectina pelos leucócitos polimorfonucleares do sangue. Nenhuma alteração evidente foi observada na expressão de citocinas IL-1β, IL-8 e TNF-α nas células sanguíneas e do LBA. O tratamento com antimicrobiano associado ou não ao anti-inflamatório foi capaz de curar a infecção e reestabelecer os parâmetros avaliados à sua condição basal. Portanto, não se observou benefícios com a utilização adicional do anti-inflamatório no reestabelecimento do quadro clínico e da resposta imune neste experimento. Contudo, apesar de algumas alterações na resposta sistêmica durante o quadro infeccioso, as alterações locais foram mais perceptíveis. Outro aspecto importante encontrado foi o efeito in vitro da norfloxacina na produção intracelular de ERO, fagocitose bacteriana pelas células CD14+ sanguíneas e do LBA e em leucócitos polimorfonucleares no sangue. Conclui-se que as alterações funcionais dos fagócitos apresentaram papel importante na patogenia da mannheimiose, que foram condizentes com os achados clínicos da mannheimiose e da evolução do tratamento quando realizado no início do processo nosológico. / Mannheimia haemolytica is an important bacterial pathogen associated with Bovine Respiratory Disease Complex (BRDC) and it is believed to be the predominant cause of the disease’s evolution into a fibrinonecrotic pneumonia. A commensal inhabitant of the nasopharynx, M. haemolytica acts as an opportunist when host defenses are compromised. This study used an experimental infection model to investigate the possible local and systemic changes caused by M. haemolytica in inoculated calves. It sought to linearly follow the dynamics of the lower respiratory tract defense mechanisms, during the course of infection and after treatment with the antibacterial norfloxacin, which was administrated both with and without the anti-inflammatory flunixin meglumine. With clinical examination followed by bronchoscopy, this study evaluated the physiological modifications in defense cells and mediators of inflammation, and the in vitro influence of norfloxacin on phagocytes from the peripheral blood and Bronchoalveolar Lavage Fluid (BLF). Twelve (12) healthy calves were infected with M. haemolytica and posteriorly physically examined, and had samples of white cells from the peripheral blood and BLF analyzed for changes in count and physiology, further, the norfloxacin effect on phagocytes from the peripheral blood and BLF was also studied. The experimental infection proved itself to be successful based on clinical, bronchoscopic and cytological findings. Furthermore, the M. haemolytica experimental infection was associated with modifications in the subpopulations of lymphocytes CD8+ and уδ T cells, in intracellular production of Reactive Oxygen Species (ROS), viability and phagocytosis activity of CD14+ cells from the peripheral blood and BLF and granulocytes from the peripheral blood. No obvious change was observed in the expression of cytokines IL-1β, IL-8 e TNF-α by cells from the peripheral blood or BLF. The treatment with the antibacterial agent, with or without the anti-inflammatory, was proved to be successful in curing the disease, thus, the addition of an anti-inflammatory was considered unnecessary to revert the clinical infection and in the immune response. Although there was a systemic response during the course of infection, the local response was more noticeable. Another key finding of the present study was the in vitro effect of norfloxacin on the intracellular production of ROS and on phagocytosis activity of CD14+ cells from the peripheral blood and BLF and granulocytes from the peripheral blood. In conclusion, the functional changes in phagocytes play an important role in the pathogenesis of pulmonary infection caused by M. haemolytica, as they were consistent with the clinical findings of mannheimiosis and with the treatment when it was administrated in the beginning of the infection.

Objetivou-se caracterizar clinicamente a Doença Inflamatória de Vias Aéreas (DIVA) assim como verificar o comportamento da atividade dos macrófagos alveolares destes animais. Utilizaram-se 17 eqüinos adultos machos e fêmeas, com idade variando entre 11 e 24 anos, sendo oito do Regimento Escola de Cavalaria Andrade Neves (grupo Controle) e nove da Polícia Militar do Rio de Janeiro (grupo Doente, com DIVA). Estes animais não apresentavam história pregressa recente (dois meses) compatível com doença respiratória, nesse período não foram submetidos a nenhum tipo de tratamento e apresentavam resultados de leucogramas e determinações de fibrinogênio plasmático dentro da normalidade. Realizaram-se exames físicos, endoscópicos, mensurações da diferença de pressão intrapleural máxima (Ventigrafia), e citologia broncoalveolar. Para o grupo Controle os animais foram selecionados levando-se em conta os resultados de normalidade nos exames executados. O grupo Doente foi selecionado considerando-se achados de anormalidade compatíveis com alterações inflamatórias pulmonares no mínimo em dois exames, sendo obrigatórios os exames endoscópicos e de citologia broncoalveolar. Para a avaliação da atividade macrofágica, macrófagos alveolares obtidos através de lavagem broncoalveolar foram cultivados a 37ºC em atmosfera de 7% CO2, aderidos em lamínulas de vidro estéril, de 13 mm de diâmetro em placas de 24 poços contendo 300 µL de RPMI 1640 enriquecido com 10% de Soro Fetal Bovino inativado pelo calor. Realizaram-se testes de fagocitose de Zymosan (por uma hora) e de interação com Promastigotas de Leishmania braziliensis cepa 3456 (por uma até 48 horas pós infecção). A análise das funções vitais e das mensurações da diferença de pressão intrapleural máxima revelou, ainda que dentro de valores fisiológicos, diferenças significativas apenas para a temperatura corpórea e freqüência cardíaca. Para os achados do exame do exame físico, não foi detectada diferença estatística entre os grupos. Com relação ao lavado broncoalveolar, o grupo Doente apresentou aumento na contagem celular total, moderado aumento na porcentagem de neutrófilos, discreta redução na porcentagem de macrófagos, porém com aumento no número de macrófagos espumosos e de células epiteliais além de discreto aumento na porcentagem de eosinófilos. Não observou-se diferença, entre os grupos, na capacidade fagocítica com relação ao Zymosan. Porém, uma diferença significativa na capacidade fagocítica após uma hora de interação e redução do índice de sobrevivência de L. braziliensis após 48 horas de cultivo no grupo Doente foi observada. Os resultados demonstraram que a DIVA nos animais de policiamento apresentou caráter assintomático e que os macrófagos alveolares provenientes destes animais, quando comparados aos do grupo Controle, não apresentaram alteração em sua capacidade fagocítica para Zymosan, mas sim para L. braziliensis e um maior estado de ativação, caracterizado pela maior redução no índice de sobrevivência deste parasita após 48 horas de cultivo. / The objectives were to characterize clinically the inflammatory airway disease (IAD), as well as to verify the behavior of the alveolar macrophages activity in the horses. Seventeen adult horses, from both sexes, from 11 to 24 years old, were used, eight from the Regimento Escola de Cavalaria Andrade Neves (Control group) and nine from the Polícia Militar do Rio de Janeiro (Diseased group, with IAD). These animals did not present recente previous history (two months) compatible with respiratory disease. In this period the horses did not undergo any kind of treatment and presented leucogram and plasmatic fibrinogen determination results under normality. Physical and endoscopic examination, measurement of the maximal intrapleural pressure (Ventigraphy) and bronchoalveolar cytology were done. For the Control group, the animals were selected considering the normal results of the exams. The Diseased group was selected considering abnormal findings compatible with inflammatory pulmonary alterations at least in two exams, obligatory the endoscopic examination and bronchoalveolar cytology. To evaluate the macrophagic activity, alveolar macrophages obtained through bronchoalveolar lavage were cultured under 37oC in a 7% CO2 atmosphere, adhered to 13 mm diameter sterile glass cover slips , in 24 wells polystyrene plates containing 300µL of RPMI 1640 enriched with 10% Foetal Calf Serum inactivated by heat. Assays for phagocytosis of Zymosan (for 1h) and for promastigotes of Leishmania braziliensis strain 3456 binding (for one until 48 hours post-infection) were done. The vital functions and the measurement of the maximal intrapleural pressure measurement analyses showed, even under physiological values, significant differences for body temperature and heart rate. There was not statistical difference between the groups for the physical examination findings. In relation to the bronchoalveolar lavage, the Diseased group presented an increase in total cell count, a moderate increase in neutrophil percentage, a discrete reduction in macrophage percentage, but with a higher number of foamy macrophages and epithelial cells, and also a discrete increase of eosinophil percentage. It was not observed any difference between groups in the phagocytic capability in relation to Zymosan. However, a significant difference in the phagocytic capability after one hour interaction and a reduction of the survival index of L. braziliensis after 48 hours of culture in the Diseased group was observed. The results demonstrated that IAD in the police horses presented an asymptomatic characterization and that the alveolar macrophages from these horses, when compared to the Control group, did not present alteration in their phagocytic capacity for Zymosan, but did for L. braziliensis, and a greater activation status, characterized by a greater reduction of the survival index of L. braziliensis after 48 hours of culture.

As influências etárias do sistema imune de bezerros são descritas na primeira fase de vida desses animais e a hipótese de também ocorrerem ariações nos principais mecanismos de resposta inata do pulmão pode identificar períodos de maior suscetibilidade às principais doenças respiratórias que acometem os bezerros nesse período. Com a finalidade de minimizar os prejuízos econômicos associados às doenças respiratórias em bezerros, este estudo objetivou avaliar a dinâmica imunológica inata do sistema respiratório de bezerros sadios nos três primeiros meses de vida, no qual nove bezerros sadios foram acompanhados por três meses e submetidos a oito avaliações imunológicas. O material recuperado do lavado broncoalveolar colhido por broncoscopia foi submetido à avaliação funcional dos macrófagos alveolares utilizando as provas de fagocitose (SaPI e E.coli), burst oxidativo, quantificação de imunoglobulinas e expressão de CD14. Os dados foram avaliados pelo teste ANOVA oneway (unstacked) (paramétricos) e pelo teste Mann-Whitney (não paramétricos). Verificaramse alterações funcionais de fagócitos CD14+, que apesar de se manterem constantes em seus valores relativos durante todo o período, apresentou intensidade de fagocitose elevada pontual na terceira semana de vida e um aumento da fagocitose por mononucleares CD14+ aos 45 dias de idade com diminuição da intensidade da fagocitose por essas mesmas células a partir dessa idade. Conclui-se que a partir de 45 dias de vida os animais começam a montar uma resposta imune própria, porém pontual e que até os 90 dias não atingem a estabilidade necessária para atestar a conclusão do processo de maturação da resposta inata local. / The influences of age in calves\' immune system are described in their first phase of life. The hypothesis that variations occur in the main mechanisms of lung innate response can help to identify periods of greater susceptibility to the respiratory diseases that affect calves in the first stage of their life. With the purpose of minimizing the economic losses associated with respiratory disease in calves, this study aimed to evaluate the innate immune dynamics of the respiratory system of healthy calves in the first three months of life. Nine healthy calves were monitored for three months and eight immunologic evaluations were performed. Bronchoalveolar lavage samples were recovered by bronchoscopy. Then, the alveolar macrophages in samples were identified by protein expression of CD14 and undergone functional evaluation of phagocytosis (SAPI and E.coli) and oxidative burst. Immunoglobulin were also quantified in samples. Data was assessed by one-way ANOVA (unstacked) (parametric) and the Mann-Whitney test nonparametric). Functional alterations in phagocytes CD14 + were observed, and although their relative values were kept throughout the period, higher intensity of phagocytosis in the third week and increased phagocytosis by macrophages CD14 + at 45 days of life was observed. Decreased intensity of phagocytosis was observed after this age. It is concluded that from 45 days of life on, calves began to maintain their immune response, but until 90 days of life they did not achieve the stability to conclude the maturation of local innate response.

Objetivou-se caracterizar clinicamente a Doença Inflamatória de Vias Aéreas (DIVA) assim como verificar o comportamento da atividade dos macrófagos alveolares destes animais. Utilizaram-se 17 eqüinos adultos machos e fêmeas, com idade variando entre 11 e 24 anos, sendo oito do Regimento Escola de Cavalaria Andrade Neves (grupo Controle) e nove da Polícia Militar do Rio de Janeiro (grupo Doente, com DIVA). Estes animais não apresentavam história pregressa recente (dois meses) compatível com doença respiratória, nesse período não foram submetidos a nenhum tipo de tratamento e apresentavam resultados de leucogramas e determinações de fibrinogênio plasmático dentro da normalidade. Realizaram-se exames físicos, endoscópicos, mensurações da diferença de pressão intrapleural máxima (Ventigrafia), e citologia broncoalveolar. Para o grupo Controle os animais foram selecionados levando-se em conta os resultados de normalidade nos exames executados. O grupo Doente foi selecionado considerando-se achados de anormalidade compatíveis com alterações inflamatórias pulmonares no mínimo em dois exames, sendo obrigatórios os exames endoscópicos e de citologia broncoalveolar. Para a avaliação da atividade macrofágica, macrófagos alveolares obtidos através de lavagem broncoalveolar foram cultivados a 37ºC em atmosfera de 7% CO2, aderidos em lamínulas de vidro estéril, de 13 mm de diâmetro em placas de 24 poços contendo 300 µL de RPMI 1640 enriquecido com 10% de Soro Fetal Bovino inativado pelo calor. Realizaram-se testes de fagocitose de Zymosan (por uma hora) e de interação com Promastigotas de Leishmania braziliensis cepa 3456 (por uma até 48 horas pós infecção). A análise das funções vitais e das mensurações da diferença de pressão intrapleural máxima revelou, ainda que dentro de valores fisiológicos, diferenças significativas apenas para a temperatura corpórea e freqüência cardíaca. Para os achados do exame do exame físico, não foi detectada diferença estatística entre os grupos. Com relação ao lavado broncoalveolar, o grupo Doente apresentou aumento na contagem celular total, moderado aumento na porcentagem de neutrófilos, discreta redução na porcentagem de macrófagos, porém com aumento no número de macrófagos espumosos e de células epiteliais além de discreto aumento na porcentagem de eosinófilos. Não observou-se diferença, entre os grupos, na capacidade fagocítica com relação ao Zymosan. Porém, uma diferença significativa na capacidade fagocítica após uma hora de interação e redução do índice de sobrevivência de L. braziliensis após 48 horas de cultivo no grupo Doente foi observada. Os resultados demonstraram que a DIVA nos animais de policiamento apresentou caráter assintomático e que os macrófagos alveolares provenientes destes animais, quando comparados aos do grupo Controle, não apresentaram alteração em sua capacidade fagocítica para Zymosan, mas sim para L. braziliensis e um maior estado de ativação, caracterizado pela maior redução no índice de sobrevivência deste parasita após 48 horas de cultivo. / The objectives were to characterize clinically the inflammatory airway disease (IAD), as well as to verify the behavior of the alveolar macrophages activity in the horses. Seventeen adult horses, from both sexes, from 11 to 24 years old, were used, eight from the Regimento Escola de Cavalaria Andrade Neves (Control group) and nine from the Polícia Militar do Rio de Janeiro (Diseased group, with IAD). These animals did not present recente previous history (two months) compatible with respiratory disease. In this period the horses did not undergo any kind of treatment and presented leucogram and plasmatic fibrinogen determination results under normality. Physical and endoscopic examination, measurement of the maximal intrapleural pressure (Ventigraphy) and bronchoalveolar cytology were done. For the Control group, the animals were selected considering the normal results of the exams. The Diseased group was selected considering abnormal findings compatible with inflammatory pulmonary alterations at least in two exams, obligatory the endoscopic examination and bronchoalveolar cytology. To evaluate the macrophagic activity, alveolar macrophages obtained through bronchoalveolar lavage were cultured under 37oC in a 7% CO2 atmosphere, adhered to 13 mm diameter sterile glass cover slips , in 24 wells polystyrene plates containing 300µL of RPMI 1640 enriched with 10% Foetal Calf Serum inactivated by heat. Assays for phagocytosis of Zymosan (for 1h) and for promastigotes of Leishmania braziliensis strain 3456 binding (for one until 48 hours post-infection) were done. The vital functions and the measurement of the maximal intrapleural pressure measurement analyses showed, even under physiological values, significant differences for body temperature and heart rate. There was not statistical difference between the groups for the physical examination findings. In relation to the bronchoalveolar lavage, the Diseased group presented an increase in total cell count, a moderate increase in neutrophil percentage, a discrete reduction in macrophage percentage, but with a higher number of foamy macrophages and epithelial cells, and also a discrete increase of eosinophil percentage. It was not observed any difference between groups in the phagocytic capability in relation to Zymosan. However, a significant difference in the phagocytic capability after one hour interaction and a reduction of the survival index of L. braziliensis after 48 hours of culture in the Diseased group was observed. The results demonstrated that IAD in the police horses presented an asymptomatic characterization and that the alveolar macrophages from these horses, when compared to the Control group, did not present alteration in their phagocytic capacity for Zymosan, but did for L. braziliensis, and a greater activation status, characterized by a greater reduction of the survival index of L. braziliensis after 48 hours of culture.

As influências etárias do sistema imune de bezerros são descritas na primeira fase de vida desses animais e a hipótese de também ocorrerem ariações nos principais mecanismos de resposta inata do pulmão pode identificar períodos de maior suscetibilidade às principais doenças respiratórias que acometem os bezerros nesse período. Com a finalidade de minimizar os prejuízos econômicos associados às doenças respiratórias em bezerros, este estudo objetivou avaliar a dinâmica imunológica inata do sistema respiratório de bezerros sadios nos três primeiros meses de vida, no qual nove bezerros sadios foram acompanhados por três meses e submetidos a oito avaliações imunológicas. O material recuperado do lavado broncoalveolar colhido por broncoscopia foi submetido à avaliação funcional dos macrófagos alveolares utilizando as provas de fagocitose (SaPI e E.coli), burst oxidativo, quantificação de imunoglobulinas e expressão de CD14. Os dados foram avaliados pelo teste ANOVA oneway (unstacked) (paramétricos) e pelo teste Mann-Whitney (não paramétricos). Verificaramse alterações funcionais de fagócitos CD14+, que apesar de se manterem constantes em seus valores relativos durante todo o período, apresentou intensidade de fagocitose elevada pontual na terceira semana de vida e um aumento da fagocitose por mononucleares CD14+ aos 45 dias de idade com diminuição da intensidade da fagocitose por essas mesmas células a partir dessa idade. Conclui-se que a partir de 45 dias de vida os animais começam a montar uma resposta imune própria, porém pontual e que até os 90 dias não atingem a estabilidade necessária para atestar a conclusão do processo de maturação da resposta inata local. / The influences of age in calves\' immune system are described in their first phase of life. The hypothesis that variations occur in the main mechanisms of lung innate response can help to identify periods of greater susceptibility to the respiratory diseases that affect calves in the first stage of their life. With the purpose of minimizing the economic losses associated with respiratory disease in calves, this study aimed to evaluate the innate immune dynamics of the respiratory system of healthy calves in the first three months of life. Nine healthy calves were monitored for three months and eight immunologic evaluations were performed. Bronchoalveolar lavage samples were recovered by bronchoscopy. Then, the alveolar macrophages in samples were identified by protein expression of CD14 and undergone functional evaluation of phagocytosis (SAPI and E.coli) and oxidative burst. Immunoglobulin were also quantified in samples. Data was assessed by one-way ANOVA (unstacked) (parametric) and the Mann-Whitney test nonparametric). Functional alterations in phagocytes CD14 + were observed, and although their relative values were kept throughout the period, higher intensity of phagocytosis in the third week and increased phagocytosis by macrophages CD14 + at 45 days of life was observed. Decreased intensity of phagocytosis was observed after this age. It is concluded that from 45 days of life on, calves began to maintain their immune response, but until 90 days of life they did not achieve the stability to conclude the maturation of local innate response.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-02-26T12:42:50Z No. of bitstreams: 1 Natalia Matos Souza Azevedo.pdf: 906173 bytes, checksum: 73fdd5b3cf4fd789d3cd4682d5322dbd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-26T12:42:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Natalia Matos Souza Azevedo.pdf: 906173 bytes, checksum: 73fdd5b3cf4fd789d3cd4682d5322dbd (MD5) Previous issue date: 2018-08-17 / In experiment number 01 it was analyzed the tracheal fluid of healthy horses submitted to a “vaquejada” simulation test through endoscopy and tracheal lavage (TL) and it was observed the cytological profile of these horses. In experiment number 02 were compared the TL and bronchoalveolar lavage (BAL) in horses submitted to a “vaquejada” simulation test to diagnose EIPH. Besides that, was determined through endoscopy the occurrence of the main respiratory diseases that affects “vaquejada” horses. It was used 21 pure and mixed quarter horses (pulling and supporting horses) of both sexes and with ages that varies between 4 and 15 years old. It was performed a clinical exam in all horses before the simulation test where it was measured the heart and respiratory rates, temperature, capillary refill time, intestinal motility and pulmonary auscultation. It was verified the average time for each animal to analyze the average speed and performed a blood sample collection for CBC and blood lactate in different moments (T0, T15, T30, T60). 5 races with the pulling and the supporting horses using a bull characterized the simulation. 30 to 60 minutes after the test, was performed the endoscopy, TL and BAL. The samples were sent to a lab where it was processed. In experiment 01 the average differential cell counting was 45,375 ± 8,255 epithelial cells; 0 goblets cells; 25 ± 9,59 neutrophils; 4,25 ± 1,013 lymphocytes; 0,25 ± 0,164 eosinophil; 11,5 ± 5,510 foamy macrophages; 5,875 ± 2,020 hemosiderophages; 0,87 ± 0,743 giant cells. All animals were clinically normal and there was no performance problems reported. According to the physical exam performed before the test, it was observed 46,5±4,732 beats per minute and 33,75±3,369 breaths per minute. During the test, the animals developed an average speed of 40,11 Km/h and no bleeding or nasal fluid was seen on the horses in an external exam. The quantity of saline solution acquired to do the TL was 18,875±0,639. There were no parameters difference between the pulling and the supporting horses (P>0,05). In experiment 02 none of the horses needed sedation to do the clinical or endoscopic exam. All animals showed clinically normal and there were no performance problems reported. According to the physical exam performed before the test, it was founded 40,86±2,42 beats per minute and 22,57±4,38 breaths per minute. After the test, no bleeding or nasal fluid was seen on the horses in an external exam. There were no differences in the average differential cell counting of the tracheal and bronchoalveolar aspirate between the studied groups. The endoscopic findings seen in horses 30 to 60 minutes after the test were: follicular hyperplasia in 9,5% of the horses, arytenoid granuloma in 4,8%, epiglottic chondritis in 23,8% of the horses in witch 9,5% was pulling horses and 14,28% was supporting horses; and laryngeal hemiplegia in 4,8% of the horses. Regarding the presence of tracheal fluid it was observed in 52,38% of the horses (11/21), in which 42,8% was pulling horses and 9,5% supporting horses, and that the EIPH occurred in 4,8% (1/21), which the horse was a supporting horse and the bleed was confirmed through endoscopy. The lactate levels and blood glucose levels was measured before and after exercise, showing the energy consumption and the athletic capacity of the horses. With these experiments we can conclude that the endoscopy and the TL cytology are fundamental tools to diagnose respiratory diseases, once the endoscopy shows functional disorders and the cytology allows visualization of the predominant cell type, identifying the existing pathology such as EIPH and IAD. Besides that, it was concluded that the “vaquejada” and the others speed tests are equestrian sports that induces the EIPH and that it is a pathological event related to a fail in the pulmonary capillaries or to pulmonary diseases. The endoscopic exam, the TL and BAL cytology are important tools to diagnose EIPH and the TL is as sensible as BAL and easier to be performed, detecting the predominant cell type in this disease even when the horse is negative to the endoscopic exam. / No experimento I objetivou-se analisar a secreção traqueal de cavalos sadios submetidos ao teste de simulação de vaquejada através de exame endoscópico e lavado traqueal e observar o perfil citológico desses cavalos. No experimento II objetivou-se comparar a eficiência do lavado traqueal (LT) e broncoalveolar (LBA) em cavalos submetidos ao teste de simulação de vaquejada para diagnóstico da Hemorragia Pulmonar Induzida por Esforço. Além disso, determinar via endoscópica a ocorrência das principais afecções respiratórias que acometem os cavalos de vaquejada. Foram utilizados 21 animais puros e mestiços da raça quarto de milha (esteira puxar) sem preferência por sexo com idade variando entre quatro e quinze. Foi realizado exame clínico de todos os animais antes da prova aferindo-se frequência cardíaca, respiratória, temperatura, tempo de perfusão capilar, motilidade intestinal e ausculta pulmonar. Foi verificado o tempo médio para cada animal para análise da velocidade média e realizado colheita sanguínea para hemograma e dosagem do lactato sanguíneo em diferentes tempos (T0, T15, T30, T60). A simulação da vaquejada foi caracterizada por 5 corridas com o cavalo de puxar e o esteira utilizando o boi. Decorridos 30 a 60 minutos da prova foi realizado o exame endoscópico e o lavado traqueal e broncoalveolar. O material coletado foi enviado ao laboratório onde foi processado e contagem celular. No experimento 01 A contagem diferencial média de células do aspirado traqueal foi de 45,37 ± 8,25 de células epiteliais; 0 de células caliciformes; 25 ± 9,59 de neutrófilos; 4,25 ± 1,01 de linfócitos; 0,25 ± 0,16 eosinófilos; 11,5 ± 5,51 de macrófagos espumosos; 5,87 ± 2,02 de hemossiderófagos e 0,87 ± 0,74 de células gigantes. Todos os animais apresentavam-se clinicamente normais e não havia nenhuma queixa de queda de performance. Segundo o exame físico realizado antes da prova observaram-se 46,5±4,73 batimentos cardíacos por minuto, 33,75±3,36 movimentos respiratórios por minuto. Durante a prova observou-se que os animais desenvolveram uma velocidade média de 40,11Km/h não foi observado em nenhum dos animais epistaxe ou secreção mucosa nasal ao exame externo. A quantidade de solução salina aspirada para a lavagem traqueal foi de 18,87±0,63ml. Não foram identificadas diferenças nos parâmetros analisados entre os cavalos de puxar e de esteira. (P>0,05). No experimento 02 nenhum dos animais necessitou de prévia sedação para o exame clínico e para o exame endoscópico. Todos os animais apresentavam-se clinicamente normais e não havia nenhuma queixa de queda de performance. Segundo o exame físico realizado antes da prova observaram-se 40,86±2,42 batimentos cardíacos por minuto, 22,57±4,38 movimentos respiratórios por minuto. Após a prova não foi observado em nenhum dos animais epistaxe ou secreção mucosa nasal ao exame externo. Não foi observada diferença na contagem diferencial média de células do aspirado traqueal e broncoalveolar nos diferentes grupos estudados. Os achados endoscópicos encontrados nos cavalos 30 a 60 minutos pós prova, no qual foi observado: hiperplasia folicular linfóide em 9,5% dos animais, granuloma aritenóide em 4,8%, condrite na epiglote em 23,8% dos quais 9,5% eram de puxar e 14,28% de esteira; e hemiplegia laringeana em 4,8% dos animais. Quanto a presença de secreção traqueal observou-se que ocorreu em 52,38% doa animais (11/21), destes 42,8% eram de puxar e 9,5% de esteira e que a hemorragia pulmonar ocorreu em 4,8% (1/21) sendo este de esteira confirmando via endoscópica a ocorrência de HPIE. Os valores de lactato (15,84±1,13 pré teste e 35,21±0,99 pós teste) e glicose (133,71±10,12 pré teste e 151,07±10,12 pós teste) sanguíneos antes e após o exercício, demonstrando o perfil de consumo energético bem como a capacidade atlética dos animais. Com a realização dos experimentos permite-se concluir que o exame endoscópico e a citologia do lavado traqueal são ferramentas fundamentais para o diagnóstico de afecções respiratórias, haja vista que a endoscopia permite identificar desordens funcionais e a citologia possibilita a visualização do tipo celular predominante permitindo identificar a patologia existente como HPIE ou IAD. Além disso conclui-se que a vaquejada e as provas de velocidade são esportes equestres que induzem hemorragia pulmonar e que a HPIE é provavelmente um evento patológico relacionado a falha nos capilares pulmonares ou doenças pulmonares. Ainda é permitido concluir que o exame endoscópico, a citologia do lavado traqueal e broncoalveolar são ferramentas importantes para diagnosticar a HPIE e que o LT é tão sensível quanto o LBA e de maior facilidade na execução para detectar o tipo celular predominante nessa afecção, mesmo quando o animal for negativo ao exame endoscópico.

A Mannheimia haemolytica é uma importante bactéria relacionada ao Complexo Doença Respiratória dos Bovinos e a essa atribui-se uma evolução para uma forma grave de pneumonia fibrinonecrótica. É considerada um habitante comensal da nasofaringe que em situações de comprometimento da resposta imune adquire um perfil oportunista. O presente estudo buscou observar por meio de modelo de infecção experimental, as possíveis alterações locais e sistêmicas causadas pela M. haemolytica em bezerros experimentalmente inoculados. Dessa forma seria possível de maneira longitudinal, acompanhar a dinâmica dos principais aspectos de defesa das vias aéreas posteriores durante a infecção e após o tratamento com o antimicrobiano norfloxacina associado ou não à flunexina meglumina. Avaliou-se por exame físico acrescido de broncoscopia, alterações funcionais das células de defesa e mediadores inflamatórios, tanto séricos quanto locais e a atividade in vitro da norfloxacina sobre a função dos fagócitos sanguíneos e do lavado broncoalveolar (LBA). Para tal foram utilizados 12 bezerros sadios que foram experimentalmente infectados por M. haemolytica dos quais foram avaliadas as alterações clínicas e, quantitativamente e funcionalmente, as populações leucocitárias no sangue e no LBA, assim como o efeito da norfloxacina sobre a atividade funcional dos fagócitos no sangue e no LBA. Os resultados do presente estudo demonstraram o sucesso da infecção experimental por M. haemolytica pelos achados clínicos, broncoscópicos e citológicos. Ademais, a infecção experimental por M. haemolytica foi associada a alterações nas subpopulações de linfócitos T CD8+ e уδ, na produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ERO), fagocitose e viabilidade pelas células CD14+ sanguíneas e do LBA e granulócitos do sangue e, expressão de L-selectina pelos leucócitos polimorfonucleares do sangue. Nenhuma alteração evidente foi observada na expressão de citocinas IL-1β, IL-8 e TNF-α nas células sanguíneas e do LBA. O tratamento com antimicrobiano associado ou não ao anti-inflamatório foi capaz de curar a infecção e reestabelecer os parâmetros avaliados à sua condição basal. Portanto, não se observou benefícios com a utilização adicional do anti-inflamatório no reestabelecimento do quadro clínico e da resposta imune neste experimento. Contudo, apesar de algumas alterações na resposta sistêmica durante o quadro infeccioso, as alterações locais foram mais perceptíveis. Outro aspecto importante encontrado foi o efeito in vitro da norfloxacina na produção intracelular de ERO, fagocitose bacteriana pelas células CD14+ sanguíneas e do LBA e em leucócitos polimorfonucleares no sangue. Conclui-se que as alterações funcionais dos fagócitos apresentaram papel importante na patogenia da mannheimiose, que foram condizentes com os achados clínicos da mannheimiose e da evolução do tratamento quando realizado no início do processo nosológico. / Mannheimia haemolytica is an important bacterial pathogen associated with Bovine Respiratory Disease Complex (BRDC) and it is believed to be the predominant cause of the disease’s evolution into a fibrinonecrotic pneumonia. A commensal inhabitant of the nasopharynx, M. haemolytica acts as an opportunist when host defenses are compromised. This study used an experimental infection model to investigate the possible local and systemic changes caused by M. haemolytica in inoculated calves. It sought to linearly follow the dynamics of the lower respiratory tract defense mechanisms, during the course of infection and after treatment with the antibacterial norfloxacin, which was administrated both with and without the anti-inflammatory flunixin meglumine. With clinical examination followed by bronchoscopy, this study evaluated the physiological modifications in defense cells and mediators of inflammation, and the in vitro influence of norfloxacin on phagocytes from the peripheral blood and Bronchoalveolar Lavage Fluid (BLF). Twelve (12) healthy calves were infected with M. haemolytica and posteriorly physically examined, and had samples of white cells from the peripheral blood and BLF analyzed for changes in count and physiology, further, the norfloxacin effect on phagocytes from the peripheral blood and BLF was also studied. The experimental infection proved itself to be successful based on clinical, bronchoscopic and cytological findings. Furthermore, the M. haemolytica experimental infection was associated with modifications in the subpopulations of lymphocytes CD8+ and уδ T cells, in intracellular production of Reactive Oxygen Species (ROS), viability and phagocytosis activity of CD14+ cells from the peripheral blood and BLF and granulocytes from the peripheral blood. No obvious change was observed in the expression of cytokines IL-1β, IL-8 e TNF-α by cells from the peripheral blood or BLF. The treatment with the antibacterial agent, with or without the anti-inflammatory, was proved to be successful in curing the disease, thus, the addition of an anti-inflammatory was considered unnecessary to revert the clinical infection and in the immune response. Although there was a systemic response during the course of infection, the local response was more noticeable. Another key finding of the present study was the in vitro effect of norfloxacin on the intracellular production of ROS and on phagocytosis activity of CD14+ cells from the peripheral blood and BLF and granulocytes from the peripheral blood. In conclusion, the functional changes in phagocytes play an important role in the pathogenesis of pulmonary infection caused by M. haemolytica, as they were consistent with the clinical findings of mannheimiosis and with the treatment when it was administrated in the beginning of the infection.