Nas Américas, em especial na América do Sul, a infecção por Leishmania (L.) infantum chagasi causa manifestações subclínicas e leishmaniose visceral (LV), a qual quando não tratada é potencialmente fatal. Na América Central, especialmente em Honduras, a leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica e a leishmaniose visceral são causadas pelo mesmo agente etiológico Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma região geográfica. Pouco se conhece sobre o perfil da infecção humana por Leishmania (L.) infantum chagasi em Honduras, especialmente sobre a forma não ulcerada ou atípica, sendo assim, no sentido de compreender melhor a patogênese da infecção causada por esta espécie de parasito no município de Amapala (Valle) e Orocuina (Choluteca), Honduras, o presente estudo visou a caracterização histopatológica e da resposta imune celular in situ em lesões de pacientes com leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica. Foram utilizadas 20 biópsias de pele de pacientes com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. A histopatologia foi avaliada em cortes histológicos corados por hematoxilina-eosina (HE) e a resposta imune por meio da reação de imunoistoquímica utilizando anticorpos primários para macrófagos (CD68), linfócitos T (CD4, CD8), células natural killer - NK (CD56), linfócitos B (CD20), óxido nítrico sintetase (NOS2) e interferon-gama (IFN-y. Microscopicamente as alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme superficial e profunda caracterizando-se por um infiltrado inflamatório predominantemente linfohistiocitário de intensidades variável com arranjo difuso e, por vezes, associado à formação de granulomas epitelioides. A observação de formas sugestivas do parasito ocorreu em apenas 55 % dos casos. A análise imunoistoquímica das lesões confirmou a presença de células mononucleares no infiltrado inflamatório caracterizada principalmente pela presença de linfócitos TCD8+, seguido por TCD4+, macrófagos, linfócitos B e células NK. A grande densidade de células INF-y+ e a presença da enzima iNOS, responsável pela produção de óxido nítrico, molécula com atividade leishmanicida, em quase a totalidade dos macrófagos do infiltrado inflamatório, sugere uma resposta imune local bastante efetiva, que colabora para o controle do número de parasitos e consequentemente a evolução do tamanho da lesão / In America, especially in South America, infection by Leishmania (L.) infantum chagasi causes subclinical manifestations and visceral leishmaniasis (VL), which when untreated is potentially fatal. In Central America, especially in Honduras, non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis are caused by the same etiologic agent Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographic region. Little is known about the profile of human infection by Leishmania (L.) infantum chagasi in Honduras, especially on the non-ulcerated or atypical form. In order to better understand the pathogenesis of the infection caused by this species of parasite in the municipality of Amapala (Valle) and Orocuina (Choluteca), Honduras, the present study aim the characterization of histopathological changes and cellular immune response in situ in lesions of patients with non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis. Twenty skin biopsies from patients with parasitological diagnosis confirmed by scraping of Giemsa-stained lesion and observed using an optical microscope. Histopathology, was evaluated by hematoxylin-eosin (HE) and the immunohistochemistry using the primary antibodies to macrophages (CD68), T lymphocytes (CD4, CD8), natural killer cells - NK (CD56), B lymphocytes CD20), nitric oxide synthase (NOS2) and interferon-gamma (IFN-y). Microscopically, the most significant histopathological changes were observed in the superficial and deep dermis, characterized by a predominantly lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensities with diffuse arrangement and sometimes associated with the formation of epithelioid granulomas; the observation of suggestive forms of the parasite occurred in only 55 % of the cases. The immunohistochemical analysis of the lesions confirmed the presence of mononuclear cells in the inflammatory infiltrate characterized mainly by the presence of T-CD8+ lymphocytes, followed by T-CD4+, macrophages, B lymphocytes and NK cells. The high density of INF-y+ cells and the presence of iNOS, enzyme responsible for the production of nitric oxide, molecule with activity leishmanicide, in almost all of the macrophages in the inflammatory infiltrate, suggest an effective local immune response that collaborate to the control in the number of parasites and consequently the evolution of the lesion

A leishmaniose é um termo global para doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, sendo a Leishmaniose Visceral (LV) a forma mais grave da doença. No Brasil é causada pelo parasita Leishmania (Leishmania) infantum chagasi. Para garantir a sua sobrevivência, alguns parasitas são capazes de manipular respostas de defesa das células do sistema imune. Recentes estudos demonstraram a participação da proteína imunomodulatória CD200 durante o processo de infecção de L. (L.) amazonenses. O presente estudo teve como objetivo investigar se os parasitos L. (L.) infantum chagasi são capazes de induzir a expressão da proteína CD200 durante o processo infeccioso. Em ensaios de infecção ex vivo, não foi observado proliferação de parasitas intracelulares. Apesar disso, L. (L.) infantum chagasi foi capaz de induzir a expressão do gene CD200. De maneira interessante, diferente de infecções por L. (L.) amazonenses, a indução de CD200 nessas células foi observada em tempos mais tardios de infecção. Ensaios de imunoprecipitação e Western blot indicaram a síntese da proteína, que atingiu os seus maiores níveis a 120 horas pós-infecção. A presença de CD200 sugere o envolvimento dessa molécula em tempos mais tardios de infecção por L. (L.) infantum chagasi. / Leishmaniasis is a global term for diseases caused by parasites of the genus Leishmania, and Visceral Leishmaniasis (VL) are the most severe form of the disease. In Brazil is caused by the parasite Leishmania (Leishmania) infantum chagasi. To ensure their survival, some parasites can handle defensive responses of the cells of the immune system. Recent studies have demonstrated the participation of immunomodulatory protein CD200 during the infection process of L. (L.) amazonenses. This study aimed to investigate whether the parasites L. (L.) infantum chagasi are capable of inducing the expression of CD200 protein during the infectious process. In trials of ex vivo infection, there was no proliferation of intracellular parasites. Nevertheless, L. (L.) infantum chagasi was able to induce the expression of CD200 gene. Interestingly, unlike infection by L. (L.) amazonenses, CD200 induction of these cells was observed at later times in infection. Immunoprecipitation assays and Western blot indicated protein synthesis, which reached their highest levels at 120 hours post-infection. The presence of CD200 suggests the involvement of this molecule at later times of infection with L. (L.) infantum chagasi.

Na América Central, em países como Honduras, El Salvador, Nicarágua e Costa Rica, tem sido descrito lesões cutâneas não ulceradas, designadas como leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica (LCNU) causadas por Leishmania (L.) infantum chagasi. Em Honduras, leishmaniose visceral e leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica são produzidas pelo mesmo agente etiológico, Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma área geográfica. A LCNU é a forma clínica mais comum, afetando principalmente crianças maiores de 5 anos e adultos jovens. A lesão é definida como uma pápula, nódulo indolor, não ulcerativo, eritematoso ou da cor da pele, na presença ou ausência de halo hipopigmentado. Tendo em vista que existe uma lacuna no conhecimento do padrão de resposta imunológica tecidual da leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, este trabalho visou avaliar a resposta imunológica inflamatória e regulatória in situ das lesões de pele. Foram utilizadas 20 biópsias de pele, com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. O estudo histopatológico foi avaliado em cortes histológicos corados com hematoxilina e eosina (HE) e o padrão da resposta imune inflamatória e regulatória por meio da reação de imuno-histoquímica utilizando marcadores para linfócito T (CD4 e CD8), T regulatório (FoxP3), e antígenos intracelulares como: IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 e IFN-y. As alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme e caracterizadas por um infiltrado inflamatório linfohistiocitário de intensidade variável e associado à formação de granulomas epitelioides. Já as alterações histopatológicas identificadas na epiderme mostraram-se mais leves e correspondem a leve adelgaçamento, leve acantose e exocitose focal linfohistiocitária. Em 55% dos casos, o parasitismo mostrou-se discreto. A análise imuno-histoquímica das lesões cutâneas dos pacientes com LCNU mostrou no infiltrado inflamatório a presença de todos os marcadores utilizados neste estudo, em especial de linfócitos T CD8+ e CD4+, e das citocinas inflamatórias IFN-y e IL-6. A participação de células FoxP3+, TGF-beta+ e IL-10+ foi discreta, assim como das células IL-17+. Os dados mostram uma participação maior da resposta inflamatória na leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, capaz de controlar o parasitismo e consequentemente a evolução do tamanho da lesão; porém, embora mais discreta, a resposta imune regulatória pode ser responsável para manter um balanço na resposta imune celular evitando danos teciduais e levando a baixa persistência parasitária no tecido, necessária para a manutenção de uma imunidade protetora e duradoura / Honduras: evaluation of the inflammatory and regulatory immune response in situ in skin lesions [dissertation]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo\"; 2017. In Central America, in countries such as Honduras, El Salvador, Nicaragua and Costa Rica, non-ulcerated skin lesions, designated as non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis (NUCL) caused by Leishmania (L.) infantum chagasi, has been reported. In Honduras, visceral leishmaniasis and non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis are caused by the same etiologic agent, Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographical area. NUCL is the most common clinical form, affecting mainly children older than 5 years and young adults. The lesion is defined as a papule, painless nodule, non-ulcerative, erythematous or skin color, in the presence or absence of hypopigmented halo. Considering that, there is a gap in the knowledge of the tissue immune response pattern of non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, this study aimed to evaluate the in situ inflammatory and regulatory immune response of skin lesions. Twenty skin biopsies with a confirmed parasitological diagnosis by scraping of lesion stained by Giemsa and observed under an optical microscope were used. The histopathological study was evaluated in histological sections stained with hematoxylin and eosin (HE) and the inflammatory and regulatory immune response through the immunohistochemistry reaction using T lymphocyte (CD4 and CD8), regulatory T (FoxP3) markers, and intracellular antigens such as IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 and IFN-y. The most significant histopathological changes were observed in the dermis, and they were characterized by a lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensity and associated to the formation of epithelioid granulomas. On the other hand, the histopathological changes identified in the epidermis were lighter and correspond to mild thinning, mild acanthosis and focal lymphohistiocytic exocytosis. In 55% of the cases, the parasitism was discreet. The immunohistochemistry analysis of the cutaneous lesions of patients with NUCL showed in the inflammatory infiltrate the presence of all the markers used in this study, especially CD8+ and CD4+ T lymphocytes, and the inflammatory cytokines IFN-y and IL-6. The participation of FoxP3+, TGF-beta+ and IL-10+ cells was discrete, as well as IL-17+ cells. The data show a higher participation of the inflammatory response in non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, able to control the tissue parasitism and consequently the evolution of the lesion size; however, although discreet, the regulatory immune response may be responsible for maintaining a balance in the cellular immune response avoiding tissue damage and leading to low tissue parasitic persistence necessary for the maintenance of a protective and lasting immunity

A leishmaniose é um termo global para doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, sendo a Leishmaniose Visceral (LV) a forma mais grave da doença. No Brasil é causada pelo parasita Leishmania (Leishmania) infantum chagasi. Para garantir a sua sobrevivência, alguns parasitas são capazes de manipular respostas de defesa das células do sistema imune. Recentes estudos demonstraram a participação da proteína imunomodulatória CD200 durante o processo de infecção de L. (L.) amazonenses. O presente estudo teve como objetivo investigar se os parasitos L. (L.) infantum chagasi são capazes de induzir a expressão da proteína CD200 durante o processo infeccioso. Em ensaios de infecção ex vivo, não foi observado proliferação de parasitas intracelulares. Apesar disso, L. (L.) infantum chagasi foi capaz de induzir a expressão do gene CD200. De maneira interessante, diferente de infecções por L. (L.) amazonenses, a indução de CD200 nessas células foi observada em tempos mais tardios de infecção. Ensaios de imunoprecipitação e Western blot indicaram a síntese da proteína, que atingiu os seus maiores níveis a 120 horas pós-infecção. A presença de CD200 sugere o envolvimento dessa molécula em tempos mais tardios de infecção por L. (L.) infantum chagasi. / Leishmaniasis is a global term for diseases caused by parasites of the genus Leishmania, and Visceral Leishmaniasis (VL) are the most severe form of the disease. In Brazil is caused by the parasite Leishmania (Leishmania) infantum chagasi. To ensure their survival, some parasites can handle defensive responses of the cells of the immune system. Recent studies have demonstrated the participation of immunomodulatory protein CD200 during the infection process of L. (L.) amazonenses. This study aimed to investigate whether the parasites L. (L.) infantum chagasi are capable of inducing the expression of CD200 protein during the infectious process. In trials of ex vivo infection, there was no proliferation of intracellular parasites. Nevertheless, L. (L.) infantum chagasi was able to induce the expression of CD200 gene. Interestingly, unlike infection by L. (L.) amazonenses, CD200 induction of these cells was observed at later times in infection. Immunoprecipitation assays and Western blot indicated protein synthesis, which reached their highest levels at 120 hours post-infection. The presence of CD200 suggests the involvement of this molecule at later times of infection with L. (L.) infantum chagasi.

Na América Central, em países como Honduras, El Salvador, Nicarágua e Costa Rica, tem sido descrito lesões cutâneas não ulceradas, designadas como leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica (LCNU) causadas por Leishmania (L.) infantum chagasi. Em Honduras, leishmaniose visceral e leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica são produzidas pelo mesmo agente etiológico, Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma área geográfica. A LCNU é a forma clínica mais comum, afetando principalmente crianças maiores de 5 anos e adultos jovens. A lesão é definida como uma pápula, nódulo indolor, não ulcerativo, eritematoso ou da cor da pele, na presença ou ausência de halo hipopigmentado. Tendo em vista que existe uma lacuna no conhecimento do padrão de resposta imunológica tecidual da leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, este trabalho visou avaliar a resposta imunológica inflamatória e regulatória in situ das lesões de pele. Foram utilizadas 20 biópsias de pele, com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. O estudo histopatológico foi avaliado em cortes histológicos corados com hematoxilina e eosina (HE) e o padrão da resposta imune inflamatória e regulatória por meio da reação de imuno-histoquímica utilizando marcadores para linfócito T (CD4 e CD8), T regulatório (FoxP3), e antígenos intracelulares como: IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 e IFN-y. As alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme e caracterizadas por um infiltrado inflamatório linfohistiocitário de intensidade variável e associado à formação de granulomas epitelioides. Já as alterações histopatológicas identificadas na epiderme mostraram-se mais leves e correspondem a leve adelgaçamento, leve acantose e exocitose focal linfohistiocitária. Em 55% dos casos, o parasitismo mostrou-se discreto. A análise imuno-histoquímica das lesões cutâneas dos pacientes com LCNU mostrou no infiltrado inflamatório a presença de todos os marcadores utilizados neste estudo, em especial de linfócitos T CD8+ e CD4+, e das citocinas inflamatórias IFN-y e IL-6. A participação de células FoxP3+, TGF-beta+ e IL-10+ foi discreta, assim como das células IL-17+. Os dados mostram uma participação maior da resposta inflamatória na leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, capaz de controlar o parasitismo e consequentemente a evolução do tamanho da lesão; porém, embora mais discreta, a resposta imune regulatória pode ser responsável para manter um balanço na resposta imune celular evitando danos teciduais e levando a baixa persistência parasitária no tecido, necessária para a manutenção de uma imunidade protetora e duradoura / Honduras: evaluation of the inflammatory and regulatory immune response in situ in skin lesions [dissertation]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo\"; 2017. In Central America, in countries such as Honduras, El Salvador, Nicaragua and Costa Rica, non-ulcerated skin lesions, designated as non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis (NUCL) caused by Leishmania (L.) infantum chagasi, has been reported. In Honduras, visceral leishmaniasis and non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis are caused by the same etiologic agent, Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographical area. NUCL is the most common clinical form, affecting mainly children older than 5 years and young adults. The lesion is defined as a papule, painless nodule, non-ulcerative, erythematous or skin color, in the presence or absence of hypopigmented halo. Considering that, there is a gap in the knowledge of the tissue immune response pattern of non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, this study aimed to evaluate the in situ inflammatory and regulatory immune response of skin lesions. Twenty skin biopsies with a confirmed parasitological diagnosis by scraping of lesion stained by Giemsa and observed under an optical microscope were used. The histopathological study was evaluated in histological sections stained with hematoxylin and eosin (HE) and the inflammatory and regulatory immune response through the immunohistochemistry reaction using T lymphocyte (CD4 and CD8), regulatory T (FoxP3) markers, and intracellular antigens such as IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 and IFN-y. The most significant histopathological changes were observed in the dermis, and they were characterized by a lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensity and associated to the formation of epithelioid granulomas. On the other hand, the histopathological changes identified in the epidermis were lighter and correspond to mild thinning, mild acanthosis and focal lymphohistiocytic exocytosis. In 55% of the cases, the parasitism was discreet. The immunohistochemistry analysis of the cutaneous lesions of patients with NUCL showed in the inflammatory infiltrate the presence of all the markers used in this study, especially CD8+ and CD4+ T lymphocytes, and the inflammatory cytokines IFN-y and IL-6. The participation of FoxP3+, TGF-beta+ and IL-10+ cells was discrete, as well as IL-17+ cells. The data show a higher participation of the inflammatory response in non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, able to control the tissue parasitism and consequently the evolution of the lesion size; however, although discreet, the regulatory immune response may be responsible for maintaining a balance in the cellular immune response avoiding tissue damage and leading to low tissue parasitic persistence necessary for the maintenance of a protective and lasting immunity

Leishmania are obligate intracellular protozoan parasites that are inoculated into human skin while a sand fly vector takes a blood meal with the resulting disease coined leishmaniasis. The twenty plus species of Leishmania known to cause human disease are found throughout tropical and subtropical regions of the world. Leishmaniasis affects at least eighty-eight countries with three hundred and fifty million people at risk for infection, resulting in an estimated seventy thousand deaths annually. Different species of Leishmania have developed distinct methods for host defense evasion, leading to a wide spectrum of pathologies within humans. Prior studies of macrophage infections with Leishmania have shown global changes in macrophage mRNA expression. We hypothesized miRNAs are important modifiers of mRNA changes during Leishmania infection. Analysis of miRNA expression patterns revealed that changes were detected primarily during macrophage infection with the low virulent logarithmically growing promastigotes. Profiling studies of mRNA and miRNA changes upon infection with promastigotes in logarithmic growth revealed a decrease in miR-200b and increase in miR-744 levels whereas infections with the highly virulent metacyclic promastigotes revealed a decrease in miR-708 levels. Furthermore, microarray studies revealed differences in macrophage mRNA levels between macrophages infected with the low virulent promastigotes verses the highly virulent promastigotes. Correlative studies between miRNA and mRNA changes suggested some of Leishmania induced changes in mRNA levels may be modified by miRNAs. The importance of Toll-like receptors (TLR) in detection of microbial products has been well-documented. Leishmania infection is known to initiate signaling through TLRs 2, 3, 4 and 9, of which TLRs 2, 4 and 9 signal through the adaptor molecule MyD88. We found that miR-200b, a microRNA decreased by infection of macrophages with the low virulent Leishmania promastigotes, regulates signaling through the TLR4 pathway by targeting and repressing MyD88 transcript levels. Furthermore, we have shown that MyD88 repression results in the decreased expression of the downstream effector molecules IL-6, CXCL9 and TNFΑ upon challenge with a TLR4 ligand. The suppression of miR-200b during Leishmania infection could serve to up-regulate inflammatory responses induced through TLR4 and other MyD88 dependent TLRs. This may be responsible, in part, for the decreased virulence of logarithmically growing compared to metacyclic promastigotes. Furthermore, low levels of inflammation may promote parasite survival by promoting the influx of inflammatory phagocytic cells to the site of infection in which the highly virulent parasites can survive. Microarray studies revealed a remarkable increase in expression of metallothionein (MT) transcripts in macrophages infected with low virulent promastigotes but not in macrophages infected with the highly virulent promastigotes. To explore a possible mechanistic role for metallothioneins in leishmaniasis, we used knock-out mice for MT-1 genes. Bone-marrow derived macrophages from MT-1 knock-out mice (MT-KO) generated higher levels of reactive oxygen species upon incubation with Leishmania promastigotes. Consistently, the initial ROS-induced killing of promastigotes, which occurs during the first hours of infection, was greater twenty-four hours after infection of MT-1 KO bone-marrow macrophages than in our wild type controls. Overall, data presented in this thesis documents changes to macrophage mRNA and miRNA expression patterns upon infection with Leishmania promastigotes that correspond to the overall parasite survival in the host macrophage.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-11-06T17:53:22Z No. of bitstreams: 1 Theo de Araújo Santos Corpusculos lipídios e eicosanoides nos momentos iniciais...pdf: 8310647 bytes, checksum: 79f3b7453e377fceaa874dda0b7901fe (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-06T17:53:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Theo de Araújo Santos Corpusculos lipídios e eicosanoides nos momentos iniciais...pdf: 8310647 bytes, checksum: 79f3b7453e377fceaa874dda0b7901fe (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Corpúsculos lipídicos são organelas citoplasmáticas envolvidas na produção de eicosanoides em leucócitos. Eicosanoides como as prostaglandinas têm sido envolvidos no controle da resposta inflamatória e imunológica. A saliva de Lutzomyia longipalpis participa do estabelecimento e desenvolvimento da doença pela modulação das respostas hemostática, imunológica e inflamatória do hospedeiro favorecendo a infecção. Entretanto, o papel dos eicosanoides nos momentos iniciais da infecção por Leishmania ainda não foi esclarecido, assim como a participação da saliva neste contexto. Aqui, nós investigamos o papel dos eicosanoides induzidos pela saliva de L. longipalpis e produzidos pela Leishmania infantum chagasi na infecção. O sonicado de glândula salivar (SGS) de L. longipalis induziu um aumento no número de CLs em macrófagos de maneira dose e tempo dependente, o qual esteve correlacionado com o aumento de PGE2 nos sobrenadante de cultura. As enzimas COX- 2 e PGE-sintase foram co-localizadas nos CLs induzidos pela saliva e a produção de PGE2 foi reduzida pelo tratamento com NS-398, um inibidor de COX-2. Nós verificamos que o SGS rapidamente estimulou a fosforilação de ERK-1/2 e PKC-α e a inibição farmacológica dessas vias inibiu a produção de PGE2 pelos macrófagos estimulados com SGS. Em seguida, nós avaliamos o efeito da saliva de L. longipalpis sobre a produção de eicosanoides durante a infecção por L. i. chagasi no modelo peritoneal murino. Nós observamos que a saliva aumentou a viabilidade intracelular de L. i. chagasi tanto em neutrófilos como em neutrófilos recrutados para a cavidade peritoneal. As células recrutadas para cavidade peritoneal apresentaram maiores níveis da relação PGE2/LTB4 e o pré-tratamento com NS-398 reverteu o efeito da saliva sobre a viabilidade intracelular dos parasitas. Parasitas como Leishmania são capazes de produzir PGs utilizando uma maquinaria enzimática própria. Neste estudo nós descrevemos a dinâmica de formação e a distribuição celular dos CLs em L. i. chagasi bem como a participação desta organela na produção de PGs. A quantidade de CLs aumentou durante a metaciclogênese assim como a expressão de PGF2α sintase (PGFS), sendo esta enzima co-localizada nos CLs. A adição de ácido araquidônico AA à cultura de L. i. chagasi aumentou a quantidade de CLs por parasita, bem como a secreção de PGF2α. A infecção com as diferentes formas de L. i. chagasi não foi capaz de estimular a formação de CLs na célula hospedeira. Por outro lado, os parasitas intracelulares apresentaram maiores quantidades de CLs. A infecção estimulou uma rápida expressão de COX-2, mas não foi detectado aumento na produção de PGF2α nos sobrenadantes. Por fim, nós verificamos a presença do receptor de PGF2α (FP) nos vacúolos parasitóforos de macrófagos infectados com L. i. chagasi. O prétratamento das células com um antagonista do receptor FP inibiu os índices de infecção de forma dose-dependente. Em conjunto, nossos dados apontam que os eicosanoides desempenham um papel crucial para evasão da resposta imune durante os momentos iniciais da infecção por L. i. chagasi com diferentes contribuições do parasita, do vetor e da célula hospedeira neste contexto. / Lipid bodies (LB) are cytoplasmic organelles involved in eicosanoid production in leukocytes. Eicosanoids as prostaglandins (PG) have been implicated in the inflammatory and immune response control. Sand fly saliva participates of the establishment and development of the disease by modulation of haemostatic, inflammatory and immunological response of the host favoring the infection. However, the role of eicosanoids in the early steps of the infection remains to be investigated as well as the role of the sand fly in this context. Herein, we investigated the role of eicosanoids trigged by L. longipalpis saliva and produced by Leishmania infantum chagasi during infection. L. longipalpis salivary gland sonicate (SGS) induced an increase of LB number in the macrophages of a dose and time dependent manner, which was correlated with an increase of PGE2 release in the culture supernatants. Furthermore, COX-2 and PGE-synthase co-localized within the LBs induced by L. longipalpis saliva and PGE2 production was abrogated by treatment with NS-398, a COX-2 inhibitor. We verified SGS rapidly triggered ERK-1/2 and PKC-α phosphorylation, and blockage of the ERK-1/2 and PKC-α pathways inhibited the SGS effect on PGE2 production by macrophages. Next, we evaluated the effect of the L. longipalpis saliva in the eicosanoid production during L. i. chagasi in the murine peritoneal model. We observed SGS increased parasite viability inside recruited monocytes and neutrophils. In this regarding, SGS-recruited cells to peritoneal cavity displayed an increase in the levels of PGE2/LTB4 and the pre-treatment with NS-398 abrogated the sand fly saliva effect on parasite viability. Parasites as Leishmania are capable to produce PGs using enzymatic machinery itself. Parasite LBs amounts increased during metacyclogensis as well as the PGF2α synthase (PGFS) expression and this enzyme was colocalized on LBs. Exogenous addition of aracdonic acid in the Leishmania cultures increased LB number per parasite and PGF2α release. Macrophage infection with different forms of L. i. chagasi was not able to stimulate LB formation in the host cell. Notwithstanding, Leishmania infection upregulated COX-2 expression but this was not followed by PGF2α release by macrophages. We detected PGF2α receptor (FP) on the Leishmania PV surface. In addition, the pre-treatment of the host cells with a selective antagonist of FP, dramatically hampered Leishmania infection in a dose dependent manner. In set, our data point out a crucial role for eicosanoids to immune response evasion during early steps of L. i. chagasi infection with different contributions of parasite, vector and host cells in this context.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-11-23T10:18:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7633540 bytes, checksum: 3c399a3be8e26ba7fd0b6e20c37ad4bc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-23T10:18:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7633540 bytes, checksum: 3c399a3be8e26ba7fd0b6e20c37ad4bc (MD5) Previous issue date: 2017-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Leishmania infantum chagasi é o agente etiológico da Leishmaniose Visceral, doença que afeta milhares de pessoas no mundo. O tratamento habitual é baseado em um repertório restrito de fármacos com toxicidade e custos elevados. O desenvolvimento de novas drogas é essencial para o controle e tratamento dessa enfermidade. No cenário atual, uma possibilidade para a descoberta de novos fármacos é o emprego de compostos químicos sintéticos. Neste contexto, nos propomos a avaliar a atividade leishmanicida dos compostos Triazólicos derivados de 6-hidroxiisobenzofuran-1(3H) -ona e de indan- 1,3-diona e de compostos derivados de Benzofenonas. Neste trabalho, realizamos o estudo in vitro da citotoxicidade destes compostos em macrófagos RAW 264.7, em formas promastigotas e em formas amastigotas de L. infantum chagasi internalizadas em macrófagos, utilizando metodologias convencionais, como a microscopia óptica, bem como implantação de uma nova metodologia utilizando citometria de fluxo. Após vários ensaios, os compostos derivados de Benzofenonas (AL-13, AL-16, AL-19 e B-5), cujas ações leishmanicidas se sobressaíram as demais, foram combinados em 11 diferentes associações. Estas foram testadas quanto à citotoxicidade em macrófagos e a ação leishmanicida em formas amastigotas internalizadas por macrófagos. Os resultados obtidos tanto pela microscopia óptica quanto pela citometria de fluxo apresentaram similaridades quanto à inibição da taxa de infecção em macrófagos infectados por L. infantum chagasi. Partindo deste pressuposto, nossos estudos sugerem que: 1) 3 (das 11 associações propostas) apresentam ação leishmanicida e merecem ser consideradas para estudos in vivo; 2) a grande similaridade dos resultados obtidos tanto pela técnica de avaliação do grau de infecção de Leishmania em macrófagos utilizando microscopia óptica quanto pela citometria de fluxo é um indicativo de que esta nova metodologia pode ser utilizada em um futuro próximo no estudo de triagens de drogas com potencial leishmanicida in vitro. / Leishmania infantum chagasi is the etiologic agent of Visceral Leishmaniasis, a disease that affects thousands of people worldwide. The usual treatment is based on a restricted repertoire of drugs with high toxicity and costs. The development of new drugs is essential for the control and treatment of this disease. In the current scenario, one possibility for the discovery of new drugs is the use of synthetic chemical compounds. In this context, we propose to evaluate the leishmanicidal activity of Triazole compounds derived from 6-hydroxyisobenzofuran-1 (3H) -one and indan-1,3-dione and compounds derived from Benzophenones. In this work, we performed the in vitro study of the cytotoxicity of these compounds in RAW 264.7macrophages, in promastigote and amastigotes forms of L. infantum chagasi internalized in macrophages, using conventional methodologies, such as optical microscopy, as well as implantation of a new methodology using flow cytometry. After several trials, the compounds derived from Benzophenones (AL-13, AL- 16, AL-19 and B-5), whose leishmanicidal actions stood out the others, were combined in 11 different associations. These were tested for macrophage cytotoxicity and leishmanicidal action in amastigote forms internalized by macrophages. The results obtained by both optical microscopy and flow cytometry showed similarities regarding inhibition of infection rate in L. infantum chagasi infected macrophages. Based on this assumption, our studies suggest that: 1) 3 (of the 11 proposed associations) present leishmanicidal action and deserve to be considered for in vivo studies; 2) the great similarity of the results obtained both by the technique of evaluation of the degree of Leishmania infection in macrophages using optical microscopy and by the flow cytometry is an indicative that this new methodology can be used in the near future in the study of drug screenings with leishmanicidal potential in vitro.

Submitted by Andre Moraes Queiroz (andre.moraesqueiroz@ufpe.br) on 2015-04-14T14:48:21Z No. of bitstreams: 2 Dissertacão Lidiane da Silva.pdf: 1595979 bytes, checksum: 6e0559b19331a737f1c70c137c3d162a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T14:48:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacão Lidiane da Silva.pdf: 1595979 bytes, checksum: 6e0559b19331a737f1c70c137c3d162a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE / A Leishmaniose Visceral Americana (LVA) é uma doença infecciosa grave altamente letal se não tratada. A taxa de infecção de cães pela Leishmania infantum é considerada como um parâmetro importante no monitoramento epidemiológico da LVA, visto que esta doença é considerada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma das seis maiores epidemias de origem parasitária do mundo. O presente estudo objetivou determinar a taxa de infecção de cães pela L. infantum no município de Serra Talhada - PE e avaliar a relação entre polimorfismos nos genes beta-defensina e lectina ligadora de manose (MBL) destes animais e a infecção pela L. infantum. Foram utilizadas amostras de sangue de cães errantes de Serra Talhada, que foram submetidas a extração de DNA e consequentemente PCR em tempo real. Utilizando os primers Linf 1B a qPCR detectou a presença de seis cães infectados de 86 avaliados (~7% de cães infectados). Nas sequencias avaliadas para o marcador de defensina foram observados nove sítios polimórficos, dos quais, nenhum apresentou associação significativa com a infecção por L. infantum, porém o haplótipo formado pela união desses SNPs apresentou uma forte associação com a L. infantum (p = 0,029 e OR = 37.36 (1.55 – 903.16)). Para MBL2 apenas um indel foi encontrado e não apresentou associação significativa com L. infantum, obtendo um valor de p<0,21, possivelmente por apresentar um baixo número de indivíduos infectados e polimorfismos nas sequencias obtidas.

A dinâmica da leishmaniose visceral humana na Amazônia brasileira é pouco conhecida e nos últimos anos tem aumentado a incidência da doença principalmente no Estado do Pará. Os objetivos do estudo foram: I) identificar indivíduos com infecção sintomática e/ou assintomática por Leishmania (L.) infantum chagasi, II) estudar os dois tipos de infecção, tanto clínica quanto imunologicamente, e III) estudar a taxa de prevalência da infecção. O estudo foi de corte transversal com 946 indivíduos de ambos os sexos, com idade a partir de 1 ano, vivendo em área endêmica de leishmaniose visceral americana (LVA), município de Barcarena, Pará, Brasil. Para o diagnóstico da infecção, foram usadas a reação dérmica de hipersensibilidade retardada (Reação Intradérmica de Montenegro) - RIM e a Reação de Imunofluorêscencia Indireta (RIFI). Foram diagnosticados 120 casos de infecção com taxa de prevalência de 12.6%; 8 casos mostraram alta soro-reatividade (1.280 a 120.240) IgG utilizando-se o teste da RIFI e nenhuma reação na RIM; 4 casos foram típicos de LVA e outros 4 casos de infecção subclínica oligossintomática. Os dois métodos imunológicos usados simultaneamente com o exame clínico permitiram a identificação de 5 perfis clínico-imunológicos: Infecção Assintomática (IA) 73,4%; Infecção Subclínica Resistente(ISR) 15%; Infecção Subclínica Oligossintomática (ISO) 3%; Infecção Sintomática (IS=LVA) 3% e, Infecção Inicial Indeterminada (III) 5% / The dynamic of the human visceral leishmaniasis in the Amazon region is not well known and the incidence of the diseases in the last years have increase mainly in the Para state. The objectives the study were I) to identify individuals with symptomatic and/or asymptomatic infection due to Leishmania (L.) i. chagasi, II) to study the two types of infection, both clinically and immunologically, and III) to study the prevalence rate of infection. This was a cross-sectional study with a cohort of 946 individuals, of both sexes, with age from one year old onward, living in an endemic area of American Visceral Leishmaniasis (AVL), municipality of Barcarena, Pará State, Brazil. For the diagnosis of infection, the delayed hypersensitivity skin reaction (LST) and the indirect fluorescent antibody test (IFAT) were used. One hundred twenty cases of infection were diagnosed, with a prevalence rate of 12.6%; 8 cases showed high seroreactivity (1.280 to 10.240, IgG) in IFAT and no reaction in the LST; 4 cases being of typical AVL and other 4 cases of subclinical oligosymptomatic infection. The two immunological methods used simultaneously, with the clinical examination enabled to identify 5 clinical-immunological profiles: Asymptomatic Infection (AI) 73.4%; Subclinical Resistant Infection (SRI) 15%; Subclinical Oligosymptomatic Infection (SOI) 3%; Symptomatic Infection (SI=AVL) 3% and, Indeterminate Initial Infection (III) 5%