Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-02-13T15:10:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5741738 bytes, checksum: 02add042fb42b01ca9dfe6c88e77ace8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T15:10:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5741738 bytes, checksum: 02add042fb42b01ca9dfe6c88e77ace8 (MD5) Previous issue date: 2016-03-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Begomovírus (gênero Begomovirus, família Geminiviridae) possuem um ou dois componentes genômicos de DNA circular de fita simples, encapsidados em partículas icosaédricas geminadas. A maioria dos begomovírus presentes no Novo Mundo (NM) são bissegmentados, enquanto no Velho Mundo (VM) prevalecem os monossegmentados, frequentemente associados a duas classes de DNAs satélites: alfassatélites e betassatélites. Recentemente, alfassatélites foram relatados em associação com begomovírus bissegmentados no NM. Membros do gênero Begomovirus são responsáveis por doenças em culturas economicamente importantes em todo o mundo. Begomovírus que infectam Ipomoea spp. (família Convolvulaceae), comumente denominados "sweepovírus", possuem organização genômica típica dos vírus monossegmentados do VM, porém são filogeneticamente distintos das demais espécies do gênero. O entendimento da dinâmica e variabilidade genética de populações virais em plantas não-cultivadas é importante para auxiliar na previsão e prevenção de doenças em plantas cultivadas. Este trabalho teve como objetivos: (i) estudar a diversidade de espécies de begomovírus em dois hospedeiros não-cultivados amplamente distribuídos no Brasil, Sida spp. e Leonurus sibiricus; (ii) determinar a estrutura e a variabilidade genética das populações de begomovírus em Sida spp. e L. sibiricus; (iii) determinar a variabilidade genética de deltassatélites associados a sweepovírus infectando Ipomoea indica no sul da Espanha, expandindo a análise para outras regiões geográficas. Para os dois primeiros objetivos, o DNA total foi extraído de plantas de Sida spp. e L. sibiricus coletadas nos estados do Rio Grande do Sul, Paraná e Mato Grosso do Sul de 2009 a 2011, e os genomas virais foram amplificados, clonados e sequenciados. A maioria das amostras de Sida spp. estavam infectadas pelo Sida micrantha mosaic virus (SiMMV). Foram encontradas também três novas espécies. A maioria absoluta das amostras de L. sibiricus estavam infectadas pelo Tomato yellow spot virus (ToYSV). Dois alfassatélites foram encontrados: Euphorbia yellow mosaic alphasatellite em Sida sp. e um novo alfassatélite em L. sibiricus. As populações de SiMMV e ToYSV possuem alta variabilidade genética. Embora um elevado nível de recombinação tenha sido detectado, a dinâmica mutacional é o fator primário de diversificação. Os resultados são inconclusivos em relação a estruturação baseada em localização geográfica. Para o terceiro objetivo, DNA foi extraído de plantas de I. indica coletadas no sul da Espanha em 2015, e amplificação por círculo rolante (RCA), uma técnica que leva a amplificação de moléculas de ssDNA circulares sem o conhecimento prévio da sequência nucleotídica, foi usada para clonar os deltassatélites e seus sweepovírus associados, Sweet potato leaf curl virus (SPLCV) e Sweet potato mosaic virus (SPMV). Deltassatélites apresentaram baixa variabilidade de sequência, ausência de recombinação e de estruturação geográfica. Além disso, uma quimera sweepovírus- satélite com um tamanho similar ao dos deltassatélites foi detectada. / Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) possess one or two genomic components of circular, single-stranded DNA (ssDNA) encapsidated in geminate icosahedral particles. Most begomoviruses in the New World (NW) are bipartite, while the majority in the Old World (OW) are monopartite and frequently associated with two classes of satellite DNAs: alphasatellites and betasatellites. Alphasatellites have been recently reported in association with bipartite begomoviruses in the NW. Members of the genus Begomovirus are responsible for important crop diseases worldwide. Begomoviruses that infect Ipomoea spp. (family Convolvulaceae), commonly known as "sweepoviruses", have the typical genomic organization of OW monopartite viruses but are phylogenetically distinct from all other species in the genus. Understanding the dynamics and genetic variability of viral populations in non-cultivated hosts is important for the prediction and consequent prevention of new virus diseases in cultivated plants. This work aimed to: (i) assess the diversity of begomoviruses in two non-cultivated hosts widely distributed in Brazil, Sida spp. and Leonurus sibiricus; (ii) determine the genetic structure and variability of begomovirus populations infecting Sida spp. and L. sibiricus; (iii) determine the genetic variability of deltasatellites associated with sweepoviruses infecting Ipomoea indica in Spain and expand the analysis to other geographical areas. For the first two objectives, total DNA was extracted from samples of Sida spp. and L. sibiricus collected in the states of Rio Grande do Sul, Paraná and Mato Grosso do Sul from 2009 to 2011 and viral genomes were amplified, cloned and sequenced. In Sida spp. the most prevalent virus was Sida micrantha mosaic virus (SiMMV). In addition, three new species were also detected. The vast majority of L. sibiricus samples were infected by Tomato yellow spot virus (ToYSV). Two alphasatellites were found: Euphorbia yellow mosaic alphasatellite in Sida sp. and a new alphasatellite associated with ToYSV in L. sibiricus. Both the SiMMV and ToYSV populations have a high degree of genetic variability. Although a high level of recombination was detected, mutational dynamics was the primary factor of diversification. The results were inconclusive regarding genetic structuration based on geography. For the third objective, DNA was extracted from I. indica samples collected in southern Spain in 2015 and rolling circle amplification (RCA), a technique that allows amplification of circular ssDNA molecules without previous knowledge of nucleotide sequence, was used to clone deltasatellites and two associated sweepoviruses, Sweet potato leaf curl virus (SPLCV) and Sweet potato mosaic virus (SPMV). Deltasatellites showed low sequence variability, no evidence of recombination, and no obvious geographical structuration. Also, a sweepovirus- deltasatellite chimera with a size similar to deltasatellites was detected.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In this study, methanolic and acid methanolic extracts were prepared from the aerial parts of Leonurus sibiricus L. and six secondary metabolites were isolated: the triterpene squalene (28), the labdane-type diterpenoid leojaponin (29), the phytosterols β-sitosterol (30) and β-sitosterol glycosylated (32), the bis phthalate (2-ethylhexyl) (31) and the alkaloid leunurina (1), which are unprecedented in this species with the exception of alkaloid 1. These isolated compounds were tested to determine their antimicrobial activity and enzyme inhibition against to acetylcholinesterase (AChE) and proliloligopeptidase (POP) enzymes. The obtained results indicated moderate antimicrobial potential of the tested samples. The leojaponin diterpene (29) showed better results in the POP inhibition assay, with 72%. Regarding the assay of AChE enzyme, the metabolites tested demonstrated inhibition potential with percentages between 10-17%. Furthermore, in order to evaluate different methods of obtaining the methanolic and acid methanolic extracts, a serie of L. sibiricus extracts were prepared to compare yields, chromatographic profile and biological activities thereof. According to the observed results, the highest yield was obtained by hot extraction using reflux method and MeOH/HCl 1% as an extraction solvent (EB q-MeOH +, 21% yield). All acid extracts showed greater potential for enzyme inhibition, with the highest percentage obtained for the extracts from extraction assisted by ultrasound EB CHII-MeOH+ and CHI-MeOH+ (sonoreator like cup horn) and EB USII-MeOH+ (ultrasonic bath), with 91, 80 and 84% inhibition of POP enzyme, respectively. Considering the AChE, the highest percentages of inhibition were also obtained with extracts prepared by ultrasound technology (EB USI-MeOH and USI-MeOH+ with 34 and 38% of AChE inhibition, respectively). Moreover, it was carried out the extraction of essential oil from the fresh aerial parts of L. sibiricus to determine their chemical composition and biological activity. Three main constituents of the oil were identified: trans-caryophyllene (31.7%), α-humulene (18.53%) and γ-muuruleno (19.12%). The oil did not show satisfactory results for its biological activity in all performed tests. / No presente trabalho foram preparados os extratos metanólico e metanólico ácido das partes aéreas de Leonurus sibiricus L. e isolados seis metabólitos secundários: o triterpeno esqualeno (28), o diterpeno do tipo labdano leojaponina (29), os fitoesteróis β-sitosterol (30) e β-sitosterol glicosilado (32), o ftalato de bis (2-etilexila) (31) e o alcaloide leonurina (1), inéditos nesta espécie com excessão do alcaloide 1. Estes compostos isolados foram testados a fim de se determinar suas atividades antimicrobiana e de inibição enzimática frente às enzimas acetilcolinesterase (AChE) e prolil oligopeptidase (POP). Os resultados obtidos indicaram moderado potencial antimicrobiano das amostras testadas. O diterpeno leojaponina (29) apresentou melhor resultado no ensaio de inibição da POP, com 72%. Com relação ao ensaio de inibição da enzima AChE, os metabólitos testados demonstraram um potencial de inibição com percentuais entre 10-17%. Além disso, objetivando-se avaliar diferentes métodos de obtenção dos extratos brutos metanólico e metanólico ácido foram preparados uma série de extratos de L. sibiricus a pequena escala a fim de se comparar rendimentos, perfis cromatográficos e atividades biológicas dos mesmos. De acordo com os resultados observados, o maior rendimento foi obtido através da extração a quente utilizando refluxo e MeOH/HCl 1% como solvente de extração (EB q-MeOH+; com 21% de rendimento). Todos os extratos ácidos apresentaram maior potencial de inibição enzimática, sendo os maiores percentuais obtidos para os extratos provenientes de extrações asistidas por ultrassom EB CHII-MeOH+ e CHI-MeOH+ (sonoreator do tipo cup horn ) e USII-MeOH+(banho ultrassonico), com 91, 80 e 84% de inibição da enzima POP, respectivamente. Em relação a AChE, os maiores percentuais de inibição também foram obtidos com os extratos preparados por tecnologia de ultrassom (EB USI-MeOH e USI-MeOH+ com 34 e 38% de inibição da AChE, respectivamente). Realizou-se ainda a extração do óleo essencial das partes aéreas frescas de L. sibiricus a fim de determinar sua composição química e atividade biológica. Foram identificados três constituintes principais do óleo: trans-cariofileno (31,7%), α-humuleno (18,53%) e γ-muuruleno (19,12%). O óleo não apresentou resultados satisfatórios quando a sua atividade biológica, em todos os testes realizados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Inflammation is an important component in the development of various pathologies in which the primary process is the recruitment of leukocytes as a cause of tissue injury. The need for new compounds to treat this condition is imminent. In this context, medicinal plants represent a viable alternative for this purpose. Leonurus sibiricus L. is a plant popularly used to treat inflammation and there are few studies that confirm this use. The present study aimed to investigate the antioxidant, antinociceptive and anti-inflammatory effects of the ethanol extract of aerial parts of L. sibiricus. The total content of phenols and flavonoids, as well as the chromatographic analysis by high performance liquid chromatography were carried out to characterize the ethanol extract of L. sibiricus (EELs). In vitro experiments, the antioxidant capacity tests were carried out by elimination of 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazila (DPPH), 2,2'-azinobis (ABTS) and nitric oxide (NO) inhibition, inhibition of lipid peroxidation and the iron reduction potential test (FRAP). In in vivo experiments, the antinociceptive activity was evaluated through the formalin paw and hot plate and anti-inflammatory test using the edema test The results were expressed as mean ± SEM and analyzed by analysis of variance followed by Tukey's test; p<0.05 was considered significant. The contents of total phenols and flavonoids in the extract were 60.1 ± 0.1 mg of gallic acid equivalents/g of extract and 15.4 ± 0.1 mg of catechin equivalents/g of extract, respectively. In the chromatographic profile of EELs, chlorogenic acid, caffeic acid, ferric acid, p-coumaric acid and quercetin were identified. Decrease of DPPH (IC50= 267,6 μg/mL), ABTS (IC50= 7894,3 μg/mL) and NO (IC50= 266,6 μg/mL) radical was observed, as well as the increase in the reduction potential by the FRAP assay. In addition to reducing spontaneous (IC50= 652,4 μg/mL) or FeSO4-induced (IC50= 1553,3 μg/mL) lipid peroxidation in vitro. In the formalin test in the paw, administration of the EELs (400 mg / kg) reduced (p <0.05) the licking / biting time in the second phase of the test compared to the vehicle group, as did as the treatment with morphine and aspirin (p <0.05 each). On the other hand, only morphine decreased (p <0.05) this parameter in the first phase of the test. In the hot plate test, administration of the EELs at all doses did not increase the latency time of mice. In the open field test, administration of EELs to the animals did not change the distance traveled when compared to the vehicle-treated group. In the TPA-induced edema, topical administration of EELs reduced the thickness (p<0.05), MPO activity (p<0.05), TNF-α and IL-1β production (p<0.05) and lipid peroxidation (p<0.05) in the ear, as well as increased FRAP in this tissue (p<0.05). All together, these results show that EELs has anti-inflammatory, antinociceptive and antioxidant properties, supporting the popular use for the treatment of inflammatory conditions. / A inflamação é um componente importante no desenvolvimento de diversas patologias cujo processo primário é o recrutamento de leucócitos provocando lesão tecidual. A necessidade de novos compostos para tratar esta condição é iminente. Neste contexto, as plantas medicinais representam uma alternativa viável para este fim. A Leonurus sibiricus L. é uma planta popularmente utilizada para tratar a inflamação e poucos estudos dão suporte a este uso. O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos antioxidante, antinociceptivo e anti-inflamatório do extrato etanólico de partes aéreas de L. sibiricus. O conteúdo total de fenóis e flavonoides, bem como a análise cromatográfica por cromatografia líquida de alta performance foram realizados para caracterizar o extrato etanólico do Leonurus sibiricus (EELS). In vitro, foram realizados os ensaios de capacidade antioxidante por eliminação de radicais 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH), 2,2'-azinobis (ácido 3-etilbenztiazolino-6- sulfônico (ABTS) e óxido nítrico (NO), inibição da peroxidação lipídica e o ensaio de potencial reducional de ferro (FRAP). In vivo, foi avaliada a atividade antinociceptiva, pelo teste de formalina na pata e placa quente, e anti-inflamatória, pelo teste de edema de orelha induzido por 12-O-tetradecanoilforbol-acetato (TPA). Os resultados foram expressos como média ± SEM e analisados por análise de variância seguido pelo teste de Tukey; p<0,05 foi considerado significativo. Os conteúdos de fenóis totais e flavonoides no extrato foram de 60,1 ± 0,1 mg de equivalentes de ácido gálico/g de extrato e 15,4 ± 0,1 mg de equivalentes de catequinas/g de extrato, respectivamente. No perfil cromatográfico do EELs foram identificados o ácido clorogênico, o ácido cafeico, o ácido ferúlico, o ácido p-cumárico e a quercetina. Observou-se diminuição do radical DPPH (IC50= 267,6 μg/mL), ABTS (IC50= 7894,3 μg/mL) e NO (IC50= 266,6 μg/mL), bem como o aumento no potencial de redução pelo ensaio de FRAP. Além de redução da peroxidação lipídica espontânea (IC50= 652,4 μg/mL) ou induzida por FeSO4 (IC50= 1553,3 μg/mL) in vitro. No teste de formalina na pata, a administração do EELs (400 mg/kg) reduziu (p<0,05) o tempo de lambida/mordida na segunda fase do teste em comparação com o grupo veículo, bem como o tratamento com morfina e aspirina (p<0,05 cada). Entretanto, somente a morfina diminuiu (p<0,05) este parâmetro na primeira fase do teste. No teste da placa quente, a administração do EELs (100, 200 ou 400 mg/kg) não aumentou o tempo de latência dos camundongos na placa quente. No teste do campo aberto, a administração de EELs aos animais não alterou a distância percorrida em comparação ao controle, mas o diazepam diminui esta distância significativamente. No edema induzido por TPA, observou-se que a administração tópica do EELs, concomitante ao TPA, reduziu a espessura (p<0,05), a atividade de MPO (p<0,05), a produção de TNF-α e IL-1β (p<0,05) e a peroxidação lipídica (p<0,05) na orelha, bem com aumentou o FRAP neste tecido (p<0,05). Conjuntamente, estes resultados mostram que o EELs apresenta propriedades antiinflamatória, antinociceptiva e antioxidante, embasando o uso popular para o tratamento de condições inflamatórias.