Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The entire hematopoietic system rests upon a group of very rare cells called hematopoietic stem cells (HSCs). Due to this extraordinarily crucial role, after birth HSCs are localized to the deep bone marrow niche, a hypoxic environment inside the bone where HSCs are under well-orchestrated regulation by both cellular and humoral factors. Among the cellular components regulating hematopoiesis are Leptin Receptor (LEPR)-expressing mesenchymal/stromal cells and adipocytes; both have been demonstrated to have significant influence on the maintenance of HSCs under homeostasis and in stress-related conditions. It has been reported in early work by others that HSCs and hematopoietic progenitor cells (HPCs) express LEPR. However, whether LEPR+ HSCs/HPCs are functionally different from other HSCs/HPCs was unknown. In this study, I demonstrated for the first time that murine LEPR+ Lineage-Sca-1+cKit+ (LSK, a heterogenous population consisting of HSCs/HPCs) cells even though constituting a small portion of total LSK cells are significantly enriched for both phenotypic and functional self-renewing long-term (LT) HSCs as shown in primary and secondary transplants in lethally irradiated recipients. LEPR+LSK cells are also more enriched for colony-forming progenitor cells assessed by colony-forming unit (CFU) assays. In addition, LEPR+ HSCs (defined as LSKCD150+CD48-) exhibited robust repopulating potential as compared to LEPR-HSCs in long-term competitive transplantation assays. To elucidate the molecular pathways that may govern functional properties of LEPR+HSCs, bulk RNA-seq on freshly sorted cells was done. Gene set enrichment analyses (GSEA) revealed Interferon Type I and Interferon γ (IFNγ) Pathways were significantly enriched in LEPR+HSCs while mitochondrial membrane protein gene set was significantly enriched in LEPR-HSCs. Interestingly, proinflammatory signaling including IFNγ pathway has been suggested to be critical for the emergence of embryonic HSCs from the hemogenic endothelium. Altogether, our work demonstrated that LEPR+HSCs represent a small subset of highly engrafting adult BM HSCs. These results may have potential therapeutic implications in the field of hematopoietic transplantation as LEPR is highly conserved between mice and humans.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18683号 / 医博第3955号 / 新制||医||1007(附属図書館) / 31616 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 横出 正之, 教授 岩田 想, 教授 川口 義弥 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DGAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(人間健康科学) / 甲第20759号 / 人健博第49号 / 京都大学大学院医学研究科人間健康科学系専攻 / (主査)教授 木下 彩栄, 教授 三谷 章, 教授 村井 俊哉 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Human Health Sciences / Kyoto University / DFAM

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Reports have linked energy balance along with adipocyte derived leptin action to improved fertility. Recent evidence indicates that leptin hormone is present in breast milk and leptin receptors are well expressed in mammary epithelial cells. The hypothesis that insufficiency of leptin restraint in the hypothalamus may underlie infertility in rodents and the failure of lactating breast to express adequate amount of milk was tested. Female Sprague-Dawley rats were injected leptin through intracerebroventricular cannulation (ICVC) of the third ventricle. Female rats were mated with stud males and observed throughout gestation. Compared to the control groups, leptin treatment increased prolactin levels in the dams and increased milk transfer to pup. Hypothalamic mRNA leptin levels and brain size in the offspring from leptin treated dams were significantly higher than the control. These findings support the involvement of leptin in reproduction and could lead to better understanding of leptin transfer from dam to offspring.

Recent findings suggest that leptin may be regulated in response to abrupt changes in energy homeostasis. Therefore, it is conceivable that transient changes in energy balance induced by exercise may also regulate leptin synthesis and secretion. As such, we hypothesized that acute increases energy expenditure (i.e. exercise), may regulate leptin concentrations in obese individuals. Fifteen healthy obese males underwent either a single exercise session of moderate intensity (58.4 % ± 4.0 of VO2max) for 60 min (n=8), or served as controls (n=7). The exercise session elicited an energy expenditure of 567±80 Kcal. No significant changes in plasma leptin (pre 23.5± 30.2; post 24.3± 34.3; 24h-post 34.9± 66.6; 48h-post 33.8±64.0 ng/ml), or insulin levels (pre 16.1± 9.2 vs. post 8.1± 9.1; 24h-post 14.3± 9.9; 48h-post 13.8± 10.2 ?U/ml) were detected immediately after the intervention. Baseline plasma leptin levels were positively correlated with BMI (r=0.65; p<0.01), body weight (r=0.64; p<0.01), % body fat (r=0.90; p<0.01) and were negatively correlated with VO2max (r=-0.82; p<0.01). The results of the present study suggest that acute exercise of moderate intensity and duration may not affect leptin concentration.

Akute periphere Nervenschädigungen, durch Traumata oder als Folge von Entzündungen, stellen ein häufiges klinisches Problem dar, denn die sensorischen, motorischen und/oder autonomen Funktionsverluste bestehen oftmals dauerhaft (Panagopoulos et al., 2017). Die zugrundeliegende inadäquate und unvollständige Nervenregeneration beruht auf einem fehlerhaften oder ausbleibenden Wachstum regenerierender Axone und der mit der Zeit verblassenden Kapazität des distalen Nervenstumpfs, die regenerierenden Axone zu unterstützen (Jessen & Mirsky, 2019). Die Anwendung derzeit verfügbarer Therapiestrategien, dabei fast ausschließlich chirurgischer Verfahren, ist zumeist nicht ausreichend, um den Prozess der Nervenreparatur zu verkürzen und eine adäquate Funktion der Nerven wiederherzustellen (Panagopoulos et al., 2017). Im Fokus aktueller Forschung und der vorliegenden Doktorarbeit steht daher die Entwicklung pharmakologischer Therapieansätze, die die chirurgische Versorgung von Nervenläsionen ergänzen könnten. Der schon während der Entwicklung des Nervensystems essentiellen symbiotischen Einheit von Axonen und Schwannzellen kommt im Zuge der Nervenregeneration erneut eine große Bedeutung zu. Nach einer akuten Nervenschädigung wechseln Schwannzellen vom Instandhalten der Axone zum Abbau dieser, bis hin zur Unterstützung des erneuten Aufbaus von Axonen und deren Remyelinisierung (Stassart & Woodhoo, 2021). Vorarbeiten der AG Fledrich haben erstmals eine Beeinflussung der Nervenregeneration über den Leptin-Rezeptor in Schwannzellen aufgezeigt. So ist die Nervenregeneration im Mausmodell nach experimenteller Nervenläsion infolge der konditionalen Ablation des Leptin-Rezeptors in Schwannzellen beeinträchtigt (Manuskript Sundaram & Schütza et al., 2023, siehe Anlagen). Basierend auf dieser Entdeckung wurde für die vorliegende Arbeit in einem loss-of-function-Ansatz eine konditionale Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten durchgeführt, wodurch ein Mangel an Leptin induziert wurde, und dessen Einfluss auf die periphere Nervenregeneration nach akuter Nervenschädigung untersucht. Die elektrophysiologischen und histologischen Analysen zeigten eine verminderte Anzahl regenerierter, funktionsfähiger Axone und somit eine beeinträchtigte periphere Nervenregeneration unter Leptin-Mangel. Demgegenüber wurden wildtypische Mäuse im Anschluss an eine experimentelle Nervenläsion mit pharmakologisch appliziertem Leptin behandelt. Dies resultierte in einer verbesserten Nervenregeneration. Erkennbar wurde dies sowohl in der funktionellen Ganganalyse als auch in den elektrophysiologischen und histologischen Untersuchungen durch die erhöhte Anzahl regenerierter Axone mit verstärkter Remyelinisierung unter Leptin Behandlung. Die Ergebnisse sind neben den Vorarbeiten und erbrachten Folgeexperimenten der AG Fledrich Bestandteil des in den Anlagen beigefügten zur Publikation eingereichten Manuskripts Sundaram & Schütza et al., 2023. In der Zusammenschau lässt sich ableiten, dass Leptin über eine gliale Signalwirkung den Prozess der Nervenreparatur positiv beeinflusst, indem es die Autophagie innerhalb des distalen Nervenstumpfs und das neue Auswachsen der Axone sowie deren Remyelinisierung fördert. Mechanistisch könnte Leptin die Energieversorgung der Reparatur-Schwannzellen durch eine erhöhte Leistung der oxidativen Phosphorylierung und Myelinophagie begünstigen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bilden eine Grundlage für zukünftige Studien mit dem Ziel, das gewonnene Wissen in die klinische Praxis zu überführen und eine pharmakologische Behandlung akuter peripherer Nervenschädigungen zu etablieren.:Abkürzungsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Das periphere Nervensystem 1 1.2 Neurone und Gliazellen 1 1.2.1 Signaltransduktion und Myelinisierung 3 1.2.2 Entwicklung der Schwannzelle und axo-gliale Interdependenz 6 1.3 Akute periphere Nervenschädigungen 9 1.3.1 Degenerationsprozesse 11 1.3.2 Regeneration peripherer Nerven und Remyelinisierung 14 1.3.3 Veränderungen im Metabolismus peripherer Nerven nach akuter Nervenschädigung 17 1.4 Leptin und der Leptin-Rezeptor 20 1.4.1 Physiologische Funktionen von Leptin 20 1.4.2 Leptin und das periphere Nervensystem 23 1.5 Zielsetzung und Fragestellung 25 2 Material und Methoden 27 2.1 Material 27 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 27 2.1.2 Puffer und Pufferlösungen 29 2.1.3 Antikörper 33 2.1.4 Inhibitoren, Enzyme und Hormone 34 2.1.5 Kits 34 2.1.6 Genotypisierungs-Primer 35 2.1.7 Verbrauchsmaterialien 35 2.1.8 Geräte 36 2.1.9 Software 37 2.2 Methoden 39 2.2.1 Versuchstiere 39 2.2.1.1 Identifikation der Tiere 39 2.2.1.2 Tamoxifen-Behandlung 39 2.2.1.3 Implantation der ALZET®-Pumpen und Leptin-Behandlung 40 2.2.1.4 Nervenläsion 42 2.2.1.5 Narkotisierung und Tötung der Versuchstiere 43 2.2.1.6 Probenentnahme und Verarbeitung des biologischen Materials 44 2.2.2 Phänotypisierung mittels DigiGaitTM-Ganganalyse 44 2.2.3 Elektrophysiologische Untersuchung 46 2.2.4 Gewebekultur 47 2.2.5 Histologische Methoden 48 2.2.5.1 Einbettung in Agar 100 Resin 48 2.2.5.2 Anfertigung, Aufnahme und Auswertung von Semidünnschnitten 50 2.2.6 Proteinbiochemische Methoden 51 2.2.6.1 Proteinisolation und -quantifizierung 51 2.2.6.2 SDS-Gelelektrophorese 52 2.2.6.3 Western Blotting und Immundetektion 53 2.2.6.4 Nachweis von Serum-Leptin mittels ELISA 55 2.2.7 Nukleinsäure-Analyse 57 2.2.7.1 Isolation genomischer DNA aus Schwanzproben 57 2.2.7.2 Genotypisierung der DNA mittels PCR 57 2.2.7.3 Agarose-Gelelektrophorese der genomischen DNA 59 2.2.8 Statistik 59   3 Ergebnisse 61 3.1 Ex vivo-Untersuchungen geben Aufschluss über Leistungen der oxidativen Phosphorylierung, Autophagie und β-Oxidation während der Nervendegeneration 61 3.1.1 Die ex vivo-Behandlung mit Leptin steigert die Autophagie-Leistung im degenerierenden Nerv 61 3.1.2 Während der Nervendegeneration ist die Expression von Proteinen der oxidativen Phosphorylierung erhöht 63 3.1.3 Die Blockade der Autophagie reduziert die Expression von Proteinen der oxidativen Phosphorylierung im degenerierenden Nerv 64 3.1.4 Die Inhibition des Komplex I der oxidativen Phosphorylierung führt zur Verminderung der Autophagie-Leistung während der Nervendegeneration 65 3.1.5 Die Blockade der Fettsäureoxidation inhibiert die Autophagie 66 3.2 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten beeinträchtigt die Nervenregeneration 68 3.2.1 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten vermindert den Leptin-Spiegel im Blutserum und erhöht das Körpergewicht der Tiere 68 3.2.2 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten resultiert in einem verringerten Muskelsummenaktionspotential von regenerierenden Nerven 69 3.2.3 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten führt zu einer verminderten Anzahl remyelinisierter Axone in regenerierenden Nerven 71 3.3 Die pharmakologische Behandlung mit Leptin fördert die Nervenregeneration in vivo 73 3.3.1 Die Applikation von Leptin über ALZET®-Pumpen führt zu einer Erhöhung des Leptin-Spiegels im Blutserum und zu einer Reduzierung des Körpergewichts der Tiere 73 3.3.2 Die Gabe von Leptin beschleunigt die Wiederherstellung motorischer Funktionen nach akuter Nervenschädigung 74 3.3.3 Die pharmakologische Gabe von Leptin optimiert die Nervenleitgeschwindigkeit und das Muskelsummenaktionspotential von regenerierenden Nerven 78 3.3.4 Die Behandlung mit Leptin verbessert die Remyelinisierung nach akuter Nervenschädigung 79 4 Diskussion 81 4.1 Die während der Nervendegeneration ablaufenden metabolischen Prozesse stehen in einem Abhängigkeitsverhältnis zueinander und lassen sich durch die Gabe von Leptin beeinflussen 82 4.2 In vivo resultiert die Abwesenheit von zirkulierendem Leptin durch Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten in einer beeinträchtigten Nervenregeneration 84 4.3 Pharmakologisch appliziertes Leptin fördert den Prozess der Nervenregeneration in vivo 85 5 Zusammenfassung 88 Literaturverzeichnis VIII Danksagung XVII Lebenslauf XVIII Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XX Anlagen XXI

Ponatinib is a third-generation tyrosine kinase inhibitor approved for Chronic Myelogenous Leukemia and Philadelphia Chromosome Positive Acute Lymphoblastic Leukemia and it is the only tyrosine kinase inhibitor able to bind T315I mutation of BCR-ABL1 (Breakpoint Cluster Region and Abelson1) kinase protein. However, the cardiotoxic adverse reactions related to Ponatinib treatment can result in serious health problems and discontinuation of the therapy. The underlying mechanisms of Ponatinib-induced cardiotoxicity are not known. This study hypothesized that Ponatinib downregulates leptin and serpine-1 expressions and inhibits angiogenesis through the adipokine-induced p38 MAPK signaling pathway in mouse hearts. To evaluate this proposed pathway C57BL/6J mice were divided into two groups: control and ponatinib. After 14 days of the injections, mice were sacrificed and the heart samples were collected for histological analysis and evaluation of mRNA and protein expression levels. The RNA sequence analysis of heart samples was used to detect the main angiogenic markers affected by the treatment. Further analysis was done by Western Blot, RT-PCR, and immunohistochemistry. The heart function was assessed by echocardiography. Overall, the data indicated that the angiogenic response was inhibited by Ponatinib treatment through leptin and serpine-1-mediated p38 MAPK pathway. The anti-angiogenic response is an important underlying pathological mechanism that could lead to disruption of heart function and the echocardiography data confirmed that ponatinib-treated mice showed impaired heart function. Our study suggested that the potential underlying mechanism of Ponatinib-induced cardiotoxicity can be explained by serpine-1 and leptin-mediated angiogenic pathways.

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