Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-09T13:02:39Z No. of bitstreams: 1 2016_LuisAugustoMunizTelles.pdf: 1997639 bytes, checksum: 223339f23582f5f901c01296f18f5dac (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-06T14:24:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LuisAugustoMunizTelles.pdf: 1997639 bytes, checksum: 223339f23582f5f901c01296f18f5dac (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-06T14:24:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LuisAugustoMunizTelles.pdf: 1997639 bytes, checksum: 223339f23582f5f901c01296f18f5dac (MD5) / A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a neoplasia com maior prevalência na infância. Melhorias muito expressivas no prognóstico da doença têm sido apresentadas nas últimas décadas, alcançando-se taxas de cura em torno de 90% em alguns casos. No entanto, a doença ainda apresenta mau prognóstico em pacientes adultos ou menores de um ano. A compreensão das neoplasias tem sido reinterpretada à luz do advento da epigenética como uma nova área do conhecimento. Constituindo um padrão de herança informacional que não depende de alterações na cadeia primária de DNA, a epigenética tem aberto o caminho para novas possibilidades de tratamento do câncer. As metiltransferases de lisina, em particular, têm estado em foco devido aos crescentes relatos de envolvimento na regulação da expressão de oncogenes ou genes supressores de tumor, bem como devido ao desenvolvimento de fármacos cujos alvos são estas mesmas enzimas. A família de metiltransferases SETD possui alguns membros que já foram descritos como tendo relacionamento com o câncer. No entanto, SETD4 ainda carece de mais profunda caracterização. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo descrever o perfil de transcrição de SETD4 em amostras clínicas de aspirado de medula óssea por meio de qPCR e verificar a sua relação com a leucemogênese por meio de análise de correlação com fatores clínicos e com a transcrição de outros genes. Também foi realizada uma análise exploratória de dados de expressão e transcrição disponíveis em bancos de bioinformática on-line. Foi verificado que SETD4 encontra-se com transcrição aumentada no grupo de amostras clínicas neoplásicas em relação às amostras não-neoplásicas de nossa coorte, exibindo aumento transcricional de cerca de 5.4 vezes. Durante o tratamento quimioterápico, os pacientes exibiram redução da transcrição da metiltransferase, revelando correlação com a queda no número de linfoblastos na medula óssea no 29° dia de indução quimioterápica. SETD4 teve sua transcrição fortemente correlacionada com a de duas outras metiltransferases: SETMAR e SMYD2. Foi detectada transcrição aumentada de SETD4 em dados obtidos por microarranjo e RNA-seq de outras neoplasias em plataformas disponíveis de dados públicos. Além disso, amplificações e deleções de número de cópias do gene parecem influenciar negativamente a sobrevida dos pacientes de leucemia mieloide aguda, e câncer de estômago, enquanto o nível aumentado de transcrição parece ter o mesmo efeito em LLA. Também verificamos que SETD4 apresenta mutações no domínio SET e Rubs-subs-bind que têm o potencial de impactar sua função enzimática. Juntos, estes resultados apontam para essa metiltransferase como uma enzima que pode ter um papel importante na leucemogênese e demais processos de carcinogênese, constituindo um atraente alvo terapêutico e farmacológico. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most prevalent cancer in childhood. Very significant improvements in the prognosis of the disease have been made in recent decades, with cure rates being achieved around 90% in some cases. However, the disease still has poor prognosis in adult patients or children with less than one year. The understanding of cancer has been reinterpreted in the light of the advent of epigenetics as a new area of knowledge. Constituting a pattern of informational inheritance that does not depend on changes on primary chain of DNA, epigenetics has opened the way to new possibilities of cancer treatment. Lysine methyltransferases, in particular, have been in focus due to the increasing reports of its involvement in the regulation of oncogene or tumor suppressor gene expression, as well as to the development of drugs targeting those same proteins. The SETD methyltransferase family has some members who have been described as being related to cancer. Despite all these efforts, SETD4 still lacks deeper characterization. Therefore, this study aimed to describe SETD4 transcription profile in clinical samples of bone marrow aspirate by qPCR and to assess its relationship with leukemogenesis by means of correlation analysis with clinical factors and transcription of other genes during chemotherapy. An exploratory analysis of data available at online bioinformatics platforms was also performed. It was found that SETD4 transcription is upregulated in the neoplastic group of clinical samples relative to non-neoplastic samples, exhibiting an increase of approximately 5.4 times. During chemotherapy, patients exhibited reduced methyltransferase transcription, showing correlation with the decrease in the number of lymphoblasts in the bone marrow. SETD4 was highly correlated with the transcription of two other methyltransferases: SETMAR and SMYD2. Upregulated transcription of SETD4 was detected in data obtained by microarray and RNA-seq of other neoplasias in public data platforms. Moreover, gene copy number amplifications and deletions seems to have a negative influence on survival of acute myeloid leukemia and gastric cancer patients while upregulation of transcription in ALL seems to have the same effect. We also verified that SETD4 presents mutations in SET and Rubs-subs-bind domains that may have an impact on its enzymatic function. Together, these results point to this methyltransferase as an enzyme that may play a role in leukemogenesis and other carcinogenesis processes, constituting an attractive therapeutic and pharmacological target.

Introducción: El Síndrome de Down (SD) es la anomalía cromosómica más frecuente en los seres humanos. La Leucemia Linfática Aguda (LLA) es la primera causa de cáncer en la población pediátrica. En los niños con SD el riesgo de desarrollar LLA está incrementado hasta en 40 veces en relación a la población pediátrica. En el Perú, los niños con LLA y SD son tratados empleando el protocolo Berlin-Frankfurt-Münster (BFM) estándar para pacientes sin SD; no se han identificado estudios que reporten resultados sobre el abordaje terapéutico ni la sobrevida en pacientes con SD y LLA . Objetivo: Describir la Sobrevida Libre de Enfermedad (SLE) y Sobrevida Global (SG) en pacientes pediátricos con LLA y SD diagnosticados y tratados en la Unidad de Hematología Pediátrica del Departamento de Hematología del Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins (HNERM) en el periodo de 1999-2016. Métodos: El diseño de estudio es de tipo cohorte retrospectiva, construida con los datos del sistema de registro de la Unidad de Hematología Pediátrica del HNERM, hospital de alta complejidad y de referencia nacional ubicado en Lima, Perú. Se estudiaron 57 pacientes en edad pediátrica con SD diagnosticados de LLA tratados empleando el protocolo BFM estándar desde el año 1999 al 2016, de acuerdo a la estratificación de riesgo asociado. Resultados: Se encontró que la Sobrevida Libre de Enfermedad (SLE) y Sobrevida Global (SG) a 5 años fue de 36,7% y 44,9% respectivamente. Se catalogaron como riesgo alto y muy alto al 61,4% y 28,1% de los casos respectivamente. El 100% de los pacientes logró remisión completa post-inducción. La tasa de recaída fue de 12,2 recaídas por 1000 personas/mes de seguimiento (IC 95%: 8,0 a 15,7). Si bien, la sobrevida global de los varones fue menor que la de las mujeres, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0,142). No se halló asociación con otras variables. Conclusión: Los pacientes con SD y LLA en edad pediátrica tratados en un hospital de alta complejidad de Lima, Perú en el periodo de 1999 a 2016 empleando el protocolo BFM estándar, mostraron una índices de SLE y SG inferiores a los reportados internacionalmente. Se plantea la necesidad de realizar nuevas investigaciones con el fin de identificar variables que puedan estar asociadas a los indicadores evaluados. / Background: Down Syndrome (DS) is the most common chromosomal abnormality in humans. Acute Lymphocytic Leukemia (ALL) is the leading cause of cancer in the pediatric population. In children with DS, the risk of developing ALL is increased up to 40 times fold compared to pediatric population. In Peru, children with DS and ALL are treated using the standard Berlin-Frankfurt-Münster protocol (BFM) for patients without DS. We did not identify any published investigation about the therapeutic approach or survival in patients with DS and ALL. Objective: To describe the Disease Free Survival (DFS) and Overall Survival (OS) rates in pediatric patients with DS and ALL diagnosed and treated at the Pediatric Hematology Unit of the Department of Hematology at the Edgardo Rebagliati Martins National Hospital (HNERM) between 1999 and 2016. Methods: The study design is a retrospective cohort type, constructed with data from the registry system of the Pediatric Hematology Unit of the HNERM, a high complexity hospital located in Lima, Peru. We studied 57 pediatric patients with DS and ALL treated using the standard BFM protocol from 1999 to 2016, according to the associated risk stratification. Results: Five-year survival was 36.7% and 44.9%, respectively, with disease-free survival (DFS) and overall survival (OS). High and very high risks were classified as 61.4% and 28.1% respectively. 100% of patients achieved complete post-induction remission. The relapse rate was 12.2 per 1000 person / month follow-up (95% CI: 8.0 to 15.7). Although the overall survival of males was lower than in females, this difference was not statistically significant (p = 0.142). No association with other variables was found. Conclusion: Patients with DS and ALL treated in a high complex hospital in Lima, Peru from 1999 to 2016 using the standard BFM protocol, showed lower index for DFS and OG than those reported internationally. Further research is needed in order to identify associated variables with the indicators evaluated.

El síndrome de Down (SD) o trisomía 21 es una anomalía cromosómica constitucional, que puede presentarse en forma de mosaico en 1 % a 4 % de los casos. El diagnóstico de SD mosaico es difícil debido a que la mayoría de los pacientes tienen un fenotipo normal y no manifiestan alteraciones clínicas importantes. Los pacientes con SD tienen mayor riesgo de desarrollar leucemias agudas como la leucemia linfoblástica aguda (LLA). Presentamos el caso de una mujer de 19 años con trisomía 21 en mosaico y LLA de células B.

Orientador: Marcos Antônio de Oliveira / Resumo: L-asparaginases (ASNases) bacterianas são importantes biofármacos utilizados no tratamento de leucemia linfoide aguda (LLA), uma vez que este tipo tumoral é dependente da disponibilidade de asparagina (Asn) extracelular. As ASNases bacterianas são capazes de hidrolisar eficientemente Asn em ácido aspártico (Asp) e amônia (NH3), diminuindo a disponibilidade de Asn para células tumorais e induzindo apoptose. Comercialmente, indústrias farmacêuticas internacionais produzem ASNases de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi, entretanto, ASNase de nenhuma origem é produzida pelas indústrias farmacêuticas brasileiras. Adicionalmente, o tratamento com estas enzimas produz efeitos colaterais, entre eles imunogênicos, que estão relacionados com a alta massa molecular da enzima (140kDa) e neurológicos, atribuídos a atividade secundária de glutaminase (GLNase). Neste contexto, fontes alternativas destas enzimas e também a auto-suficiência em suas produções são importantes para mitigar os efeitos colaterais e evitar falhas no tratamento devido a flutuações internacionais de sua fabricação. Neste trabalho, realizamos a caracterização de uma ASNase de levedura, denominada de ASNaseM que compartilha elevada homologia (maior que 30% de identidade e 40% de similaridade) com as enzimas bacterianas utilizadas no tratamento da LLA e que possui todos os aminoácidos envolvidos na catálise conservados, sugerindo uma fonte alternativa potencial para o tratamento da LLA. Experimentos de cromatografia... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Bacterial L-asparaginases (ASNases) are important biopharmaceuticals used in the treatment of acute lymphoid leukemia (ALL), since this tumor type is dependent on the availability of extracellular asparagine (Asn). Bacterial ASNases are able to efficiently hydrolyze Asn in aspartic acid (Asp) and ammonia (NH3), decreasing the availability of Asn to tumor cells and inducing apoptosis. Commercially, international pharmaceutical industries produce ASNases from Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi, however none ASNase is produced by the Brazilian pharmaceutical companies. Additionally, the treatment with these enzymes can produce side effects, among them immunogenic ones, that are related to the high molecular weight of the enzyme (140kDa) and neurological, attributed to the glutaminase secondary activity (GLNase), being glutamine (Gln) the most abundant amino acid in the bloodstream. In this context, alternative sources of these enzymes as also the self-sufficiency of the production are important to mitigate side effects and avoid treatment failures due to international fluctuations in their manufacture. In this work, we performed the characterization of a yeast ASNase, called ASNaseM, which shares high homology (higher than 30% identity and 40% similarity) with the bacterial enzymes used in the treatment of ALL, and which has all the amino acids involved in the catalysis conserved, suggesting a potential alternative source for the treatment of ALL. Molecular exclusion chro / Doutor

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-25T15:36:24Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Renata G. Cunha.pdf: 3040966 bytes, checksum: 03c4fbd180be9d322c4e34f188abad93 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-25T15:36:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Renata G. Cunha.pdf: 3040966 bytes, checksum: 03c4fbd180be9d322c4e34f188abad93 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-25T15:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Renata G. Cunha.pdf: 3040966 bytes, checksum: 03c4fbd180be9d322c4e34f188abad93 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common malignancy in children, especially in males and chemotherapy is generally the treatment for these patients. Minor side effects of therapy have been reported, and mucositis is one of the most common. It has been suggested in the literature that HSV-1 plays an important role in the severity of oral mucositis in patients with onco-hematological diseases. This study quantified HSV-1 in the oral mucosa of pediatric ALL patients undergoing GBTLI ALL-2009 protocol, from the Foundation of Hematology of the Amazon (HEMOAM), correlating viral load to the different stages of treatment and also to the presence and grading of oral mucositis. We evaluated twenty patients by clinical examination of the oral mucosa to identify oral lesions and also collected cells from buccal mucosa in several times and phases of chemotherapy. These samples were submitted to DNA extraction followed by detection and quantification of HSV-1 using Real Time PCR. Data were analyzed using Mann-Whitney and Kruskal Wallis test with a significance level of p ≤ 0.05. Of all patients, half of them were male, between 1 and 6 years (80%) and with ALL Type B low risk (75%). Dry mouth (15%) and oral mucositis (35%) were the oral lesions found. It was detected HSV-1 presence in the oral mucosa of 80% of patients at some stage of chemotherapy with predominance of the virus in the intensification phase only in patients with ALL B high risk, with no differences in viral load of HSV -1 at different stages of treatment in LLA B group of low risk. Higher incidence of mucositis was observed in prefase/induction (75%) with higher levels of the virus in these patients compared to those free of mucositis, but without statistical significance. It is suggested that HSV-1 is frequent in the buccal mucosa of patients with B ALL, and its viral load may be different in subtypes of ALL B. However, the role of HSV-1 at the onset of oral mucositis not it is certain. / Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é a neoplasia maligna mais comum em crianças, principalmente do sexo masculino, sendo a quimioterapia o tratamento indicado para esses pacientes. Efeitos colaterais secundários decorrentes da terapia têm sido relatados, sendo a mucosite um dos mais comuns. Tem sido sugerido na literatura que o HSV-1 desempenha papel importante na severidade da mucosite bucal em pacientes com doenças onco-hematológicas. Este trabalho quantificou o HSV-1 na mucosa bucal de pacientes pediátricos com LLA submetidos ao protocolo GBTLI LLA-2009, na Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM), correlacionando sua carga viral com as diferentes fases do tratamento e em relação a presença e graduação da mucosite bucal. Foram avaliados vinte pacientes por meio de exame clínico da mucosa bucal para identificação de lesões bucais, bem como a coleta de células da mucosa jugal em vários momentos das diferentes fases da quimioterapia. Foi realizada extração de DNA dessas amostras para posterior detecção e quantificação da carga viral do HSV-1 por meio da técnica de PCR em Tempo Real. Os dados foram analisados por meio dos testes de Mann Whitney e Kruskal Wallis com nível de significância de p ≤ 0,05. Do total de pacientes, metade era do sexo masculino, a maioria com idade entre 1 e 6 anos (80%) e com LLA do tipo B de baixo risco (75%). Lábios ressecados (15%) e mucosite bucal (35%) foram as manifestações bucais encontradas. Detectou-se a presença do HSV-1 na mucosa bucal de 80% dos pacientes em algum momento do tratamento quimioterápico havendo predominância do vírus na fase de Intensificação somente no grupo de pacientes com LLA B alto risco, não havendo diferenças na carga viral do HSV-1 nas diferentes fases do tratamento no grupo de LLA B de baixo risco. Maior ocorrência de mucosite foi observada na prefase/indução (75%) ocorrendo valores mais altos de carga viral nesses pacientes em relação aos livres de mucosite, porém sem significância estatística. Sugere-se que a presença do HSV-1 na mucosa bucal de pacientes com LLA B é frequente, e sua carga viral pode estar diferenciada nos subtipos de LLA B. No entanto, o papel do HSV-1 no surgimento da mucosite bucal ainda não está claro.

A L-asparaginase (EC 3.5.1.1) é uma enzima importante para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA), neoplasia mais frequente em crianças e adolescentes. A L-asparaginase hidrolisa a L-asparagina resultando em ácido aspártico e amônio, impedindo que as células tumorais utilizem esse aminoácido para síntese proteica, ocasionando a morte celular apoptótica. Atualmente a enzima é obtida a partir de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi; no entanto, ambas as formulações estão associadas a um alto índice de efeitos adversos que comprometem a evolução e eficácia do tratamento. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem o gene ASP1 responsável pela produção de L-asparaginase 1 (Sc_ASPase1) que tem sido pouco estudada. Para elucidar as características de Sc_ASPase1 nós expressamos a proteína em E. coli BL21(DE3) e a purificamos por cromatografia de afinidade. Sc_ASPase1 tem uma atividade especifica de 195,4 U/mg para L-asparagina e de 0,36 U/mg para L-glutamina, e um comportamento alostérico com um K0.5 de 75 µM para L-asparagina. Por meio de mutação sitio dirigida demonstramos a importância dos resíduos Thr64-Thy78-Th141-Lys215 para a catálise. As isoformas mutantes da proteína A331D, K335E, Y243S, S301N e ΔG77 não apresentaram melhoria nos parâmetros cinéticos ou atividade específica. Construímos e clonamos Sc_ASPase1 com a deleção dos primeiros 52 aminoácidos, porém nas condições testadas a proteína foi expressa na forma insolúvel. Demonstramos que Sc_ASPase1 possui potencial antineoplásico, pois com 10 U/mL de enzima foi capaz causar a 85% de mortalidade da linhagem leucêmica MOLT-4. Na mesma concentração, a enzima de E. coli é capaz de matar 95% de células dessa mesma linhagem. / L-Asparaginase (EC 3.5.1.1) is an important enzyme for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), the most common malignancy in children and adolescents. L-asparaginase hydrolyzes L-asparagine resulting in ammonium and aspartic acid, preventing tumor cells of using such amino acid for protein synthesis, leading to apoptotic cell death. Currently, the enzyme is obtained from Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi; however, both formulations are associated with a high incidence of side effects that compromise the progress and effectiveness of treatment. The yeast Saccharomyces cerevisiae has ASP1 gene responsible for the production of L-asparaginase 1 (Sc_ASPase1) that has been poor studied. To elucidate the characteristics of Sc_ASPase1, we expressed the protein in E. coli BL21 (DE3) cells and purified it by affinity chromatography. Sc_ASPase1 has a specific activity of 195.4 U/mg for L-asparagine and 0.36 U/mg for L-glutamine, and an allosteric behavior with a K0.5 of 75 µM for L-asparagine. Through site directed mutation, we demonstrated the importance of Thr64-Thy78-Th141-Lys215 residues for catalysis. The mutant protein isoforms A331D, K335E, Y243S, S301N and ΔG77 showed no improvement in kinetic parameters or specific activity. We build and cloned Sc_ASPase1 with the deletion of the first 52 amino acids, but under the conditions tested the protein was expressed in insoluble form. Sc_ASPase1 have demonstrated potential antineoplastic activityc, since 10 U/mL of enzyme lead to 85% of mortality in leukemia cell line MOLT-4. At the same concentration, the E. coli enzyme kills 95% of the cells of the same line.

A enzima L-asparaginase (ASNase) usada como biofármaco no tratamento de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é de origem bacteriana, o que provoca reações imunológicas nos paciente e a ASNase usada no Brasil é importada o que dificulta seu uso por razões de abastecimento e de preço. Por outra parte, dentro dos sistemas de expressão de proteínas recombinantes usados pela biotecnologia, destaca-se a Pichia pastoris, levedura metilotrófica de fácil manipulação, crescimento rápido, alta capacidade de expressão e capaz de realizar modificações pós-traducionais. Neste projeto, o gene de ASNase II de Saccharomyces cerevisiae foi expressa em P. pastoris (Muts), tendo sido analisada a localização da enzima nos meios extracelular, intracelular e espaço periplasmático. Além disso, foram avaliadas diversas condições de crescimento e indução da ASNase em agitador orbital e finalmente foi feito o cultivo em biorreator de 3L operado em batelada. Segundo o analise da expressão, a enzima foi localizada no espaço periplasmático. O crescimento de P. pastoris em diferentes concentrações de glicerol (10,0 - 50,0 g.L-1) mostraram parâmetros cinéticos similares (µmáx = 0,35 h-1; tg= 2,0 h) e o maior fator de conversão de substrato em células (Y x/s = 0,9 g g-1) foi obtido com 10,0 g.L-1 de glicerol. A expressão de ASNase somente ocorreu a 20 °C e melhora com concentrações de metanol acima de 1,0% (v/v), obtendo-se a maior produção da enzima a 3% de metanol durante 48 horas, o que foi corroborado pelo planejamento fatorial fraccionado (3n-k + 2), n = 3 e k =1. Também se observou que o pH de indução, a suplementação com aminoácidos ou casaminoácidos e concentração de glicerol durante a fase de crescimento apresentaram pouca ou nenhuma influência na expressão. Entretanto, as células induzidas imediatamente após o glicerol ter sido consumido melhoraram a produção de ASNase. No cultivo em biorreator, a fase de crescimento foi feita com 10,0 e 40,0 g.L-1-1 de glicerol, e a fase de indução com pulsos de 3,0% (v/v) de metanol durante 120 horas. A maior atividade volumétrica (710,2 U.L-1) de ASNase foi obtida na batelada com 40,0 g.L-1 de glicerol e a atividade periplasmática foi constante durante o tempo de cultivo o que significa que o controle do pH afeta positivamente na expressão de ASNase. / The bacterial L-asparaginase (ASNase) is used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and non-Hodgkin lymphoma and because his origin causes immune reactions in patients. The ASNase used in Brazil is imported which hinders its use due to supply availability and price. The methylotrophic yeast Pichia pastoris, is a microrganism easy to handle and with fast growth and high capacity of expression of recombinant proteins and that is able to carry out post-translational modifications. In this work, Saccharomyces cerevisiae ASNase II gene was expressed in Pichia pastoris (Muts) and was analyzed its localization in extra and intracellular medium and periplasmic space. Also, different conditions of growth and induction were evaluated in shaker, that culminated in a cultivation carried out in 3L bioreactor operated in batch. According the expression analysis, the enzyme was localized in periplasmic space; Pichia pastoris growth in different concentrations of glycerol (10 - 50 g.L-1) show similar kinetic parameters (µmáx = 0.35 h-1; tg = 2.0 h), with the higher substrate to biomass yield (Y x/s= 0.9 g.g-1) obtained with 10 g.L-1 of glycerol. The ASNase expression only occurred at 20°C and improves with methanol concentrations above 1.0% (v/v) to yield the highest production ASNase 3.0% methanol for 48 hours, which was corroborated by factorial fractionated design (3n-k + 2), n = 3 and k = 1. Also was observed that the pH of induction, supplementation with amino acids or casaminoacids and glycerol concentration during the growth phase had little or null influence on the expression. However the induction immediately after glycerol depletion improved the ASNase production. In bioreactor, were used 10 and 40 g.L-1 of glycerol in the growth phase and in the induction phase were used methanol pulses of 3.0% (v/v) during 120 hours. The major volumetric activity (710,2 U.L-1) of ASNase occurred in batch cultivation with 40 g.L-1 of glycerol and periplasmic activity was almost constant during the process which means that the control of pH affects positively the ASNase expression.

A enzima L-asparaginase (ASNase) usada como biofármaco no tratamento de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é de origem bacteriana, o que provoca reações imunológicas nos paciente e a ASNase usada no Brasil é importada o que dificulta seu uso por razões de abastecimento e de preço. Por outra parte, dentro dos sistemas de expressão de proteínas recombinantes usados pela biotecnologia, destaca-se a Pichia pastoris, levedura metilotrófica de fácil manipulação, crescimento rápido, alta capacidade de expressão e capaz de realizar modificações pós-traducionais. Neste projeto, o gene de ASNase II de Saccharomyces cerevisiae foi expressa em P. pastoris (Muts), tendo sido analisada a localização da enzima nos meios extracelular, intracelular e espaço periplasmático. Além disso, foram avaliadas diversas condições de crescimento e indução da ASNase em agitador orbital e finalmente foi feito o cultivo em biorreator de 3L operado em batelada. Segundo o analise da expressão, a enzima foi localizada no espaço periplasmático. O crescimento de P. pastoris em diferentes concentrações de glicerol (10,0 - 50,0 g.L-1) mostraram parâmetros cinéticos similares (µmáx = 0,35 h-1; tg= 2,0 h) e o maior fator de conversão de substrato em células (Y x/s = 0,9 g g-1) foi obtido com 10,0 g.L-1 de glicerol. A expressão de ASNase somente ocorreu a 20 °C e melhora com concentrações de metanol acima de 1,0% (v/v), obtendo-se a maior produção da enzima a 3% de metanol durante 48 horas, o que foi corroborado pelo planejamento fatorial fraccionado (3n-k + 2), n = 3 e k =1. Também se observou que o pH de indução, a suplementação com aminoácidos ou casaminoácidos e concentração de glicerol durante a fase de crescimento apresentaram pouca ou nenhuma influência na expressão. Entretanto, as células induzidas imediatamente após o glicerol ter sido consumido melhoraram a produção de ASNase. No cultivo em biorreator, a fase de crescimento foi feita com 10,0 e 40,0 g.L-1-1 de glicerol, e a fase de indução com pulsos de 3,0% (v/v) de metanol durante 120 horas. A maior atividade volumétrica (710,2 U.L-1) de ASNase foi obtida na batelada com 40,0 g.L-1 de glicerol e a atividade periplasmática foi constante durante o tempo de cultivo o que significa que o controle do pH afeta positivamente na expressão de ASNase. / The bacterial L-asparaginase (ASNase) is used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and non-Hodgkin lymphoma and because his origin causes immune reactions in patients. The ASNase used in Brazil is imported which hinders its use due to supply availability and price. The methylotrophic yeast Pichia pastoris, is a microrganism easy to handle and with fast growth and high capacity of expression of recombinant proteins and that is able to carry out post-translational modifications. In this work, Saccharomyces cerevisiae ASNase II gene was expressed in Pichia pastoris (Muts) and was analyzed its localization in extra and intracellular medium and periplasmic space. Also, different conditions of growth and induction were evaluated in shaker, that culminated in a cultivation carried out in 3L bioreactor operated in batch. According the expression analysis, the enzyme was localized in periplasmic space; Pichia pastoris growth in different concentrations of glycerol (10 - 50 g.L-1) show similar kinetic parameters (µmáx = 0.35 h-1; tg = 2.0 h), with the higher substrate to biomass yield (Y x/s= 0.9 g.g-1) obtained with 10 g.L-1 of glycerol. The ASNase expression only occurred at 20°C and improves with methanol concentrations above 1.0% (v/v) to yield the highest production ASNase 3.0% methanol for 48 hours, which was corroborated by factorial fractionated design (3n-k + 2), n = 3 and k = 1. Also was observed that the pH of induction, supplementation with amino acids or casaminoacids and glycerol concentration during the growth phase had little or null influence on the expression. However the induction immediately after glycerol depletion improved the ASNase production. In bioreactor, were used 10 and 40 g.L-1 of glycerol in the growth phase and in the induction phase were used methanol pulses of 3.0% (v/v) during 120 hours. The major volumetric activity (710,2 U.L-1) of ASNase occurred in batch cultivation with 40 g.L-1 of glycerol and periplasmic activity was almost constant during the process which means that the control of pH affects positively the ASNase expression.

A L-asparaginase (EC 3.5.1.1) é uma enzima importante para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA), neoplasia mais frequente em crianças e adolescentes. A L-asparaginase hidrolisa a L-asparagina resultando em ácido aspártico e amônio, impedindo que as células tumorais utilizem esse aminoácido para síntese proteica, ocasionando a morte celular apoptótica. Atualmente a enzima é obtida a partir de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi; no entanto, ambas as formulações estão associadas a um alto índice de efeitos adversos que comprometem a evolução e eficácia do tratamento. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem o gene ASP1 responsável pela produção de L-asparaginase 1 (Sc_ASPase1) que tem sido pouco estudada. Para elucidar as características de Sc_ASPase1 nós expressamos a proteína em E. coli BL21(DE3) e a purificamos por cromatografia de afinidade. Sc_ASPase1 tem uma atividade especifica de 195,4 U/mg para L-asparagina e de 0,36 U/mg para L-glutamina, e um comportamento alostérico com um K0.5 de 75 µM para L-asparagina. Por meio de mutação sitio dirigida demonstramos a importância dos resíduos Thr64-Thy78-Th141-Lys215 para a catálise. As isoformas mutantes da proteína A331D, K335E, Y243S, S301N e ΔG77 não apresentaram melhoria nos parâmetros cinéticos ou atividade específica. Construímos e clonamos Sc_ASPase1 com a deleção dos primeiros 52 aminoácidos, porém nas condições testadas a proteína foi expressa na forma insolúvel. Demonstramos que Sc_ASPase1 possui potencial antineoplásico, pois com 10 U/mL de enzima foi capaz causar a 85% de mortalidade da linhagem leucêmica MOLT-4. Na mesma concentração, a enzima de E. coli é capaz de matar 95% de células dessa mesma linhagem. / L-Asparaginase (EC 3.5.1.1) is an important enzyme for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), the most common malignancy in children and adolescents. L-asparaginase hydrolyzes L-asparagine resulting in ammonium and aspartic acid, preventing tumor cells of using such amino acid for protein synthesis, leading to apoptotic cell death. Currently, the enzyme is obtained from Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi; however, both formulations are associated with a high incidence of side effects that compromise the progress and effectiveness of treatment. The yeast Saccharomyces cerevisiae has ASP1 gene responsible for the production of L-asparaginase 1 (Sc_ASPase1) that has been poor studied. To elucidate the characteristics of Sc_ASPase1, we expressed the protein in E. coli BL21 (DE3) cells and purified it by affinity chromatography. Sc_ASPase1 has a specific activity of 195.4 U/mg for L-asparagine and 0.36 U/mg for L-glutamine, and an allosteric behavior with a K0.5 of 75 µM for L-asparagine. Through site directed mutation, we demonstrated the importance of Thr64-Thy78-Th141-Lys215 residues for catalysis. The mutant protein isoforms A331D, K335E, Y243S, S301N and ΔG77 showed no improvement in kinetic parameters or specific activity. We build and cloned Sc_ASPase1 with the deletion of the first 52 amino acids, but under the conditions tested the protein was expressed in insoluble form. Sc_ASPase1 have demonstrated potential antineoplastic activityc, since 10 U/mL of enzyme lead to 85% of mortality in leukemia cell line MOLT-4. At the same concentration, the E. coli enzyme kills 95% of the cells of the same line.

Considerando o potencial de morbidade das complicações orais em pacientes com leucemia, procurou-se avaliar as alterações clinicas e microbiológicas da mucosa, em crianças com LLA. na faixa etária de O a 15 OOos, submetidas a quimioterapia antineoplásica e ao uso profilático do gluconato de clorexidina a 0,12%, durante dez dias, o qual era administrado em todas as fases do tratamento quimioterápico. A coleta para o estudo microbiológico foi obtida, preferencialmente, na fase de intensificação, ao término do tratamento profilático. A amostra foi constituida por 20 crianças, na qual evidenciou-se em nivel clinico, uma freqüência reduzida de mucosite, com 8 ocorrências (40%) apenas. No exame microbiológico, constatou-se a presença de reduzido número de microrganismos patogênicos, como Staphylococcus coagulase-negativo (40%), Klebsiella pneumoniae (5%), Escherichia coli-enteropatogênica (15%), Stenotrophomonas maltophilia (5%) e Candida albicans (35%). Diante dos resultados, sugeriu-se que o uso do referido antisséptico contribuiu para a reduzida ocorrência de mucosite, no entanto, não foi possivel estabelecer correlação entre os microrganimos isolados e o desenvolvimento da mucosite. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT: Regarding the morbidity potential of oral complications in patients with leukemia, it evaluated the clínical and microbiologic changes of oral mucosal in children with LLA, with age range of O to 15 years old, undergone the chemotherapy antineoplastic and for the use prophylactic of chlorhexidine gluconate 0,12% during ten days, that was utilized in each chemotherapy treatment stage. The collect for rnicrobiological study was obtained preferentiality in intensification stage at the end prophylatic treatment. The study grouup had 20 children, where it observed clinically decrease in frequency of mucositis, with 8 cases (40%) only. In microbiological examination observed one reduced incidence of pathogenic microorganisms with Staphylococcus coagulase- negative (40%), Klebsiella pneumoniae (5%), Escherichia coZi enteropathogenic (15%), Stenotrophomonas maltophilia (5%) e Candida albicans (35%). The findings obtained in the present trial suggest that the use of chlorhexidine gluconate 0,12% can be responsible for incidence reduced of mucositis, but it wasn t possible to make correlation between isolated pathogenic microorganisms and mucositis development.