The NTPDase1 (E.C. 3.6.1.5, apyrase, CD39, ecto-ATP-diphosphohydrolase) enzymatic activity, which is responsible for hydrolyzing ATP and ADP nucleotides, was verified in lymphocytes from 56 patients under treatment for acute lymphoblastic leukemia (ALL) and from 33 healthy subjects. Patients were divided into 3 groups: remission induction (RI), remission maintenance (RM) and out-oftreatment (OT). It had been verified, in each group, the influence of the recurrence risk (high or low) on the enzymatic activity. The RM group was then subdivided by the amount of time they had been in remission maintenance (0-30, 31-60 and 61-84 weeks). Results demonstrated that the ATP hydrolysis from lymphocyte NTPDase1 is altered in the groups studied (F (3,84)=100.34; p<0.01) in relation to the controls, and that it is reduced in both RI and RM groups, while enhanced in OT group. The recurrence risk did not influence ATP hydrolysis in none of the groups. Furthermore, it has been found a significant variation at the NTPDase1 activity to ATP hydrolysis during RM phase (F (2,17)=11.22; p=0.01), being higher in the first 30 weeks, and subsequently reduced. ADP hydrolysis by NTPDase1 activity was also significantly reduced in both the RI and RM groups, but similar to the controls in OT (F (3,69)=59.05; p<0.01). It has not been verified any influence of the recurrence risk on ADP hydrolysis. Furhermore, NTPDase1 using ADP as substrate has shown to be constant during RM phase (F (2,13)=2.40; p=0.130). The alteration on ATP and ADP hydrolysis on lymphocytes of ALL patients is in agreement to the characteristics found in this pathology. Thus, our results corroborate the role of adenine nucleotides, ATP in special, in the immune system, as signaling molecules, and the importance of the NTPDase1 to maintain constant the extracellular levels of these nucleotides. However, more studies are necessary to better understand the role of adenine nucleotides and NTPDase1 in the immunodeficiency and citotoxicity observed in treated ALL patients. / A atividade da enzima NTPDase1 (E.C. 3.6.1.5, CD39, apirase, ecto-ATPdifosfoidrolase), a qual hidrolisa os nucleotídeos ATP e ADP, foi verificada em linfócitos de 56 pacientes em tratamento para leucemia linfocítica aguda (LLA) e em 33 indivíduos controle. Os pacientes foram divididos em 3 grupos de acordo com a fase do tratamento: indução da remissão (IR), manutenção da remissão (MR) e fora-de-tratamento (FT), sendo que para cada grupo foi também verificada a influência do risco de recaída da doença (alto ou baixo) na atividade da enzima. O grupo MR foi ainda subdividido em três, de acordo com o período nesta fase: 0-30, 31-60 e 61-84 semanas em tratamento. Os resultados demonstraram que a hidrólise do ATP pela NTPDase1 está alterada nos 3 grupos estudados (F (3, 84)=100.34; p<0.01) em relação ao grupo controle, sendo que houve uma redução nas fases IR e MR, enquanto houve um aumento da hidrólise na fase FT. Não houve influência do prognóstico (grau de risco) na alteração da atividade da enzima em nenhum dos grupos estudados. Encontrou-se ainda uma variação na hidrólise do ATP pela enzima NTPDase1 durante a fase MR (F (2, 17)=11.22; p=001), sendo maior durante o período de 0-30 semanas de tratamento, e reduzida após. A atividade da NTPDase1 na hidrólise do ADP também se encontrou significativamente reduzida nas fases IR e MR, porém semelhante aos controles na fase FT (F (3, 69)=59.05; p<0.01). Também não foi verificada correlação entre a atividade da enzima, tendo ADP como substrato, e o prognóstico da LLA. Além disso, a atividade da NTPDase1 para o ADP se manteve constante durante a fase MR (F (2, 13)=2.40; p=0.130). A alteração na hidrólise do ATP e ADP em linfócitos de pacientes com LLA, como nossos resultados indicam, está de acordo com algumas das características encontradas durante o tratamento dessa patologia. Dessa forma, nossos resultados corroboram o papel dos nucleotídeos da adenina, em especial o ATP, no sistema imune como moléculas sinalizadoras, bem como a importância da enzima NTPDase1 para a manutenção dos níveis extracelulares desses nucleotídeos. Entretanto, mais estudos são necessários para melhor compreender o papel dos nucleotídeos da adenina e da NTPDase1 na imunodeficiência e citotoxicidade induzidos pelo tratamento da LLA.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common cancer found in the pediatric population and is characterized by uncontrolled proliferation and maturation arrest of lymphoid progenitor cells (lymphoblasts) in the bone marrow. In ALL occurs an increase in the production of reactive species and studies show the involvement of oxidative stress in ALL pathogenesis. Moreover acetylcholinesterase (AChE) present in blood and plasma and also in lymphocytes is well established as having non-cholinergic functions including development of cancer and its contribution to the regulation of immune function. Considering such statements, it was investigated the oxidative profile and ACHE activity in ALL patients. Eighty two ALL patients and 50 healthy subjects participated in this study. Patients were divided into 4 groups: newly diagnosed (ND) remission induction (RI), remission maintenance (RM) and out-of-treatment (OT). For evaluation of the oxidative profile, we determined the catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activities in blood, thiols non protein (NPSH) in plasma and erythrocytes, as well as, vitamin E, TBARS and protein carbonyl content from serum samples. Damage markers in lipids and proteins, represented by MDA levels and protein carbonylation content respectively, showed increased levels in patients when compared with the control group. In relation to enzymatic defense, represented by the enzymes SOD and CAT, it was observed a decrease in the activities in ALL patients in groups RD, RI and RM, coming back to the normal in OT group. Non enzymatic defense (NPSH in plasma and vitamin E) analyzed also revealed decrease in ALL patients in relation to the controls. No significant difference in NPSH levels was observed between RD group and control group. In relation to AChE activity, in both total blood and lymphocytes, was observed an increase in the RD group in relation to the other groups. On the other hand, in RI and RM the enzyme activity was diminished in relation to control group. No significant difference was observed in AChE activity between FT group and the control group. The results suggest that in ALL an excessive accumulation of reactive species contributes to an antioxidant depletion and dysfunction. The results had also disclosed that the AChE activity is modified in ALL, what can suggest the involvement of this enzyme in the modulation of immune function and in cancer development. The ALL results in a systemic disorder that induces changes, which can be detected by mesuring the peripheral markers of oxidative stress and AChE activity in whole blood and lymphocytes. / A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o câncer mais comum na infância e é caracterizado por uma proliferação descontrolada de células linfóides imaturas (linfoblastos) na medula óssea. Na LLA há uma produção elevada de espécies reativas e estudos relatam que o estresse oxidativo está envolvido na patogenia desta doença. Além disso, a enzima acetilcolinesterase (AChE) presente no sangue e no plasma, inclusive nos linfócitos, desempenha funções não colinérgicas e parece estar envolvida na regulação da função imune e no desenvolvimento do câncer. Levando em consideração tais afirmativas, este trabalho investigou o perfil oxidativo e a atividade da enzima AChE em pacientes com LLA. Participaram do estudo 82 pacientes com LLA e 50 indivíduos controles. Os pacientes foram divididos em 4 grupos: recém diagnosticado (RD), indução da remissão (IR), manutenção da remissão (MR) e fora de tratamento (FT). Para avaliação do perfil oxidativo, determinou-se a atividade da catalase (CAT) e da superóxido dismutase (SOD) em sangue total, os níveis de tióis não protéicos (NPSH) em plasma e eritrócitos, bem como, a concentração de vitamina E, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e o conteúdo de proteína carbonil em amostras de soro da população estudada. Os marcadores de danos oxidativos em lipídeos e proteínas, representados pelos níveis de MDA e conteúdo de proteína carbonil mostraram-se elevados nos pacientes quando comparados ao grupo controle. Em relação aos antioxidantes enzimáticos, representados pelas enzimas SOD e CAT, observou-se uma diminuição nas atividades das mesmas nos pacientes com LLA nos grupos RD, IR E MR voltando ao normal no grupo FT. Os antioxidantes não enzimáticos analisados (NPSH em plasma e vitamina E) também se mostraram diminuídos nos pacientes em relação aos controles. Nenhuma diferença nos níveis de NPSH em eritrócitos foi encontrada entre o grupo RD e o grupo controle. Em relação à atividade da AChE, observou-se um aumento nos pacientes do grupo RD em relação aos demais grupos tanto em sangue total quanto em linfócitos. Já, nos grupos IR e MR a atividade da enzima encontrou-se diminuída em relação ao grupo controle. Não houve diferença significativa na atividade da AChE entre o grupo FT e o grupo controle. Os resultados sugerem que na LLA, ocorre acumulação excessiva de espécies reativas levando a depleção ou disfunção das defesas antioxidantes tanto enzimáticas quanto não enzimáticas. Os resultados também revelaram que a atividade da AChE está modificada na LLA, o que pode sugerir o envolvimento desta enzima na modulação da função imune e no desenvolvimento do câncer. Conclui-se então que na LLA ocorrem mudanças sistêmicas, as quais podem ser detectadas pela medida de marcadores periféricos do estresse oxidativo e pela atividade da AChE em linfócitos e sangue total.

Este estudo randomizado, duplo-cego e controlado com placebo avaliou a eficácia do laser de baixa intensidade, infravermelho, na prevenção e tratamento da mucosite em pacientes pediátricos portadores de leucemia linfoblástica aguda (LLA) em uso do agente quimioterápico metotrexato em altas doses (MTX >1g/m2). Os pacientes foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: o grupo teste em que os pacientes receberam aplicação de laser profilático e o grupo controle com laser placebo. Os dois grupos receberam aplicação de laser nos dias D1, D2, D3. Realizada esta fase, os pacientes que desenvolveram mucosite oral tiveram acesso ao tratamento e aqueles que apresentaram mucosa normal foram orientados a retornar à consulta no 8º dia. Concomitante, foi solicitado exame hematológico prévio ao tratamento e no dia D8. Foi também mensurado o nível sérico do MTX 42 horas após a infusão da quimioterapia. Os resultados hematológicos prévios se mostraram satisfatórios e alguns apresentaram alterações no dia D8. No nosso estudo não foi possível comprovar se o nível sérico do MTX tem relação com toxicidade oral. A mucosite foi avaliada segundo a escala WHO e a avaliação da dor pré e pós-tratamento pelas escalas VAS, de faces e comportamental. Mucosite foi observada em 6 pacientes, 4 tratados com laser placebo e 2 tratados com laser profilático. Esta diferença não foi estatisticamente significante (P > 0.5). Os 6 pacientes desenvolveram grau 2 de mucosite oral. Média de laserterapia foi de 5.8 dias. Com relação à sintomatologia dolorosa 2 pacientes não apresentaram dor, 1 paciente apresentou dor moderada, nos outros a sintomatologia foi leve. Os resultados deste estudo demonstraram que o laser 780nm não foi eficaz na prevenção da mucosite oral mas constatamos o potencial efeito do laser terapêutico no controle da mucosite oral e da dor em pacientes pediátricos portadores LLA. / This randomized, double-blind, placebo-controlled study evaluated the efficacy of low intensity laser in the prevention and treatment of oral mucositis in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia undergoing chemotherapy with highdose methotrexate (MTX>1g/m2). The patients were divided into two groups: the test group, the patients who received prophylactic low-intensity laser, and the control group who received laser without radiation (sham laser). Nor the clinician neither the patients knew which type of laser was being used until the end of the trial. The patients of each group received laser application in the days D1, D2, D3. After that, the patients who developed oral mucositis were treated with low-intensity laser and those without oral mucositis were instructed to return on day 8 for clinical reevaluation. Concomitantly, patients were screening for previous hematological examination and in the day D8. The plasma level of MTX was measured at 42 hours starting the infusion. Hematological analyses revealed no abnormality and other with alterations. In this present study, there was no correlation between the plasma level MTX and oral toxicity. Mucositis was evaluated by the WHO scale and pain was measured by VAS, face scales and behavioral. Six patients developed oral mucositis and had grade 2 by WHO scale. There was no significant difference between laser group and the control group (P > 0.5). Average time of therapeutic laser was 5.8 days. Laser applications reduced oral pain. Low-intensity laser 780 nm wavelength showed no efficient method in the prevention of oral mucositis but produced some benefits in the control of the oral mucositis and pain in pediatric patients of LLA after chemotherapy.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:11:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao raphael nunes leles.pdf: 1578040 bytes, checksum: 8952ece9da3998627179afb8493faa03 (MD5) Previous issue date: 2008-09-29 / Methotrexate (MTX) is a drug with high toxicity, used in high doses for the treatment of neoplasic diseases. Therapeutic concentrations preserve the effectiveness, but higher values increases the toxicity risks. The aim of this article was to develop and validate an analytical method on HPLC-PDA to measure methotrexate plasma levels on children affected by LLA. The analytical method was performed with a mobile phase composed by acetic acid 0,1%:methanol:acetonitrile in concentration gradients during the analysis. The validation parameters were: specificity, relative recovery, lowest (LLQ) and higher limits of quantification, precision (Intra-assay standard deviation), accuracy, log time stability, calibration curve and co-validation. Biological samples were collected from 7 patients hospitalized on Araújo Jorge Hospital totaling 42 blood samples used to estimate the pharmacokinetic parameters. As results we obtained a method with a flow-rate of 1.5 mL/min, the methotrexate and teophyllin detection were observed in 304 and 271 nm respectively, in 13 minutes of carryover. The relative recovery was about 71%, LLQ about 0,1 &#956;g/Ml. Intra-assay standard deviation was 11% for LLQ and no more than 14,88% for other concentrations; the accuracy was 97,63% and the long time stability was confirmed in human blood with a -20º C freezing. As pharmacokinetic parameters, we estimate the total clearance (3,03 L/h), constant of elimination (0,2586 h-1), a distribution volume of 12,57 L, half-life time as 2,73 h and median AUCT (for area under the time vs concentratrion curve) of 626,493 &#956;gh/mL. As conclusion, the analytical method proved to be high efficient to detect and to quantify the drug on human blood, and we observed the high variability of the pharmacokinetic parameters, showing the importance of realize the therapeutic drug monitoring. / O metotrexato (MTX) é um fármaco de elevada toxicidade utilizado em doses geralmente elevadas, no tratamento de neoplasias. Concentrações terapêuticas preservam a eficácia, porém valores acima elevam o risco de intoxicação. Assim o presente trabalho objetivou desenvolver e validar uma técnica analítica em HPLCPDA para dosagem do metotrexato em plasma, e monitorar seus níveis plasmáticos em crianças com LLA. A técnica analítica foi desenvolvida apresentando fase móvel contendo ácido acético 0,1%:acetonitrila:metanol em diferentes proporções durante a corrida. Utilizamos como parâmetros de validação a especificidade, recuperação, limites inferior (LIQ) e superior (LSQ) de quantificação, precisão, exatidão, estabilidade de longa duração, curva de calibração e co-validação. O material utilizado na realização desse trabalho foi coletado de pacientes Internados no Hospital Araújo Jorge (ACCG), totalizando 42 amostras de plasma, provenientes de 7 pacientes, para estabelecimento de parâmetros farmacocinéticos. Como resultados obtivemos como condições de análise um fluxo de 1,5 mL/min, com detecção do metotrexato e da teofilina em 304 e 271 nm respectivamente, em 13 minutos de corrida. A técnica analítica apresentou recuperação média de 71%, um LIQ de 0,1 &#956;g/mL, como precisão um coeficiente de variação médio de 11% para o LIQ, e máximo de 14,88% para os demais pontos, valor de exatidão médio de 97,63%, demonstramos a estabilidade do fármaco em plasma humano quando congelado a -20°C, não obtendo variação maior do que 15% na co-validação. Como parâmetros farmacocinéticos obtivemos clearance total médio de 3,03 L/h, constante de eliminação média de 0,2586 h1, volume de distribuição médio de 12,57 L, tempo médio de meia vida de 2,73 horas, área sob a curva média equivalendo a 626,493 &#956;gh/mL. Como conclusão, a técnica analítica mostrou-se bastante eficaz para a detecção e quantificação do fármaco, e observamos uma grande variabilidade dos parâmetros farmacocinéticos, o que comprova a necessidade de se realizar a monitoração terapêutica.

Introduction:Acute Lymphoid Leukemia (ALL) is the most frequent cancer in young people and, if analyzed together with Non-Hodgkin Lymphoma (NHL), we find that they are responsible for at least one third of all cases of childhood cancer. Present-day therapeutic protocols include high doses of glucocorticoids (GC), drugs associate with high potential for elevating intraocular pressure (IOP) and, consequently provoking damage to the fibers of the optic nerve fibers, a pathology classified as cortisone glaucoma. In genetically susceptible patients, ocular hypertension normally occurs some weeks into the use of a steroid but is generally reversible with the suspension of its use. However, depending on the levels of ocular pressure and the duration of ocular hypertension, it can result in optic neuropathology and, in extreme cases, blindness. Since ALL and NHL are oncological disorders with elevated potential for cure of young people with have high life expectancy, the identification of eventual long-term treatment complications could give support to a delineation still lacking in scientific literature, that is, an ophthalmological protocol for these cases. Objective: The aim of this study was to evaluate the behavior of intraocular pressure in pediatric patients treated with GC for the acute lymphoproliferative neoplasias that are most common during childhood and adolescence.Methods: A systematic review of the theme was carried out, followed by a descriptive, prospective study of children and adolescents of both sexes who were diagnosed with ALL and NHL, and who were registered for beginning chemotherapeutic treatment at the Dr. Oswaldo Leite Oncology Center of Sergipe. The inclusion criteria were: diagnosis of ALL or NHL-T confirmed by immunophenotyping of bone marrow or peripheral blood samples (ALL), or immunohistochemistry of material obtained by open biopsy (NHL); age less than 19; no previous chemotherapy; absence of previous diagnosis compatible with glaucoma or any other disorder envolving change in intraocular pressure; no systemic use of GC in the six months preceding diagnosis of ALL or NHL. Patients whose evaluation of IOP might not have been technically adequate, as well as those who expired during the follow-up period, were excluded. Intraocular pressure was measured before treatment (D0), on the eighth (D8), the fourteenth (D14) and twentieth (D28) treatment day. The IOP results above 21 mm Hg were considered to be ocular hypertension. Results: Results of the systematic review indicate the need for new studies, for the review found a total of only three published articles whose results varied between total control of ocular pressure and visual function, to irreversible blindness. The results of our field research involved 15 patients, two of them with ocular hypertension, and with a statistically significant difference of measurements of IOP between D0 vs D8 and D0 vs D14 (p=0.013). Conclusion: The possibility of silent ocular hypertension, with the consequent risk of irreversible blindness, indicates the need to assess the introduction of a protocol for verification of IOP in patients recently diagnosed with ALL and NHL, including weekly exams, at least until the complete cessation of GC use. / Introdução: Leucemia Linfóide Aguda (ALL) é o câncer mais comumente encontrado entre os jovens e, se analisada em conjunto com o Linfoma não-Hodgkin (NHL), são responsáveis por pelo menos um terço dos casos de câncer infantil. Protocolos terapêuticos atuais incluem altas doses de glicocorticóides (GC), droga associada com alto potencial para elevar a pressão intraocular (IOP) e, consequentemente, provocar danos às fibras do nervo óptico, patologia classificada como glaucoma cortisônico. A hipertensão ocular geralmente ocorre com algumas semanas de uso de GC em pacientes geneticamente susceptíveis, mas é geralmente reversível com a descontinuação do tratamento. Entretanto, dependendo dos níveis pressóricos oculares e do tempo de elevação, pode resultar em neuropatia óptica e, em situações extremas, em cegueira. Por serem a ALL e o NHL doenças oncológicas com potencial elevado de cura, em indivíduos jovens com elevada expectativa de vida, a identificação de eventuais complicações de longo prazo decorrentes do tratamento poderá subsidiar o delineamento de um protocolo oftalmológico para esses casos, ainda inexistente na literatura científica. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento da pressão intraocular em pacientes pediátricos portadores das mais frequentes neoplasias linfoproliferativas agudas da infância e adolescência, e que são tratados com GC. Métodos: Foi feita uma revisão sistemática sobre o tema estudado, seguida por um estudo descritivo, prospectivo, em crianças e adolescentes de ambos os sexos, com diagnóstico de ALL e NHL, matriculados para início de tratamento quimioterápico no Centro de Oncologia de Sergipe Dr. Oswaldo Leite. Os critérios de inclusão foram: diagnóstico de ALL ou NHL-T, confirmada por imunofenotipagem de amostra de medula óssea ou sangue periférico (ALL) ou imuno-histoquímica de material obtido por biópsia aberta (NHL); idade menor de 19 anos; sem quimioterapia anterior; ausência de diagnóstico prévio compatível com glaucoma ou doença anterior relacionada a qualquer mudança na pressão intra-ocular; não uso sistêmico de GC nos seis meses anteriores ao diagnóstico da ALL ou NHL. Pacientes cuja avaliação da pressão intraocular (PIO) pode não ter sido tecnicamente adequada e os que faleceram durante o período de seguimento foram excluídos. Realizaram-se medidas de pressão intraocular antes do tratamento (D0), no oitavo (D8), décimo quarto (D14) e vigésimo (D28) dias de tratamento. Os resultados da PIO acima de 21 mm de Hg foram considerados como hipertensão ocular Resultados: Os resultados da revisão sistemática apontaram para necessidade de novos estudos, limitando-se a um total de três publicações de relatos de casos envolvendo sete pacientes, com resultados variando de total controle da pressão ocular e conservação da função visual, até cegueira irreversível. Os resultados da pesquisa de campo envolveram 15 pacientes, com dois casos de hipertensão ocular e com diferença estatisticamente significativa entre as médias de PIO entre D0 vs D8 e D0 vs D14 (p = 0,013). Conclusão: A possibilidade de hipertensão ocular silenciosa, com o consequente risco de cegueira irreversível, indica a necessidade de se avaliar a introdução de um protocolo para verificação da IOP em pacientes jovens recentemente diagnosticados com ALL e NHL, incluindo exames semanais, pelo menos até a retirada completa do GC.

Introdução: A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a neoplasia pediátrica com maior incidência no mundo. Sua etiologia é resultante de múltiplas interações entre herança genética e exposição a agentes ambientais potencialmente carcinogênicos nos períodos pré-natal, nascimento e pós-natal. O parto cesáreo tem sido apontado como fator de risco para LLA em crianças. No Brasil, país com altas taxas de cesariana, são poucos os estudos que avaliaram a associação de cesariana com LLA na infância. Objetivos: Investigar a associação de cesariana e condições pré-natal e pós-natal com LLA em crianças nascidas no estado de São Paulo. Métodos: Estudo caso-controle de base populacional. Os casos de LLA, crianças nascidas no estado de São Paulo a partir de 1999, foram recrutados em oito hospitais de 2003 a 2009. Os controles foram emparelhados com os casos por sexo, idade e cidade de nascimento. As informações utilizadas nesse estudo foram obtidas em entrevistas com as mães ou responsáveis pelas crianças por meio de questionário estruturado. Informações adicionais foram adquiridas no banco de Declarações de Nascidos Vivos (DNV), que integra o Sistema de Informações de Nascidos Vivos (SINASC) da Secretaria Municipal de Saúde de São Paulo e do Ministério da Saúde. Após o linkage probabilístico dos bancos de dados, a amostra final comporta 133 casos e 459 controles, relação de 3,4 controles por caso. Análises de regressão logística não condicional e condicional foram conduzidas para estimar a associação entre cesariana, condições pré-natal e pós-natal e LLA, com estimava dos odds ratios (OR) e respectivos intervalos de 95% de confiança (IC 95%). Três modelos de regressão logística foram elaborados: 1) ajuste por idade e sexo da criança, idade e escolaridade da mãe; 2) ajuste pelas variáveis anteriores, mais raça e número de consultas; 3) ajuste por todas as variáveis anteriores e a inclusão de idade gestacional e peso ao nascer. Resultados: A análise de regressão logística não condicional, com base no Modelo 2, revelou discreto risco de LLA na exposição à cesariana (OR=1,10; IC95% 0,71-1,70), proteção na condição de mãe com 12 ou mais anos de escolaridade (OR=0,46; IC95% 0,24-0,89) e idade da criança de 6 a 8 anos no diagnóstico (OR=0,30; IC95% 0,13-0,67). Resultados similares foram observados na análise de regressão logística condicional no Modelo 2: cesariana (OR=1,18; IC95% 0,69-2,00), mães com 12 ou mais anos de escolaridade (OR=0,56; IC95% 0,25-1,24). Conclusões: Há uma tênue associação entre cesariana e LLA na infância, sem significância estatística. Alta escolaridade da mãe e crianças na faixa etária entre 6 e 8 anos foram fatores de proteção para LLA. Crianças com síndrome de Down apresentaram seis vezes o risco de LLA. Os resultados obtidos por análise regressão logística condicional foram similares aos da regressão logística não condicional. / Introduction: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common pediatric neoplasia worldwide. Its etiology results from multiple interactions between genetic inheritance and exposure to potentially carcinogenic environmental agents during the prenatal, birth, and postnatal periods. Cesarean section has been identified as a risk factor for ALL in children. In Brazil, a country with high Cesarean section rates, few studies have evaluated the association of Cesarean section with ALL in childhood. Objectives: To investigate the association of Cesarean section, prenatal and postnatal conditions with ALL in children born in the state of São Paulo. Methods: Population-based case-control study. The cases of ALL, children born in the state of São Paulo from 1999, were recruited in eight hospitals from 2003 to 2009. Controls were matched with cases by sex, age and city of birth. The information used in this study were obtained through interviews with mothers or guardians of the children, using a structured questionnaire. Additional information were get from the Live Births Database, stored in the Live Birth Information System at the São Paulo Municipal Health Department and at the Brazilian Ministry of Health. After the databases probabilistic linkage, the final sample entails 133 cases and 459 controls, 3.4 controls per case ratio. Non-conditional and conditional logistic regression analyzes were conducted to estimate the association between cesarean section, pre- and postnatal conditions, and ALL with estimation of odds ratios (OR) and respective 95% confidence intervals (95% CI). Three models of logistic regression were elaborated: 1) adjustment by age and sex of the child, age and schooling of the mother; 2) adjustment for the previous variables, more race and number of queries; 3) adjustment for all previous variables and the inclusion of gestational age and birth weight. Results: The nonconditional logistic regression analysis, based on Model 2, revealed a slight risk of ALL on cesarean section exposure (OR = 1.10, 95% CI 0.71-1.70), protection on the condition of mothers with 12 or more years of schooling (OR = 0.46, 95% CI 0.24-0.89), and age of child from 6 to 8 years at diagnosis (OR = 0.30, 95% CI, 0.13-0, 67). In the conditional logistic regression analysis in Model 2, similar results were observed: cesarean (OR = 1.18, 95% CI 0.69-2.00), mothers with 12 or more years of schooling (OR = 0.56, 95% CI, 0.25-1.24). Conclusions: There is a weak association between cesarean section and ALL in childhood, with no statistical significance. Mother with high education level and children in the age range between 6 and 8 years were protective factors for ALL. Children with Down syndrome had a six-fold risk of ALL. The results obtained by conditional logistic regression analysis were similar to those of non-conditional logistic regression.

A crisantaspase é uma enzima do tipo asparaginase (ASNase) produzida pela bactéria Erwinia chrysanthemi e utilizada como biofármaco no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) em casos de hipersensibilidade à ASNase de E. coli. As principais desvantagens deste biofármaco são a curta meia-vida (10 horas) e imunogenicidade. Nesse sentido, sua forma peguilada (PEG-crisantaspase) não só reduziria o efeito imunogênico, como também melhoraria a meia-vida plasmática. Atualmente, somente a ASNase de E. coli está disponível comercialmente na forma peguilada e essa, por ter sido uma das primeiras proteínas a serem peguiladas, é resultado de um processo de peguilação aleatória em resíduos de lisina. Portanto, apresenta alto grau de polidispersão em relação à quantidade de cadeias de PEG ligadas à enzima. Nesse trabalho desenvolvemos um processo de obtenção de crisantaspase peguilada de maneira sítio-específica, no grupamento N-terminal (PEG-crisantaspase). A crisantaspase foi obtida de forma recombinante na cepa E. coli BL21, cultivada em agitador metabólico e biorreator, em meio Luria Bertani. A produtividade volumétrica no biorreator aumentou 37% em comparação com o agitador metabólico (460 e 335 U·L-1·h-1 respectivamente). A crisantaspase foi recuperada por choque osmótico e purificada por cromatografia de troca catiônica (coluna HiTrap SP FF, 5 mL, eluição em pH 7,5), apresentando atividade específica de 694 U·mg-1, fator de purificação de 31 e rendimento de 69%. A crisantaspase purificada foi peguilada com mPEG-NHS 10 kDa, em tampão fosfato 100 mM, 22 °C, razão molar enzima:PEG 1:50 durante 30 min e sob diferentes valores de pH (6,5-9,0). O melhor rendimento de peguilação N-terminal (50%) foi em pH 7,5 com menor formação de estruturas poli-peguiladas (7%). A PEG-crisantaspase foi isolada por cromatografia de exclusão molecular, retendo 50% da atividade específica (357 U·mg-1) com valor de kM três vezes maior do que o da crisantaspase (150 e 48,5 &#181;M respectivamente). Entretanto, apresentou maior estabilidade em altas temperaturas. Em duas semanas, a crisantaspase perdeu 93% de sua atividade específica enquanto que a PEG-crisantaspase foi estável por 20 dias. Portanto, a enzima PEG-crisantaspase desenvolvida representa uma alternativa promissora para o tratamento da LLA. / Crisantaspase is an asparaginase enzyme (ASNase) produced by Erwinia chrysanthemi bacterium and used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in case of hypersensivity to E. coli ASNase. The main disadvantages of this biopharmaceutical are the short half-life (10 hours) and immunogenicity. In this sense, its PEGylated form (PEG-crisantaspase) could not only reduce the immunogenic effect but also improve plasma half-life. Currently, only E. coli ASNase is commercially available in its pegylated form. Since ASNase was one of the first proteins to be pegylated, it corresponds to a random PEGylation process on lysine residues and consequently preparations are highly polydisperse. In this work we developed a process to obtain a site-specific N-terminal PEGylated crisantaspase (PEG-crisantaspase). Crisantaspase was recombinantly expressed in E. coli BL21 strain, grown in shaker and bioreactor, in Luria Bertani medium. Volumetric productivity in bioreactor increased 37% compared to shaker conditions (460 and 335 U·L-1·h-1 respectively). Crisantaspase was extracted by osmotic shock and purified by cation exchange chromatography (HiTrap SP FF column, 5 mL, elution at pH 7.5), presenting specific activity of 694 U·mg-1,31 purification fold and an yield of 69%. Purified crisantaspase was PEGylated with 10 kDa mPEG-NHS in 100mM phosphate buffer, 22°C, enzyme:PEG molar ratio of 1:50 for 30 min, and at different pH values (6.5-9.0). The highest N-terminal pegylation yield (50%) was at pH 7.5 with less poly-PEGylated forms (7%). PEG-crisantaspase was purified by size-exclusion chromatography, retaining 50% of specific activity (357 U·mg-1) with a kM value 3 times higher than crisantaspase (150 and 48,5 &#181;M respectively). Nonetheless, PEG-crisantaspase was found to be more stable at high temperatures and over the time. In two weeks, crisantaspase lost 93% of its specific activity, while PEG-crisantaspase was stable for 20 days. Therefore, the novel PEG-crisantaspase enzyme developed represents a promising alternative for the treatment of ALL.

A crisantaspase é uma enzima do tipo asparaginase (ASNase) produzida pela bactéria Erwinia chrysanthemi e utilizada como biofármaco no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) em casos de hipersensibilidade à ASNase de E. coli. As principais desvantagens deste biofármaco são a curta meia-vida (10 horas) e imunogenicidade. Nesse sentido, sua forma peguilada (PEG-crisantaspase) não só reduziria o efeito imunogênico, como também melhoraria a meia-vida plasmática. Atualmente, somente a ASNase de E. coli está disponível comercialmente na forma peguilada e essa, por ter sido uma das primeiras proteínas a serem peguiladas, é resultado de um processo de peguilação aleatória em resíduos de lisina. Portanto, apresenta alto grau de polidispersão em relação à quantidade de cadeias de PEG ligadas à enzima. Nesse trabalho desenvolvemos um processo de obtenção de crisantaspase peguilada de maneira sítio-específica, no grupamento N-terminal (PEG-crisantaspase). A crisantaspase foi obtida de forma recombinante na cepa E. coli BL21, cultivada em agitador metabólico e biorreator, em meio Luria Bertani. A produtividade volumétrica no biorreator aumentou 37% em comparação com o agitador metabólico (460 e 335 U·L-1·h-1 respectivamente). A crisantaspase foi recuperada por choque osmótico e purificada por cromatografia de troca catiônica (coluna HiTrap SP FF, 5 mL, eluição em pH 7,5), apresentando atividade específica de 694 U·mg-1, fator de purificação de 31 e rendimento de 69%. A crisantaspase purificada foi peguilada com mPEG-NHS 10 kDa, em tampão fosfato 100 mM, 22 °C, razão molar enzima:PEG 1:50 durante 30 min e sob diferentes valores de pH (6,5-9,0). O melhor rendimento de peguilação N-terminal (50%) foi em pH 7,5 com menor formação de estruturas poli-peguiladas (7%). A PEG-crisantaspase foi isolada por cromatografia de exclusão molecular, retendo 50% da atividade específica (357 U·mg-1) com valor de kM três vezes maior do que o da crisantaspase (150 e 48,5 &#181;M respectivamente). Entretanto, apresentou maior estabilidade em altas temperaturas. Em duas semanas, a crisantaspase perdeu 93% de sua atividade específica enquanto que a PEG-crisantaspase foi estável por 20 dias. Portanto, a enzima PEG-crisantaspase desenvolvida representa uma alternativa promissora para o tratamento da LLA. / Crisantaspase is an asparaginase enzyme (ASNase) produced by Erwinia chrysanthemi bacterium and used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in case of hypersensivity to E. coli ASNase. The main disadvantages of this biopharmaceutical are the short half-life (10 hours) and immunogenicity. In this sense, its PEGylated form (PEG-crisantaspase) could not only reduce the immunogenic effect but also improve plasma half-life. Currently, only E. coli ASNase is commercially available in its pegylated form. Since ASNase was one of the first proteins to be pegylated, it corresponds to a random PEGylation process on lysine residues and consequently preparations are highly polydisperse. In this work we developed a process to obtain a site-specific N-terminal PEGylated crisantaspase (PEG-crisantaspase). Crisantaspase was recombinantly expressed in E. coli BL21 strain, grown in shaker and bioreactor, in Luria Bertani medium. Volumetric productivity in bioreactor increased 37% compared to shaker conditions (460 and 335 U·L-1·h-1 respectively). Crisantaspase was extracted by osmotic shock and purified by cation exchange chromatography (HiTrap SP FF column, 5 mL, elution at pH 7.5), presenting specific activity of 694 U·mg-1,31 purification fold and an yield of 69%. Purified crisantaspase was PEGylated with 10 kDa mPEG-NHS in 100mM phosphate buffer, 22°C, enzyme:PEG molar ratio of 1:50 for 30 min, and at different pH values (6.5-9.0). The highest N-terminal pegylation yield (50%) was at pH 7.5 with less poly-PEGylated forms (7%). PEG-crisantaspase was purified by size-exclusion chromatography, retaining 50% of specific activity (357 U·mg-1) with a kM value 3 times higher than crisantaspase (150 and 48,5 &#181;M respectively). Nonetheless, PEG-crisantaspase was found to be more stable at high temperatures and over the time. In two weeks, crisantaspase lost 93% of its specific activity, while PEG-crisantaspase was stable for 20 days. Therefore, the novel PEG-crisantaspase enzyme developed represents a promising alternative for the treatment of ALL.

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.