La pollution atmosphérique particulaire constitue l'un des facteurs de risques impliqués dans l'incidence élevée de pathologies respiratoires et cardio-vasculaires. Afin d'intégrer les variations liées aux sources d'émission et aux saisons, des aérosols atmosphériques particulaires (PM₂.₅) ont été prélevés à Dunkerque sous influence urbaine (U) et/ou industrielle (I) et à Rubrouck sous influence rurale (R), au printemps-été 2008 (1) et à l'automne 2009 (2). La caractérisation physico-chimique des six échantillons particulaires a montré une granulométrie fine (79 à 98 % < PM₂.₅) et des aires spécifiques de 3 à 6 m²/g. Leurs concentrations en espèces ioniques différaient, comme celles en éléments métalliques majoritaires (Fe > Al > Mn > Zn > Cu > Ti ; I > U > R). Des différences ont également été observées quant à leurs concentrations en éléments organiques (HAP : I2 > U2 > I1 > U1 > R2 > R1 ; PCDD/F et PCB : I2 > I1 > U2 > U1 > R1 > R2) ; eu égard des influences considérées (PMindustriel > PMurbain > PMrural), et des saisons de prélèvements. Après évaluation de la cytotoxicité globale in vitro des échantillons particulaires, dans les cellules épithéliales bronchiques humaines (BEAS-2B), nous avons montré la capacité des composés organiques absorbés à la surface de ces particules à induire l'expression génique des enzymes de métabolisation (CYP 1A1 et 1B1, et à moindre mesure NQO1). De plus, la production excessive des ERO intracellulaires dans les cellules BEAS-2B exposées aux six PM₂.₅ a induit des dommages oxydatives (production de MDA, formation de 8-OHdG et/ou altération du statut de glutathion). Un développement d'une réponse inflammatoire excessive a aussi été observé par l'expression et/ou la sécrétion significative des cytokines (notamment IL-6 et IL-8). Ces réponses ont été observées d'une manière dose et/ou temps dépendante. En revanche, nous n'avons pu observer de mutations géniques au niveau des acteurs principaux de la voie EGFR/KRAS/BRAF. / Particulate air pollution constitutes one of the major risk factors implicated in the high incidence of respiratory and cardio-vascular pathologies. In order to integrate the variation linked to emission sources and seasons, atmospheric particulate matter (PM₂.₅) were collected at Dunkerque under urban (u) and/or industrial influence (I) and at Rubrouck (R) under rural influence, in spring-summer 2008 and autumn-winter 2009. The physico-chemical characterization of the six particulate samples has shown a fine granulometry (79 to 98 % < PM₂.₅) and a specific surface of 3 to 6 m²/g. Their concentrations in ionic species as well as in major metallic elements were different (Fe > Al > Mn > Zn > Cu > Ti ; I > U > R). Differences were also been observed in their organic element constitution (PAH : I2 > U2 > I1 > U1 > R2 > R1 ; PCDD/F and PCB : I2 > I1 > U2 > U1 > R1 > R2) with respect to considered influences (PMindustriel > PMurban > PMrural) and sampling seasons. After in vitro evaluation of particulate samples global cytotoxicity in human bronchial epithelial cells (BEAS-2B), we had shown the capacity of the organic components absorbed to the surface of these particles to induce gene expression of xenobiotic-metabolizing enzymes (CYP 1A1 and 1B1, and to a lesser extent, NQO1). Moreover, excessive intracellular production of reactive oxygen species within BEAS-2B cells exposed to the six PM₂.₅ samples induced oxidative damage (MDA production, 8-OHdG formation and/or glutathione status alteration). There was also a development of an excessive inflammatory response based on statistically significant increases in gene expression and/or protein secretion of cytokines (notably IL-6 and IL-8). These obtained responses were dose and/or time dependant. However, we couldn't observe mutations in the principal acting genes in the pathway EGFR/KRAS/BRAF.

La leucémie myéloïde aigüe (LMA) est la forme de leucémie la plus fréquente chez l’adulte au Canada. Bien que de nombreux réarrangements chromosomiques récurrents aient été identifiés chez les patients LMA, près de la moitié des cas présentent un caryotype normal (LMA-CN). L’étude de la LMA-CN in vitro est rendue difficile par le fait que la survie des cellules primaires de patients est défectueuse sur le long terme et que les lignées cellulaires leucémiques ont un caryotype hautement anormal. En 2009, Munker et son équipe ont établi une nouvelle lignée cellulaire, CG-SH, ayant la particularité d’avoir un caryotype normal. L’objectif principal de ce projet d’étude est de caractériser plus en détail ce nouveau modèle d’étude. Nous avons identifié l’ensemble des variants génétiques présents dans CG-SH grâce au séquençage du génome entier. Les variants susceptibles de participer à la leucémogénèse ont été isolés, tels que des insertions détectées dans EZH2 et GATA2, et de nombreux variants faux-sens détectés dans des gènes pertinents pour la LMA. Nous avons montré que les cellules CG-SH sont sensibles à l’effet prolifératif d’une combinaison de cytokines, qui agissent sur le comportement des cellules en modifiant l’expression des gènes associés à la régulation de la prolifération, de l’apoptose et de la différentiation. De plus, les cytokines diminuent le taux de nécrose des cellules en culture sur le court terme. La présente étude a permis d’approfondir notre connaissance sur les caractéristiques moléculaires de la lignée cellulaire CG-SH, un nouveau modèle d’étude in vitro de la LMA-CN. / Acute myeloid leukemia (AML) is the most frequent form of leukemia in the adult population in Canada. Although many recurrent chromosomal rearrangements have been identified in AML, almost half of all adult patients will present with a normal karyotype (NK-AML). The in vitro study of NK-AML is difficult because the long-term survival of primary patient samples is deficient and AML cell lines have a highly abnormal karyotype. In 2009, Munker and collegues established a new cell line, CG-SH, with the advantage of having a normal karyotype. The main goal of this research project is to further characterize this new model system. We identified all the genetic variants present in the CG-SH cells using whole genome sequencing. We also isolated the variants that are susceptible to participate to leukemogenesis, including the insertions detected in EZH2 and GATA2, and several missense mutations occurring in relevant genes for AML. We found that a combination of cytokines promotes the proliferation of CG-SH cells, and that cytokines act on the cells behavior through expression changes of the genes involved in the regulation of proliferation, apoptosis and differentiation. Moreover, cytokines trigger a decrease of the necrotic rate of CG-SH on the short-term. The current study allowed us to better appreciate molecular characteristics of the CG-SH cell line, a new model to study NK-AML in vitro.

L’émergence des Mégadonnées (« Big Data ») en biologie moléculaire, surtout à travers la transcriptomique, a révolutionné la façon dont nous étudions diverses disciplines telles que le processus de développement du médicament ou la recherche sur le cancer. Ceci fut associé à un nouveau concept, la médecine de précision, dont le principal but est de comprendre les mécanismes moléculaires entraînant une meilleure réponse thérapeutique chez le patient. Cette thèse est à mi-chemin entre les études pharmaco — et toxicogénomiques expérimentales, et les études cliniques et translationnelles. Le but de cette thèse est surtout de montrer le potentiel et les limites de ces jeux de données et leur pertinence pour la découverte de biomarqueurs de réponse ainsi que la compréhension des mécanismes d’action/toxicité de médicaments, en vue d’utiliser ces informations à des fins thérapeutiques. L’originalité de cette thèse réside dans son approche globale pour analyser les plus larges jeux de données pharmaco/toxicogénomiques publiés à ce jour et ceci pour : 1) Aborder la notion de biomarqueurs de réponse aux médicaments en pharmacogénomique du cancer, en étudiant les facteurs discordants entre deux grandes études publiées en 2012; 2) Comprendre le mécanisme d’action des médicaments et construire une taxonomie performante en utilisant une approche intégrative; et 3) Créer un répertoire toxicogénomique à partir des hépatocytes humains, exposés à différentes classes de médicaments et composés chimiques. Mes contributions principales sont les suivantes : • J’ai développé une approche bioinformatique pour étudier les facteurs discordants entre deux grandes études pharmacogénomiques et suggérées que les différences observées émergeaient plutôt de l’absence de standardisation des mesures pharmacologiques qui pourrait limiter la validation de biomarqueurs de réponse aux médicaments. • J’ai implémenté une approche bioinformatique qui montre la supériorité de l’intégration tenant en compte des différents paramètres pour les médicaments (structure, cytotoxicité, perturbation du transcriptome) afin d’élucider leur mécanisme d’action (MoA). • J’ai développé un pipeline bioinformatique pour étudier le niveau de conservation des mécanismes moléculaires entre les études toxicogénomiques in vivo et in vitro démontrant que les hépatocytes humains sont un modèle fiable pour détecter les produits toxiques hépatocarcinogènes. Au total, nos études ont permis de fournir un cadre de travail original pour l’exploitation de différents types de données transcriptomiques pour comprendre l’impact des produits chimiques sur la biologie cellulaire. / The emergence of Big Data in molecular biology, especially through the study of transcriptomics, has revolutionized the way we look at various disciplines, such as drug development and cancer research. Big data analysis is an important part of the concept of precision medicine, which primary purpose is to understand the molecular mechanisms leading to better therapeutic response in patients. This thesis is halfway between pharmaco-toxicogenomics experimental studies, and clinical and translational studies. The aim of this thesis is mainly to show the potential and limitations of these studies and their relevance, especially for the discovery of drug response biomarkers and understanding the drug mechanisms (targets, toxicities). This thesis is an original work since it proposes a global approach to analyzing the largest pharmaco-toxicogenomic datasets available to date. The key aims were: 1) Addressing the challenge of reproducibility for biomarker discovery in cancer pharmacogenomics, by comparing two large pharmacogenomics studies published in 2012; 2) Understanding drugs mechanism of action using an integrative approach to generate a superior drug-taxonomy; and 3) Evaluating the conservation of toxicogenomic responses in primary hepatocytes vs. in vivo liver samples in order to check the feasability of cell models in toxicology studies. My main contributions can be summarized as follow: - I developed a bioinformatics pipeline to study the factors that trigger (in)consistency between two major pharmacogenomic studies. I suggested that the observed differences emerged from the non-standardization of pharmacological measurements, which could limit the validation of drug response biomarker. - I implemented a bioinformatics pipeline that demonstrated the superiority of the integrative approach, since it takes into account different parameters for the drug (structure, cytotoxicity, transcriptional perturbation) to elucidate the mechanism of action (MoA). - I developed a bioinformatics pipeline to study the level of conservation of toxicity mechanisms between the in vivo and in vitro system, showing that human hepatocytes is a reliable model for hepatocarcinogens testing. Overall, our studies have provided a unique framework to leverage various types of transcriptomic data in order to understand the impact of chemicals on cell biology.

Le circovirus porcin de type 2 (PCV2) est un pathogène majeur pour l’industrie porcine et est associé à une longue liste de maladies associées au circovirus porcin (MACVP). Les premières tentatives pour reproduire ces maladies ont montré que le virus doit être combiné à d’autres agents pathogènes du porc ou à différents stimulants du système immunitaire. De ces agents, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est celui qui est le plus souvent co-isolé avec le PCV dans les fermes. Une grande partie des efforts faits pour étudier les interactions entre ces deux virus ont été menés in vivo. Les interactions in vitro ont jusqu’à maintenant été peu étudiées du fait qu’il n’existe pas de modèle cellulaire permettant la réplication efficace des deux virus. L’objectif de ce projet était donc de développer un modèle cellulaire propice à la réplication des deux virus et d’étudier leur interaction en co-infection. Une lignée cellulaire provenant de la trachée d’un porcelet nouveau-né (NPTr), permissive au PCV, a été génétiquement modifiée pour exprimer la protéine CD163, un récepteur majeur du VSRRP. Ce projet a montré que cette nouvelle lignée cellulaire (NPTr-CD163) est permissive au VSRRP ainsi qu’à plusieurs génotypes de PCV (PCV1, PCV2a, PCV2b et PCV1/2a). De plus, les résultats obtenus lors d’infections mixtes suggèrent que la réplication du VSRRP et du PCV conditionne de façon génotype-dépendante celle du PCV puisque la réplication du PCV1 est inhibée en présence de VSRRP, alors que celle du PCV2b est significativement augmentée dans les mêmes conditions. Ni la mortalité cellulaire, ni la réponse cellulaire en cytokines n’a permis d’expliquer ces résultats. La modulation de la réplication du PCV par le VSRRP serait donc liée à un mécanisme spécifique qui demeure inconnu. De plus, cet effet varierait en fonction du génotype de PCV. / Porcine circovirus (PCV) type 2 (PCV2) is a major pathogen in the swine industry and has been described as the causative agent of a long list of conditions under the designation of porcine circovirus-associated diseases (PCVAD). Attempts to replicate PCVAD initially failed, as it was discovered that an immune trigger could facilitate the reproduction of clinical signs, either by co-infecting with other swine pathogens or using immune stimulants. Of these, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the most frequently co-isolated agent in the field. Most effort has been made to understand this interaction in vivo since most in vitro cellular models lack the ability to efficiently replicate both viruses. To answer the lack of an in vitro model, we developed a cell line that allows the replication of both PRRSV and PCV. A neonate porcine tracheal cell line (NPTr) was genetically modified to stably express CD163 (NPTr-CD163), a major PRRSV receptor. NPTr-CD163 cells were able to replicate all PCV genotypes (PCV1, PCV1/2a, PCV2a and PCV2b) and PRRSV. A significant effect of PRRSV on PCV replication was found to be genotype dependent, as PCV1 replication was down regulated in the presence of PRRSV and PCV2b replication was up regulated in the same conditions. Neither cell mortality assays nor cytokine expression analysis were able to provide an explanation for these results. The effect of PRRSV on PCV1 and PCV2b replication is suggestive of a more specific, yet still unknown, mechanism. Furthermore, this effect is PCV-genotype dependant.

Le circovirus porcin de type 2 (PCV2) est un pathogène majeur pour l’industrie porcine et est associé à une longue liste de maladies associées au circovirus porcin (MACVP). Les premières tentatives pour reproduire ces maladies ont montré que le virus doit être combiné à d’autres agents pathogènes du porc ou à différents stimulants du système immunitaire. De ces agents, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est celui qui est le plus souvent co-isolé avec le PCV dans les fermes. Une grande partie des efforts faits pour étudier les interactions entre ces deux virus ont été menés in vivo. Les interactions in vitro ont jusqu’à maintenant été peu étudiées du fait qu’il n’existe pas de modèle cellulaire permettant la réplication efficace des deux virus. L’objectif de ce projet était donc de développer un modèle cellulaire propice à la réplication des deux virus et d’étudier leur interaction en co-infection. Une lignée cellulaire provenant de la trachée d’un porcelet nouveau-né (NPTr), permissive au PCV, a été génétiquement modifiée pour exprimer la protéine CD163, un récepteur majeur du VSRRP. Ce projet a montré que cette nouvelle lignée cellulaire (NPTr-CD163) est permissive au VSRRP ainsi qu’à plusieurs génotypes de PCV (PCV1, PCV2a, PCV2b et PCV1/2a). De plus, les résultats obtenus lors d’infections mixtes suggèrent que la réplication du VSRRP et du PCV conditionne de façon génotype-dépendante celle du PCV puisque la réplication du PCV1 est inhibée en présence de VSRRP, alors que celle du PCV2b est significativement augmentée dans les mêmes conditions. Ni la mortalité cellulaire, ni la réponse cellulaire en cytokines n’a permis d’expliquer ces résultats. La modulation de la réplication du PCV par le VSRRP serait donc liée à un mécanisme spécifique qui demeure inconnu. De plus, cet effet varierait en fonction du génotype de PCV. / Porcine circovirus (PCV) type 2 (PCV2) is a major pathogen in the swine industry and has been described as the causative agent of a long list of conditions under the designation of porcine circovirus-associated diseases (PCVAD). Attempts to replicate PCVAD initially failed, as it was discovered that an immune trigger could facilitate the reproduction of clinical signs, either by co-infecting with other swine pathogens or using immune stimulants. Of these, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the most frequently co-isolated agent in the field. Most effort has been made to understand this interaction in vivo since most in vitro cellular models lack the ability to efficiently replicate both viruses. To answer the lack of an in vitro model, we developed a cell line that allows the replication of both PRRSV and PCV. A neonate porcine tracheal cell line (NPTr) was genetically modified to stably express CD163 (NPTr-CD163), a major PRRSV receptor. NPTr-CD163 cells were able to replicate all PCV genotypes (PCV1, PCV1/2a, PCV2a and PCV2b) and PRRSV. A significant effect of PRRSV on PCV replication was found to be genotype dependent, as PCV1 replication was down regulated in the presence of PRRSV and PCV2b replication was up regulated in the same conditions. Neither cell mortality assays nor cytokine expression analysis were able to provide an explanation for these results. The effect of PRRSV on PCV1 and PCV2b replication is suggestive of a more specific, yet still unknown, mechanism. Furthermore, this effect is PCV-genotype dependant.

Les forces mécaniques, générées par la cellule jouent un rôle crucial dans l'adhésion cellulaire, qui est un processus commun à un grand nombre de lignées cellulaires. Afin de mesurer la champ des forces pendant l'adhérence cellulaire, nous utilisons la microscopie de force de traction, où la cellule adhère à la surface plane d'un substrat souple dans le plan. Les forces sont calculées à partir du champ de déplacement mesuré à l'intérieur du substrat sous la cellule. Nous avons construit le microscope, dans lequel nous utilisons des billes sphériques en polystyrène pour mesurer le champ de déplacement. Les positions des marqueurs sont obtenues en analysant I' image interférentielle des particules. Avec cette technique, nous atteignons une précision nanométrique sur le champ de déplacement des particules, ce qui nous permet d'améliorer la résolution en force de ce type de microscope. Les premières mesures ont été effectuées avec la lignée de cellules cancéreuses SW 480. / Mechanical forces, generated by the cell plays crucial role in cell adhesion - common process for different cell lines. ln order to measure the force map during cellular adhesion, we use Traction Force Microscopy (TFM), where cell adheres to the soft substrate in 20 plane, and the forces are calculated from measured displacement field inside the substrate underneath the cell. We built the microscope, where instead of using fluorescent markers, we use spherical polystyrene beads in order to measure the displacement field. Positions of the markers are obtained by analyzing the interference pattern caused by the beads in bright-field light. With this technique, we reach nanometer accuracy of the microsphere position determination, that, respectively, influence accuracy of the calculated force field. With the microscope first measurements were performed with cancer cell line SW 480.

Les anticorps monoclonaux (mAb) sont d’importants agents thérapeutiques largement utilisés dans le traitement de cancers. Ces protéines recombinantes complexes sont généralement produites dans des lignées cellulaires de mammifères et l’industrie pharmaceutique a développé des procédés robustes permettant d’obtenir de grandes quantités d’anticorps monoclonaux de qualité constante. Une tendance générale observée aujourd’hui est d’éviter l’utilisation de produits d’origine animale dans ces procédés. En effet, ces composés représentent un risque de contamination du médicament par des agents infectieux et les autorités règlementaires renforcent leurs exigences pour leur retrait des procédés de fabrication. Ces composés sont par ailleurs mal définis et posent des problèmes de variabilité des procédés de production. L’objectif de ce projet était de développer un milieu sans dérivés animaux pour la culture d’une lignée cellulaire Sp2/0 utilisée par la société Merck Serono pour exprimer un anticorps monoclonal thérapeutique. Le procédé de fabrication actuel contient de la sérum albumine bovine (BSA) et de l’EX-CYTE (concentré commercial de lipoprotéines et acides gras) extraits de sérum bovin. Le retrait des deux composés du milieu de culture a entrainé une diminution de la productivité du procédé de 87% et il a été observé que l’EX-CYTE et la BSA étaient essentiels pour la survie de notre lignée cellulaire Sp2/0. La BSA a permis à elle seule de remplacer l’EX-CYTE dans le procédé et a été utilisée comme modèle pour le développement d’un remplacement sans dérivés animaux. Une étude de caractérisation de la préparation de BSA a été effectuée afin d’identifier les facteurs responsables de son activité promotrice pour la croissance cellulaire. Les lipides représentaient une partie importante de cette activité mais un rôle significatif d’autres protéines contaminantes a été révélé. Enfin, un supplément lipidique sans dérivés animaux a été développé. Ce supplément était constitué d’un mélange de quatre acides gras (les acides oléique, linoléique, palmitique et stéarique) couplés à de la sérum albumine humaine recombinante (rHSA). Le supplément acides gras-rHSA a permis de remplacer l’EX-CYTE et la BSA et un milieu sans composés d’origine animale a finalement été obtenu. / Monoclonal antibodies (mAbs) are important therapeutics widely used for cancer therapy. Mammalian cell lines are usually employed to produce these complex recombinant proteins and the pharmaceutical industry has developed robust processes that deliver large quantities of mAbs with a sustained quality. A general trend observed today is to avoid the use of animal-derived components in such processes. Indeed, these compounds represent a potential risk of contamination of the final drug product with infectious agents and regulatory authorities are putting pressure for their removal from manufacturing processes. Such compounds are also ill defined and source of variability for the production processes. The goal of this project was to develop an animal-derived component free (ADCF) medium for the culture of an Sp2/0 cell line used by the company Merck Serono to express a therapeutic mAb. The manufacturing process currently used contains bovine serum albumin (BSA) and EX-CYTE (a commercial concentrate of lipoproteins and fatty acids) sourced from bovine serum. The removal of both components from the cell culture medium decreased the productivity of the process by 87%. EX-CYTE and BSA were found to be essential for the survival of our Sp2/0 cell line. BSA, which was found to replace EX-CYTE in the process, was used as a model for the development of an animal-derived component free replacement. A characterization of the BSA preparation was carried out to identify the factors responsible for its growth-promoting activity. Lipids accounted for a major part of the activity of the BSA preparation but a significant role of other protein contaminants was revealed. Finally, an animal-derived component free lipid supplement was developed. This supplement consisted in a mixture of four fatty acids (FA) (oleic, linoleic, palmitic and stearic acids) complexed with recombinant human serum albumin (rHSA). The FA/rHSA supplement could substitute for EX-CYTE and BSA and an ADCF medium was finally obtained.

Introduction : L'hémophilie B (HB) est une maladie hémorragique héréditaire due à un défaut en facteur IX (FIX) de la coagulation. Le traitement substitutif est efficace mais pose deux problèmes : la fréquence des injections intraveineuses de concentrés de FIX et leurs coûts. La production d'un FIX recombinant à activité améliorée et à demi-vie prolongée est un enjeu important du traitement. Matériel et méthodes : Afin d'améliorer l'activité du FIX, l'étude s'est portée sur un résidu impliqué dans l'interaction du FIX activé avec son cofacteur, le facteur VIII activé (FVIIIa). Quatre FIX mutés au niveau de l'acide aminé E410 ont été développés. Afin de prolonger la demi-vie, un ADN complémentaire de FIX chimérique a été généré de façon à produire la protéine correspondante par la lignée cellulaire humaine Huh-7. Résultats : L'activité coagulante in vitro des FIX-E410 était 3 à 5 fois plus élevée que celle du FIX wild-type (FIX-WT). De plus, le FIX-E410H induisait une génération de thrombine 5,2 fois plus élevée comparée à celle du FIX-WT. Chez la souris HB, l'activité coagulante et la capacité de génération de thrombine du FIX-E410H in vivo étaient significativement plus élevées que celles du FIX-WT. La protéine chimérique a présenté une activité molaire spécifique 10 fois augmentée in vitro et une demi-vie jusqu'à 2,8 fois plus allongée, par rapport à celles du FIX-WT. Conclusion : Nous avons développé et caractérisé quatre molécules de FIX ayant une activité améliorée in vitro et in vivo, ainsi qu'un FIX modifié à activité augmentée et à demi-vie prolongée in vivo. Ces nouvelles molécules pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques de traitement de l'HB / Introduction: Hemophilia B (HB) is an inherited X-linked recessive bleeding disorder, due to a defect in human factor IX (FIX). Replacement therapy, in severe HB is very effective but is limited by FIX concentrates injections frequency and cost issues. Production of a recombinant FIX with enhanced clotting activity and prolonged half-life is one of the current challenges for HB treatment. Materials and Methods: To improve activity, we focused on an important residue known to be involved in the interaction of activated FIX with its cofactor, activated factor VIII (FVIIIa), and four mutated FIX-E410 were developed. To prolong stability, a new chimeric FIX cDNA was constructed too. Recombinant FIX molecules were produced by the human hepatoma cell line Huh-7. Results: The in-vitro clotting activity of FIX-E410 was 3 to 5-fold higher than wild-type FIX (FIX-WT) and this improvement was confirmed using thrombin generation assay. FIX-E410H induced 5.2-fold higher thrombin generation than FIX-WT. In HB mice, we observed significantly higher in-vivo clotting activity and thrombin generating capacity with FIX-E410H compared to FIX-WT, mainly explained by 2.5-fold enhanced affinity of the mutant for FVIIIa. Chimeric FIX showed a 10-fold increase in the in-vitro molar specific activity and a significantly increased half-life in mice (up to 2.8-fold), compared to FIX-WT. Conclusion: We have engineered and characterized four improved FIX proteins with enhanced in- vitro and in-vivo activity, and a new chimeric FIX with in-vivo increased activity and prolonged half- life. These results suggest that these new molecules could optimize protein replacement therapy forHB treatment

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Les maladies neurodégénératives liées à l'âge, telle celle de Parkinson, sont un problème majeur de santé publique. Cependant, la maladie de Parkinson reste incurable et les traitements sont très limités. En effet, les causes de la maladie restent encore mal comprises et la recherche se concentre sur ses mécanismes moléculaires. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à deux phénomènes anormaux se produisant dans la maladie de Parkinson : l'agrégation de l'α-synucléine et l'activation des cellules microgliales. Pour étudier la polymérisation de l'α-synucléine, nous avons établi de nouvelles méthodes permettant la production in vitro de différents types d'oligomères d'α-synucléine. Grâce à des méthodes biophysiques de pointe, nous avons caractérisé ces différents oligomères à l'échelle moléculaire. Puis nous avons étudié leurs effets toxiques sur les neurones. Ensuite, nous nous sommes intéressés à l'activation des microglies et en particulier à leurs canaux potassiques et aux changements liés au vieillissement. Nous avons identifié les canaux Kv1.3 et Kir2.1 et montré qu'ils étaient impliqués dans l'activation des microglies. En parallèle, nous avons établi une méthode originale qui permet l'isolation et la culture de microglies primaires issues de cerveaux adultes. En comparaison à celles de nouveaux-nés, les microglies adultes montrent des différences subtiles mais cruciales qui soutiennent l'hypothèse de changements liés au vieillissement. Globalement, nos résultats suggèrent qu'il est possible de développer de nouvelles approches thérapeutiques contre la maladie de Parkinson en modulant l'action des microglies ou en bloquant l'oligomérisation de l' α-synucléine.