Os linfócitos humanos apresentam na sua superfície a enzima NTPDase1 (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase; CD39; EC 3.6.1.5), responsável pela hidrólise do ATP e ADP extracelular e/ou outros nucleotídeos di ou tri fosfatados. A determinação da atividade da enzima foi padronizada através de método colorimétrico, o qual quantifica o fosfato livre liberado durante a reação. A NTPDase1 foi caracterizada através da demonstração de condições ótimas de incubação, como dependência de cálcio, pH, tempo de incubação e temperatura ótimos, além da obtenção de parâmetros cinéticos. Os resultados obtidos foram confirmados por uma baixa expressão de CD39 nos linfócitos humanos, verificada por análise citométrica, com utilização de anticorpo monoclonal correspondente. Este fato indica um baixo estado de ativação dos linfócitos, uma vez que o CD39 é considerado um marcador de ativação destas células. Posteriormente, foi determinada a atividade da NTPDase1 em linfócitos de pacientes imunodeprimidos pela infecção causada pelo HIV, os quais são acompanhados pelo monitoramento de sua carga viral no plasma e contagem de células T CD4+. A infecção pelo HIV resulta em alterações nas células imunes e na secreção de citocinas importantes na resposta patógenos. Nesta situação pode haver alterações bioquímicas na resposta imune, como por exemplo, alterações na hidrólise de nucleotídeos, ou seja, na atividade das enzimas que degradam nucleotídeos extracelulares. Os linfócitos encontram-se em estado de ativação crônica, o que faz com que até mesmo células não-infectadas pelo vírus, possam sofrer apoptose por ativação de caspases efetoras. Através da determinação da atividade da NTPDase nos linfócitos imunodeprimidos, verificou-se um aumento de sua atividade, acompanhado por uma maior expressão de CD39 na superfície destas células. Estes resultados sugerem que a NTPDase1 é importante para a manutenção da resposta imune, mantendo concentrações adequadas de ATP extracelular, o qual é essencial para certas funções imunes, mas também pode ser prejudicial no momento que induz apoptose nos linfócitos, o que poderia aumentar o estado de imunodepressão. Devido ao fato de que muitos dos pacientes HIV-positivos recebem terapia anti-retroviral, foi necessário verificar in vitro possíveis efeitos destas drogas sobre a atividade da NTPDase1. Neste caso, observou-se que as concentrações terapêuticas destas drogas não afetaram a atividade da enzima. Sendo assim, a atividade aumentada da NTPDase1 nestes pacientes, não é devida à interferência da terapia anti-retroviral.

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Made available in DSpace on 2014-06-12T16:26:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5542_1.pdf: 6478388 bytes, checksum: a1dcafc67bbcb4889beb984027c51bf5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / A esquistossomose mansônica é uma doença infecciosa, causada por um verme (Schistosoma mansoni) que no seu ciclo evolutivo pode ter o homem como um dos seus hospedeiros definitivos. Nas formas mais avançadas, a embolização maciça de ovos depositados por vermes adultos no sistema da veia porta para o parênquima hepático provoca alterações inflamatórias na estrutura do fígado, modificando a arquitetura do órgão e induzindo à formação de granulomas, cuja resolução causa a fibrose de Symmers, característica histológica da fase crônica da doença. A fibrose determina resistência à passagem do fluxo sanguíneo da veia porta pelo fígado, causando hipertensão no território das veias do esôfago terminal e fundo gástrico, onde são formadas varizes, cuja ruptura causa episódios de hemorragia digestiva alta. A esplenectomia constitui etapa importante das opções do tratamento cirúrgico da hipertensão portal esquistossomótica: per si, pode reduzir em 35 a 40% a pressão sanguínea no território da veia porta. Todavia, a remoção do baço, qualquer que seja o motivo, pode comprometer as respostas imunes do indivíduo a agressões infecciosas, particularmente àquelas provocadas por germes encapsulados. Estudos confirmam que fragmentos de tecido esplênico autoimplantados, tanto em animais de experimentação como em humanos, são capazes de se regenerar. Embora ainda motivo de controvérsia, por sofrerem necrose centrípeta e conseqüente redução de massa, existem evidências de que os enxertos esplênicos sejam capazes de manter a função do baço como órgão linfóide e que elementos do sistema imune têm seus valores circulantes recuperados. O objetivo desta pesquisa foi verificar experimentalmente o restabelecimento de subpopulações de linfócitos CD4, CD8 e CD45RB em autoimplantes esplênicos. Camundongos albinos fêmeas adultas de linhagens não-isogênicas do GIDE foram inicialmente divididos em 2 grupos: A - grupo controle (75 animais sadios) e B - grupo de estudo (100 animais infectados através de injeção subcutânea com 25 cercárias de Schistosoma mansoni); 120 dias após a infecção, animais foram aleatoriamente divididos em 6 subgrupos: A1 e B1 - baços intactos; A2 e B2 - esplenectomia parcial, com preservação do polo superior vascularizado do baço; e A3 e B3 - autoimplante de todo o tecido esplênico, fatiado, em bolsa confeccionada no grande omento. Oito animais de cada um dos 6 subgrupos foram sacrificados entre 60 e 65 dias depois de realizadas as operações, sendo resgatado o baço íntegro, o remanescente vascularizado ou os enxertos; as células mononucleares do tecido esplênico foram cultivadas e separadas para a imunofenotipagem dos linfócitos, sendo então estudadas as subpopulações de CD4, CD8 e CD45RB, pelo método de citometria de fluxo. Fragmentos do fígado de todos os animais foram analisados por microscopia óptica a fim de afastar ou confirmar, nos camundongos sadios ou esquistossomóticos, respectivamente, a presença de fibrose hepática. Fragmentos de tecido esplênico de 3 animais de cada um dos 6 subgrupos foram destinados à análise histológica. O modelo animal proposto fornece material suficiente para estudo do tecido esplênico em indivíduos esquistossomóticos, na fase crônica da doença; o exame microscópico evidenciou fibrose nos fígados de todos os animais submetidos à infecção com cercárias; todos os controles sadios apresentavam fígados com arquitetura normal. Apenas o tecido esplênico resgatado dos camundongos parasitados exibia granulomas esquistossomóticos, independente do subgrupo. A avaliação histológica não evidenciou diferenças nas polpas vermelha e branca de baços íntegros ou remanescentes esplênicos, quando comparados animais sadios entre si, ou esquistossomóticos entre si. Em relação à morfologia dos enxertos, percebeu-se a presença mais evidente de fibrose intersticial, quando comparados aos baços íntegros ou remanescentes vascularizados; essas alterações foram identificadas em todos os autoimplantes estudados, quer de animais sadios ou infectados. As subpopulações linfocitárias foram restabelecidas em autoimplantes esplênicos, tanto de animais sadios como de animais esquistossomóticos. Concluindo, não houve diferença entre os grupos de animais estudados quanto às subpopulações de linfócitos CD4, CD8 e CD45RB, analisadas no tecido esplênico pelo método de citometria de fluxo

Orientador: Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T08:53:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domenici_EloisaLeite_M.pdf: 3995315 bytes, checksum: bf1e3e2ca6580e9831d2d4083d3cfc3e (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A Encefalomielite Experimental Autoimune é uma doença que apresenta muitos aspectos clínicos e histológicos em comum com a Esclerose Múltipla em humanos, e por este motivo vem sendo utilizada para o estudo da mesma. O estudo dos mecanismos envolvidos na supressão da EAE seja através da administração oral de neuro-antígenos ou na fase remissiva da doença, revelou que a supressão ativa é o principal mecanismo imuno-modularor (HIGGINS & WEINER, 1988; LIDER et al., 1989) Sabe-se que a indução da EAE está relacionada a clones de células T CD4 + do tipo Th1auto-reativas a neuro-antígenos, e a produção de citocinas pró inflamatórias, tais como IL-2, TNF-a e IFN-? (NICHOLSON & KUCROO, 1996). Em contrapartida, a supressão da doença é mediada por células do tipo Th2 e por citocinas anti-inflamatórias, tais como IL-4, IL-10 e TGF-f3 (CHEN et al., 1994; DRUET et al., 1996) Foi demonstrado anteriormente o papel das células T ?d no controle da autoimunidade (CARDILLO et aI., 1993) e na tolerância imunológica (McMENAMIN et aI, 1994; McMENAMIN et aI, 1995; SUZUKI et aI., 1995) No presente trabalho procuramos investigar o papel dos linfócitos T ?d na indução de EAE, utilizando o anticorpo monoclonal anti-TCR ?d 3A10 para modular essa população celular. Os resultados aqui obtidos mostram a exacerbação da EAE nos camundongos ?d -depletados, com aumento da severidade e da incidência da doença e também antecipação do aparecimento dos seus sinais clínicos. Nos estudos in vitro observou-se aumento da resposta linfoproliferativa para a proteína básica de mielina (MBP) e da produção de anticorpos anti-MBP no soro, sugerindo aumento da atividade dos clones auto-reativos causadores da doença. Houve também aumento da resposta linfoproliferativa a concanavalina A. O estudo da produção de citocinas por células esplênicas dos animais ?d -depletados revelou aumento da secreção de TNF-a e diminução da secreção de TGF-I3. Todos esses resultados sugerem que os linfócitos T ?d exercem uma função imuno-supressora no modelo de EAE. O aumento da resposta linfoproliferativa a concanavalina A para os animais ?d -depletados sugere que esta atividade supressora é inespecífica, a exemplo do mecanismo de bystander suppression proposto por MILLER et aI. (1991) e provavelmente se efetiva através da secreção de citocinas anti-inflamatórias, dentre as quais o TGF-13 está envolvido / Mestrado / Imunologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Gilberto D'Assunção Fernandes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T01:44:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guimaraes_Fernando_M.pdf: 10011651 bytes, checksum: a93242d30f0af2645d3e080c6b7aa6c5 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Alguns trabalhos relataram a participação de estruturas límbicas na modulação da resposta imune. Com relação aos núcleos septais, a lesão ampla desta área alterou a resposta humoral de ratos imunizados com hemácias de carneiro, enquanto a lesão septal medial inibiu a resposta mitogênica in vitro de linfócitos T. Neste trabalho, investigou-se a influência da área septal do cérebro sobre as freqüências de linfócitos T CD4+ e T CD8+ no baço de ratos durante o desenvolvimento tumora!. Para isso, ratos com a área septal do cérebro lesada através de cirurgia estereotáxica (LW) e ratos controles (cirurgia simulada, SW) foram comparados após receberem uma inoculação subcutânea (sc) do tumor de Walker 256 Ar (variante celular com elevado índice de regressão, obtida a partir das células tumorais de Walker 256 A). A possibilidade da atividade adrenocortical mediar os efeitos septais foi verificada pela dosagem de corticosterona sérica. Também foi investigada a influência da lesão septal sobre os efeitos sistêmicos tais como, anorexia, ganho de peso corpóreo, retenção renal de sódio e água induzidos pelo tumor (modelo de inoculação multifocal com células tumorais de Walker 256 A ), visto a possibilidade de variações destes parâmetros fisiológicos servirem como uma indicação indireta da atividade imunológica. Com relação aos efeitos sistêmicos tumorais foi observado que a lesão septal causou uma redução temporária na retenção de sódio e água induzida pelo tumor, possivelmente como conseqüência da inibição da liberação do hormônio antidiurético. Duas semanas após a inoculação do tumor de Walker 256 Ar foram identificadas regressões tumorais em 46,2 % do grupo SW e 57,1 % do grupo LW. Tanto no grupo SW como no LWo percentual de linfócitos T CD4+ nos ratos cujos tumores não regrediram (SW = 19,5 ::t 1,4 %; L W = 23,8 ::t 1,6 %) foi significativamente menor que naqueles com regressão tumoral (SW = 29,3 ::t 2,4 %; LW = 31,4::t 1,6 %). Como conseqüência a relação CD4+/CDS+ também foi significativamente menor nos ratos cujos tumores não regrediram (SW = 0,91 ::t 0,07; LW = 1,20 ::t 0,07) que naqueles com regressão tumoral (SW = 1,45 ::t 0,1; L W = 1,59 ::t 0,1). Concluiu-se que as variações nas freqüências de linfócitos T, bem como na relação CD4+/CDS+ estiveram associadas ao desenvolvimento tumoral e não foram afetadas pela lesão ampla da área septal. Através de um experimento com ratos adrenalectomizados foi observado que o crescimento contínuo ou a regressão dos tumores, bem como a resposta imune celular associada a estes eventos, não foram influenciados pela atividade adrenocortical / Abstract: Some studies have shown the influence of limbie-hypothalamie areas on the immune response modulation. Concerning the septal nueleus, the whole lesion of this limbie area impaired the humoral immune response of rats immunized with sheep red blood eells, while lesions of the medial septal nueleus produced a long lasting inhibition of T Iymphoeyt proliferation induced by mitogens. The proposal of the present study was to investigate the influenee of septal area lesion on frequeneies of splenie T CD4+ and T CDS+ Iymphoeytes, during tumor development. Therefor, septal-Iesioned rats (LW), obtained through stereotaxie surgery, were compared with sham-operated rats (SW), afier one subeutaneous (se) inoculation of Walker 256 Ar tumor cells (a cell variant obtained from Walker 256 A tumor, distinguished by presenting a high regression ineidence). The adrenocortical aetivity in the mediation of septal lesion effects was evaluated by assessing serum corticosterone. The influenee of septal lesion on systemie effeets induced by the tumor, like body weight gain and, sodium and water renal retention was also investigated (by using the multifocal se inoeulation model of Walker 256 A cells). It was suggested that ehanges in these parameters would help as an indireet indication of the immunological function alterations. Conceming the systemie effects, sodium and fluid retention induced by the Walker 256 A tumor was temporarily reduced in animais with septal area lesions. This effect was possibly a result of an inhibition of antidiuretie hormone release. By using the Walker 256 Ar tumor cells, it was observed tumor regressions in 46.2 % of the SW group and 57.1 % of the LW group two weeks afier se inoculation. In both groups SW and LW, the frequency of splenic T CD4+ Iymphocytes was significantly reduced in rats which tumors did not regress (SW = 19.5:t 1.4 %; LW = 23.8:t 1.6 %) compared with rats with tumor regression (SW = 29.3:t 2.4 %; LW = 31.4 :t 1.6 %). As a consequence, the CD4+/CD8+ ratio was also significantly reduced in rats without tumor regression (SW = 0.91 :I:: 0.07; LW = 1.20 :t 0.07) in relation to those with tumor regression (SW = 1.45 :I:: 0.1; LW = 1,59 :t 0.1 %). Therefore, septal area lesion did not affect the frequencies of T Iymphocytes. Nevertheless, the alterations observed in the frequencies of T Iymphocytes, as well as in CD4+/CD8+ ratio were associated with tumor development (continuous growth or regression). It was also observed that tumor continuous growth or tumor regression, as well as the immune response associated with these events were not affected by adrenocortical activity / Mestrado / Fisiologia / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador : Giberto da Assunção Fernandes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T15:49:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ruocco_HeloisaHelena_D.pdf: 3955364 bytes, checksum: c05871913344ed857e9c81f61d86d467 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Centralmente aplicada, a Substância P (SP) interage com o sistema nervoso autônomo (SNA) e com o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (IlliA). Sabendo-se que esses sistemas modulam a função imune inata e têm sido implicados na resposta inflamatória associada com doenças auto-imunes, os efeitos da administração de SP intracerebroventricular (i.c.v.) na quantificação de linfócitos e na atividade citotóxica"natural killer" (NK) de células esplênicas foram estudados na Encefalomielite Alérgica Experimental (EAE), um modelo de estresse inflamatório crônico. Neste trabalho investigou-se a influência da SP e do seu antagonista sobre as subpopulações celulares CD3+, CD4+, CD8+, CDJNKR-PI+, CD3~-PI+, quantificadas por citometria de fluxo e a atividade imunológica citotóxica NK, obtida por ensaio de liberação de cromo radioativo CrSI, no curso desse processo inflamatório. A possibilidade de avaliar a atividade do eixo IlliA nessa doença foi verificada pelas dosagens hormonais séricas do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e corticosterona, e da arginina vasopressina (A VP), na eminência média. Os resultados mostraram que na EAE houve um aumento no baço nos subtipos celulares CD3+ (64,2 :!: 0,8 %), CD4+ (59,6 :!: 0,6 %), CD8+ (14,5 :!: 0,5 %) e CDTNKR-PI + (8,8 :!: 0,3 %) às custas de uma atividade esplênica citotóxica NK (5,2 :!: 0,6 %) significativamente menor que nos controles normais [CD3+ (47,8 :!: 2,2 %), CD4+ (45,6 :!: 1,3 %), CD8+ (10,7 :!: 0,4 %), CD3NKR-PI+ (4,9 :t 0,4 %), NKac (8,9 :!: 0,7 %), CD3~-PI+ (1,6:!: 0,2 %) , ACTH (10,2 :!: 1,4 pg/rnl), corticosterona (2,2 :!: O ng/rnl)]. Esses dados foram correlacionados a um aumento dos níveis plasmáticos de ACTH (92,2 :!: 38,5 pg/rnl) e corticosterona (152,1 :!: 42,5 ng/rnl). A administração de 20 nrnoles de SP aumentou a retenção de células CD4+ (5I,3:!: 1,7 %) e CD8+ (I5,0:!: 0,8 %) no baço, com um aumento da porcentagem de células CD3NKR-Pl+ (10,4 :!: 0,9 %) e conseqüente diminuição da citotoxicidade NKac (5,4 :!: 0,6 %) no pico dos sintomas clínicos, comparados aos controles salina [CD4+ (41,2 :!: 4 %), CD8+ (1I,8:!: 1,5 %), CD3NKR-PI+ (6,5:!: 1,7 %), NKac (7,6:!: 0,2 %), ACTH (47,1 :!: 6,1 pg/rnl), corticosterona (120,3 :!: 17,8 ng/rnl)]. Isto foi acompanhado por um decréscimo nos níveis dos hormônios adrenocorticotróficos (21,3 :f: 2,3 pg/rnl) e corticosterona (44,1 :f: 16,2 ng/mI). As células CD3~-P1+ [antagonista + salina (0,5 :f: 0,04 %) e antagonista + SP (0,6:f: 0,1 %)], um outro tipo celular implicado na auto-imunidade, foram reduzidas pela injeção do antagonista da SP, quando comparadas ao grupo salina (1,3 :f: 0,1 %), sugerindo um papel para a SP no fluxo migratório desse tipo celular no baço. Concluindo, os dados obtidos neste trabalho sugerem que a SP influencia o eixo HHA , podendo também modular o tráfego celular linfocitário e a resposta imune no baço e, portanto, deve ser um elemento importante nos processos de modulação da EAE / Abstract: Substance P centrally injected (ICV) in rats acts on the autonomic nervous system and the hypotha1amic-pituitary-adrenal axis (HPA) to moduJate innate llmnune function and iDf1ammatory response in autoimmune diseases. The effects of modulation in migration and in natural killer cell activity of splenocytes in these systems were studied in experimental allergic encephalomyelitis (EAE) a model of autoimmune disease which acts as a chronic inf1ammatory stress. The migration characteristics observed by flow citometry were ofthe CD3+, CD4+, CD8+, CD3+m<R-Pl+ and NKT splenocyte subpopulations. The innate llmnune function measured was that of the cytotoxic NK activity measured by CrSI liberation assay in the peak of the inflammatory processo The hypothaJamic-pituitaryadrenal axis alterations were measured by quanti.fying the plasma hormone levels of adrenocorticotropic hormone (ACTH) and corticosterone and the median eminence values of arginine vasopressin. In this chronic inflammatory model was observed an increased retention in the spleen ofCD3+ (64,2:J: 0,8 %), CD4+ (59,6:J: 0,6 %), CD8+ (14,5:J: 0,5 %) and CD3+m<R.-Pl+ (8,8:J: 0,3. %) cellular subtypes with a dimini~hed NK cytotoxic activity (5,2:J: 0,6 %) when compared to healthy control rats [CD3+ (47,8 :J: 2,2 %), CD4+ (45,6 :J: 1,3 %), CD8+ (10,7 :J: 0,4 %), CD3+m<R.-Pl+ (4,9 :J: 0,4 %), NK cytotoxic activity (8,9:J: 0,7 %), ACTH (10,2 :J: 1,4 pg/m1), corticosterone (2,2 :J: O ng/m1)].. There was a inverse correlation with high levels of ACTH (92,2 :J: 38,5 pg/ml) and corticosterone (152,1 :J: 42,5 ng/ml): Substance P 20 nanomols ICV injected also increased the retention ofCD4+ (51,3 :J: 1,7 %), CD8+ (15,0:J: 0,8 %) and CD3+m<R-~I+ (10,4:J: 0,9 %) in the spleen ofEAE rats with a lower NK cytotoxic activity (5,4 :J: 0,6 %) in the peak ofthe clínical symptoms and decreased levels of ACTH (21,3 :J: 2,3 pg/ml) and corticosterone (44,1 :J: 16,2 nglml) when compared to injected saline controls [CD4+ (41,2 :J: 4 %), CD8+ (11,8 :J: 1,5 %) and CD3-+m<R-Pl+ (6,5 :J: 1,7 %) NK cytotoxic activity (7,6:J: 0,2 %), ACTH (47,1 :J: 6 pglm1), corticosterone (120,3 :J: 17,8 ng/m1) ]. When treated with a substance P antagonist NKT cells presented a decreased splenic retention [antagonist + saline (0,5 :J: 0,04 %) e antagonist + SP (0,6 :J: 0,1 %)] when compared to saline-treated group (1,3 :J: 0,1 %), suggesting a role for substance P in the migration control ofthis type of cell. We can conc1ude that the results ofthis work suggest a role for substance P in the moduJation of the HP A axis, to the lymphocyte traffic control and to the innate immune response in chronic autoimmune inflammatory diseases / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientadores : Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T23:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Picardi_PatyKaroll_M.pdf: 10576328 bytes, checksum: 4b3d1020e8bfdcab6dde7ac5f6e92049 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito de antimaláricos na atividade das fosfatases isoladas de linfócitos humanos e a ação destes fármacos na viabilidade dos linfócitos. A atividade fosfatásica foi determinada através da dosagem do pnitrofenol e a viabilidade celular foi avaliada através de 3 parâmetros: redução do MTT (integridade mitocondrial), dosagem de proteína (indicação do número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). A cloroquina não apresentou efeito significativo sobre as fosfatases de membrana, citoplasmáticas e da fração total. No entanto, o efeito inibitório de 25% sobre as fosfatases citoplasmáticas e de 30% fração total foi observado após pré incubação da enzima na presença da quinina. Ao contrário dos outros antimaláricos, a desferoxamina ativou as fosfatases da fração total (40%) e de membrana (70%). Nos estudos de citotoxicidade a cloroquina mostrou baixa citotoxicidade analisando a atividade da fosfatase total (ICso=360j.lM) e quantificação de proteína (ICso=346j.1M), quando comparada com a maior toxicidade observada para o teste do MTT (lCso=75j.1M). A quinina também apresentou uma toxicidade maior para a mitocôndria (aumento de 130% na redução do MTT), quando comparado com a quantificação da proteína e atividade fosfatásica (inibição de 40%). Nossos resultados sugerem que a ação citotóxica dos antimaláricos (quinina e cloroquina) pode ser devido a dois fatores: inibição direta de proteínas fosfatases, já que estudos cinéticos mostraram que as fosfatases predominantes em linfócitos são proteínas tirosina fosfatases e proteínas serinaltreonina fosfatases ou inibição de enzimas dependentes de grupamento sulfidrila e alteração de organelas como mitocôndria por induzirem estresse oxidativo. A desferoxamina teve uma ação ativadora sobre as proteínas fosfatases de membrana, provavelmente agindo na CD45. A presença de antioxidantes (GSH e ácido ascórbico) causou ativação das fosfatases, porém, em presença da quinina, cloroquina e desferoxamina essa ativação foi ainda maior / Abstract: The aim of this work was to verify the effect of antimalarial drugs in phosphatases isolated from human Iymphocytes and the action of these pharmaceutical drugs on Iymphocytes viability. Phosphatase activity was determined through the pnitrophenol assay and cell viability through 3 parameters: MTT reduction (mitochondrial integrity), protein content (cell number index) and phosphatase activity (cell metabolism). Phosphatases from membrane and cytoplasm were not affected by chloroquine. However, an inhibitory effect on cytoplasmic phosphatases (30%) on total fraction (25%) was observed after pre-incubation of the enzyme in presence of the quinine. In contrast to other antimalarials desferoxamine, the phosphatases actived from the total fraction and membrane, 40 and 70%, respectively. In the citotoxicity studies, chloroquine showed low citotoxicity when the activity of total phosphatase (IC50=360_M) and protein content (IC50=346_M) were analysed, when compared to the toxicity observed with MTT test (IC50=75_M). Quinine also had a high toxicity for the mitochondria (130% increased MTT the reduction), when compared to protein quantification and phosphatase activity (40% inhibition). Our results suggest that the cytotoxic action of antimalarials (quinine and chloroquine) can be due to two factors: direct inhibition of protein phosphatases, since kinetic studies had shown that the predominant phosphatases in Lymphocytes are protein tyrosine phosphatases and protein serine/treonine phosphatases or inhibition of sulfhydryl group dependent enzymes and alteration of organelas such as mitochondria by inducing oxidative stress. Desferoxamine had an activator action in membrane protein phosphatases of, probably acting on the CD45. Antioxidant substances (GSH and ascorbic acid) caused activation of phosphatases, but, in presence of quinine, cloroquine and desferoxamine this activation was more significative / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Carmem Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T11:24:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_TelmaMariaAraujo_D.pdf: 6074336 bytes, checksum: e6dab7e3aafad9713e6fc89d823e83ff (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi relacionar o efeito citotóxico do ácido okadáico um potente e específico inibidor de serinaJtreonina fosfatase (PP1 e PP2A) e trans-desidrocrotonína, um 19-nor-clerodane, é o maior norditerpeno obtido da croton Cajucara; uma planta medicinal brasileira, a qual apresenta importante atividade bíologica como antineoplásica e antiulcerigênica sobre a cultura primária de linfócitos humanos com a atividade de fosfatases. Primeiramente, a fosfatase total foi caracterizada cineticamente através dos seguintes estudos: efeitos de substrato, pH, potenciais inibidores, metais e outros compostos. Nossos resultados mostraram que a fosfatase predominante nos linfócitos trata-se de uma proteína tirosina fosfatase, uma vez que hidrolisou eficientemente tirosina fosfato (60%), foi fortemente inibida pelo pervanadato (100%), vanadato (80%), p-cloromercuribenzoato (90%), coquetel inibidor de proteína tirosina fosfatase (70%) e apresentou insensibilidade ao ácido okadáico (100 nM). Nos estudos de citotoxicidade avaliamos o efeito do ácido okadáico e da desidrocrotonina, através dos seguintes parâmetros: redução do MTT (integridade mitocondrial), conteúdo total de proteínas (número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). Nos testes de citotoxicidade o ácido okadáico e a desidrocrotonina (na ausência do mitogêno) apresentaram efeito tóxico sobre linfócitos humanos quando analisados os parâmetros fosfatase e MTT com valores de ICso 47 e 100nM para o ácido okadáico; 450 fJM para a desidrocrotonina. O efeito mitogênico do OKA (10nM) sobre os linfócitos foi detectado 10 min após o tratamento com este composto, o qual causou aumento de 30% no número de células, este efeito foi inibido na presença da desidrocrotonina. Quando avaliamos o efeito da desidrocrotonina na CD45 purificada observamos uma inibição significativa. Este composto apresenta ação oxidante, portanto a inibição da fosfatase por estes compostos pode ser devido a formação de adutos. Os resultados obtidos neste estudo indicam que a PTP presente nos linfócitos pode servir de forma complementar, como um parâmetro de viabilidade celular e nos fornecer informações importantes sobre o metabolismo celular / Abstract: The aim of this work was to correlate the cytotoxic effeet of Okadaic acid is a potent, speeifie inhibitor of protein serine/threonine phosphatase (PP1 and PP2A).and trans-dehydrocrotonin, a 19-nor-clerodane, is the major norditerpene obtained from Croton cajueara, a Brazilian medicinal plant, which present important biological activities as antineoplasic and antiulcerogenic on the primary culture of human Iymphocytes with phosphatase activities. Firstly, the kinetic of total phosphatase from these cells was studied through the following properties: substrate specificity, optimum pH, effect of potential inhibitors, metais and compounds. Our results showed that the main phosphatase present in the cellular extract was a protein tyrosine phosphatase, once the tyrosine phosphate was effieiently hydrolized by the enzyme (60%), inhibíton by vanadate (100%), pchlromereuribenzoate (90%), PTP cocktail inhibitor and insensíbílity by okadaíc acid. The eytotoxicity studies of okadaic acid and dehydrocrotonin on human Iymphoeytes were evaluated through three endpoints of cytotoxicity: MTT reduction (mitochondrial function), protein content (cel! number indication) and phosphatase activity (cel! metabolism). Okadaic acid and dehydrocrotonin presented toxíc effects when the parameters phosphatase and MTT were analyzed, with the following ICso values: 47 and 100 nM for okadaic acid and 450 jJM for dehydrocrotonín. The mitogenic effect of OKA (10nM) was detected after 10 minutes of treatment with this compound, which inereased 30% of cell number. However, when OKA was incubated with dehydrocrotonin, the cel! proliferation was prevented. Dehydrocrotonin caused significative inhibition of CO45 purified from Iymphocyte membranes. This compound presents oxidant action, then the inhibition of PTP by dehydrocrotonin could be due the adducts formation. The results obtained in this study indicate that PTP from Iymphocytes could be utilized as parameter of cel! viability and provi de important information about cel! metabolism / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores : Aureo Tatsumi Yamada, Paulo Pinto Joazeiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T11:11:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PaffaroJunior_ValdemarAntonio_D.pdf: 10665680 bytes, checksum: e77f3a8bd81aae1e89c020b69311f0ea (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: As células natural killer uterinas (NKu) constituem uma população linfocitária transitória, presente no útero de humanos e roedores durante a gestação. O ambiente uterino, no início da gestação, parece ser determinante na migração e diferenciação, assim como, na supressão da atividade citolítica destas células, que atuam em outras localidades na resposta imune inata. Porém, os fatores ou os mecanismos envolvidos nestes processos celulares, das NKu, não foram ainda elucidados. As características fenotípicas e constitutivas asseguram a similaridade das NKu com as NK circulantes (NKc), porém, diversos ensaios apontam a primeira como sendo uma provável subclasse de células NK. No presente estudo, estabeleceu-se um método cito químico utilizando-se a lectina DBA (Dolichos biflorus) como um marcador altamente seletivo para as células NKu de camundongos, que permite distingui-Ias das células NK circulantes e das demais populações linfocitárias, por não apresentar reatividade cruzada. Com este marcador, foi possível identificar morfologicamente os subtipos correspondentes aos estágios de maturação, bem como, estabelecer de forma precisa a incidência e localização das NKu no útero ao longo da gestação. Ao contrário dos imunomarcadores utilizados até então, que apresentavam limitações (restritas a algumas linhagens de camundongos, ou que reconheciam apenas as formas maduras ou imaturas), a lectina DBA mostrou ser um marcador universal para as células NKu de camundongos, além de reagir com formas imaturas e plenamente diferenciadas destas células. Com o intuito de se elucidar a ação do estrógeno diretamente sobre as células NKu, utilizou se animais geneticamente modificados juntamente com métodos imunocitoquímicos e moleculares para identificar a possível expressão de receptores de estrógenos (ERa e ERJ3) nestas células. A medula óssea de animais deficientes em receptores de estrógenos a e J3 (ER-KO ae 13) foi transplantada em camundongos imunodeficientes B6-Rag-2-/- /yc-/- (T,B-, NK} O isolamento e purificação das células Nku pelo método lectina DBA-biomagnético, tornou-se possível após ter sido constatado que a mesma reage de forma específica com o glicoconjugado presente na superfície das células NKu. Os testes de RT-PCR realizados com as NKu isoladas demonstraram a ausência de receptores de estrógeno (X e 13 nas células NKu de camundongos, revelando que o hormônio estrógeno não seria o indutor que atua diretamente na migração, proliferação ou diferenciação destas células no ambiente uterino Com o fito de investigar se as NKu constituem um subtipo especializado de células NK, avaliou-se as expressões dos genes de 14 receptores LY49 e do DAP12, através do RT-PRC em tecidos mesometriais dissecados de camundongos virgens, prenhes, normais e geneticamente modificados deficientes em linhagens de linfócitos. Úteros virgens de C57Bl/6J (B6), randombred (predominante H-2b) scid/scid, B6-IL-1Y/- e B6 nu/nu expressaram DAP12 e um repertório parcial de Ly49. A prenhez induziu a expressão de receptores inibitórios adicionais em todas as linhagens estudas. No útero de camundongo B6 virgem os receptores de ativação L Y 49D e L Y 49H foram co expressos com os inibitórios L Y49 I, J e Q. No início da gestação (dg6), foi observada a expressão de genes para um repertório extenso de Ly49, que prossegue até a metade da gestação, os quais devem estar relacionados com a diferenciação e comportamento das NK no útero. O conjunto destes experimentos e os respectivos resultados foram organizados em três capítulos distintos, redigidos na forma de três artigos científicos já submetidos para publicação em revistas especializadas da área. Saliente-se que partes deste trabalho foram desenvolvidas no laboratório da Profa. Dra. Bárbara Anne Croy, University of Guelph, ON, Canada / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural