La tuberculose reste l'une des maladies les plus meurtrières dans le monde et de nouvelles stratégies sont urgemment demandées pour combattre Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent éthiologique de la maladie. Les lipides jouent un rôle important dans le cycle de vie de la bactérie et sont largement présents dans sa membrane et son cytoplasme, où ils peuvent servir en tant que sources de carbone et d'énergie pour favoriser la pathogénicité et la survie pendant les phases d'infection et de persistance. Dans ce contexte, les rôles des enzymes lipolytiques restent mal définis et demandent à être davantage caractérisés. La première partie de ce travail de thèse a été consacrée à l'étude des douze enzymes de Mtb homologues à la lipase hormono-sensible humaine. Les effets du MmPPOX, un composé oxadiazolone très sélectif de cette famille de protéines, ont été évalués sur les enzymes recombinantes et directement in vivo sur Mtb et M. bovis BCG. Cet inhibiteur a démontré une activité antimycobactérienne, suggérant des rôles métaboliques importants pour ces enzymes. La seconde partie de ce travail a été consacrée à l'étude des mécanismes physico-chimiques dont dépendent fortement les inhibitions des lipases et des carboxylestérases in vivo, comme la présence de substrats et/ou de détergents. La spectrométrie de masse a également été introduite en tant qu'outil rapide et puissant pour caractériser les adduits [enzyme-inhibiteur]. Enfin, nous avons développé une approche de chimie protéomique pour capturer sélectivement des hydrolases à sérine à partir de milieux biologiques complexes. / Tuberculosis remains one of the deadliest diseases in the world and new strategies are urgently needed to combat Mycobacterium tuberculosis (Mtb), its etiologic agent. Lipids play an important part in the lifetime of the bacterium, as they are widely present in the membrane and stored in the cytoplasm, where they could be used as carbon and energy sources to promote pathogenicity and survival during infection and persistence. In this context, roles of lipolytic enzymes are still poorly understood and remain to be characterized. The first part of my work was devoted to the study of twelve Mtb enzymes homologous to the human hormone-sensitive lipase. Effects of MmPPOX, an oxadiazolone compound highly selective for this family of proteins, were investigated using recombinant enzymes and directly tested in vivo using Mtb and M. bovis BCG. This inhibitor demonstrated antimycobacterial activities, suggesting important metabolic roles for these enzymes. The second part of this work was devoted to the study of physico-chemical mechanisms on which lipase and carboxylesterase inhibition could strongly depend in vivo, like presence of substrates and/or detergents. Mass spectrometry was also introduced as a direct and powerful tool to characterize [enzyme-inhibitor] adducts. Finally, we developed chemical proteomics approaches to specifically capture serine hydrolases from complex biological media. We aimed to synthesize a grafted alkylphosphonate inhibitor on a solid support by assaying several grafting strategies and matrices of various chemical natures.

Trypanosoma brucei, parasite protozoaire flagellé appartenant à l’ordre des kinétoplastidés, est responsable de la maladie du sommeil, ou trypanosomiase humaine africaine (THA). Son cycle de vie fait intervenir un insecte vecteur hématophage (la mouche tsé-tsé ou glossine) qui lors d’un repas sanguin sur un individu infecté ingère des parasites. Après plusieurs étapes de différentiation, les parasites sont injectés à un hôte lors d’un autre repas sanguin. Nous avons étudié le métabolisme intermédiaire et énergétique de la forme procyclique de T. brucei, forme présente dans l’appareil digestif de l’insecte vecteur. Chez ce parasite, la dégradation du glucose aboutit à la production d’acétate dans l’unique mitochondrie, et de succinate dans la mitochondrie et les glycosomes, organelles spécifiques des trypanosomatidés dans lesquels la glycolyse est compartimentalisée. T. brucei utilise une "navette acétate" permettant de transférer l’acétyl-CoA produit dans la mitochondrie vers le cytosol pour initier la biosynthèse de novo des acides gras et la production d’acétate est essentielle à la croissance du parasite. La navette acétate fait intervenir dans la mitochondrie l’acétate:succinate CoA-transférase (ASCT), qui converti l'acétyl-CoA produit à partir du glucose en acétate. Nous avons identifié et caractérisé une autre enzyme mitochondriale contribuant aussi à la production d’acétate à partir du glucose : l’acétyl-CoA thioesterase (ACH). Le double mutant n’exprimant ni l’ACH ni l’ASCT ne produit plus d’acétate et n’est plus viable, confirmant le rôle essentiel de la production d’acétate. Par ailleurs, nous avons montré que l’ASCT, grâce au cycle formé avec la succinyl-CoA synthétase (SCoAS), contribue à la production d’ATP par phosphorylation au niveau du substrat dans la mitochondrie, mais l’ACH n’est pas impliqué dans la production d’ATP. La thréonine est l’acide aminé le plus rapidement consommé par le parasite et sa dégradation aboutit à la production d’acétate et de glycine. En utilisant des outils de génétique inverse et des analyses métaboliques par RMN du proton et HPTLC, nous avons caractérisé la première étape enzymatique de cette voie, catalysée par la thréonine déshydrogénase (TDH), et nous avons montré que la thréonine est la principale source de carbone pour la production d’acétate, pour la biosynthèse de novo des acides gras et des stérols. L’acétyl-CoA est produit dans la mitochondrie à partir du pyruvate provenant de la dégradation du glucose par le complexe pyruvate déshydrogénase (PDH) et à partir de la thréonine dont la dégradation est initiée par la TDH. L’acétyl-CoA provenant de la dégradation du glucose ou de la thréonine est converti en acétate par les mêmes enzymes, l’ACH et l’ASCT. Nous avons montré que la voie de dégradation de la thréonine est sous régulation métabolique. L’activité et l’expression de la TDH ainsi que la production d’acétate à partir de la thréonine sont diminuées dans le mutant knock out de la phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) dans lequel le flux glycolytique est redirigé vers la production d’acétate. De plus, contrairement au glucose, la dégradation de la thréonine ne participe pas à la production d’ATP dans la mitochondrie du parasite. Nos résultats nous amène à l’hypothèse d’un channeling mitochondrial des voies de dégradation du pyruvate et de la thréonine pour la production d’acétate. Les trypanosomes ont développé une voie de biosynthèse de novo des acides gras faisant appel aux élongases du réticulum endoplasmique et un précurseur inhabituel, le butyryl-CoA dont la voie de biosynthèse n’est à l’heure actuelle pas connue chez les trypanosomatidés. Nous avons reconstitué une voie de biosynthèse hypothétique à partir de l’acétyl-CoA dans la mitochondrie. La dernière enzyme de cette voie, l’isovaléryl-CoA déshydrogénase (IVDH), a été caractérisée, et nos premiers résultats indiquent que cette enzyme est impliquée dans la production du butyryl-CoA. / Trypanosoma brucei, a flagellated protozoan parasite of the kinetoplastidae order, is responsible for human sleeping sickness or human african trypanosomiasis (HAT). Its life cycle is complex and involves a haematophageous insect vector (tse-tse fly or Glossina), which ingests parasites during a blood meal on an infected host. After a series of differentiations, the parasites are injected to another host during another blood meal. We studied the energy and intermediary metabolism of the procyclic form of T. brucei, which is present into the midgut of the tse-tse fly. In this parasite, glucose degradation produces acetate into the mitochondria of the parasite and succinate into both the mitochondria and the glycosomes. Glycosomes are specific organites of trypanosomatids in which the glycolysis is compartimentalized. T. brucei uses an "acetate shuttle" to transfer acetyl-CoA from the mitochondrion to the cytosol to feed de novo fatty acids biosynthesis. This acetate production is essential for cell viability. The "acetate shuttle" involves inside the mitochondrion, the acetate:succinate CoA-transferase (ASCT), which converts glucose-derived acetyl-CoA into acetate. We identified and characterised a new mitochondrial enzyme involved in acetate production from glucose, in addition to ASCT: the acetyl-CoA thioesterase (ACH). Indeed, a double mutant affecting expression of both ACH and ASCT doesn’t produce anymore acetate and is lethal, which confirms the essential role of mitochondrial production of acetate. In addition, we showed that ASCT, via the ASCT/SCoAS (succinyl-CoA synthetase) cycle, contributes to mitochondrial ATP production by substrate phosphorylation, while ACH is not involved in ATP production. We also observed that contribution of the ASCT/SCoAS cycle and oxidative phosphorylation by the mitochondrial F0-F1-ATP synthase to ATP production are similar. Threonine is the most rapidly consumed amino acid by the procyclic trypanosomes and its degradation produces acetate and glycine. Using a combination of reverse genetics, proton NMR metabolic profiling and HPTLC, we characterized the first enzymatic step of the pathway, catalysed by the threonine dehydrogenase (TDH) and showed that threonine is the main carbon source for acetate production, de novo fatty acids and sterol biosynthesis. Acetyl-CoA is produced into the mitochondrion from glucose-derived pyruvate by the pyruvate dehydrogenase complex (PDH) and by the two first steps of the threonine degradation pathway, including TDH. Both glucose-derived and threonine-derived acetyl-CoA is then converted into acetate by the same enzymes, ACH and ASCT. We also found that the threonine degradation pathway is under metabolic control. Indeed, TDH activity, TDH expression and threonine-derived acetate production are reduced in the phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) knock out mutant, in which glycolytic flux is redirected towards acetate production. In addition, we showed that, as opposed to glucose-derived acetyl-CoA, metabolism of threonine-derived acetyl-CoA doesn’t contribute to ATP production into the mitochondrion of the parasite. Our results suggest the existence of mitochondrial metabolic channelings, which disconnect pyruvate and threonine degradation pathways leading to acetate production. Trypanosomes developed a specific de novo fatty acids biosynthesis pathway using elongases located in the endoplasmic reticulum and an unusual primer, butyryl-CoA. The biosynthesic pathway of butyryl-CoA has not been investigated so far in trypanosomatids. Genomic data mining of the T. brucei database, highlights an hypothetical mitochondrial biosynthesis pathway from acetyl-CoA to butyryl-CoA. The last enzyme of this pathway, isovaleryl-CoA dehydrogenase (IVDH), was characterised and our first results suggest that this enzyme is indeed involved into butyryl-CoA production.

Dans leurs membranes natives, les protéines membranaires peuvent former des assemblages multimériques impliqués dans un grande variété de processus biologiques, de la transduction du signal à la structuration d'organelles. Leur agrégation est influencée par relations qu'elles entretiennent avec la membrane. Au cours de cette thèse, j'étudie l'influence mutuelle des protéines membranaires et de leur environnement au moyen de simulations numériques. L'étude d'un un complexe peptide-détergent modèle a révélé la présence d'une compétition entre deux forces : la cohésion entre les détergents maintenant la structure micellaire, et les interactions adhésives à certaines surfaces peptidiques. L'équilibre entre ces forces conduit à une frustration du système et à l'exposition de surfaces hydrophobes au solvant, expliquant les phénomènes d'agrégations observées expérimentalement. Ces résultats montrent l'importance de la topologie des surfaces du peptide dans l'organisation du complexe. Pour caractériser l'influence de la composante protéique sur les amphiphiles, un estimateur d'entropie configurationelle des chaînes grasses a été développé. Les mesures réalisées sur 15 systèmes membranaires gros grains montrent que la capacité des protéines à apparier l'épaisseur hydrophobe membranaire à la leur est le facteur principal responsable des variations entropiques. Cependant, au delà des simples contributions de l'épaisseur hydrophobe protéique, la diversité des comportements observés dans la première couche de lipides au contact avec la protéine montre bien un rôle de la topologie dans la modulation des interactions. Les variations observées à plus longues distances semblent alors être un facteur clé dans les interactions entre protéines membranaires. Dans le cadre d'une collaboration, la description d'un membranaire par microscopie à force atomique haute vitesse a permis de caractériser le paysage énergétique des interactions entre protéines membranaires. En combinant ces résultats avec ceux obtenus par simulations de dynamiques moléculaires, des chemins basses énergies on pu être identifiés et soulignent de nouveau l'importance des lipides dans l'organisation et la dynamique des agrégats protéiques. L'ensemble de ces données permettent alors de mieux comprendre l'influence mutuelle entre les protéines et les amphiphiles constituant leur environnement et les phénomènes d'agrégation protéiques dans un contexte biologique et expérimental. / In their native membranes, membrane proteins can form multimeric assemblies implicated in a wide range of biological processes, from signal transduction to organelle structure. Their aggregation is influenced by the relations they have with the membrane. Through this thesis, I study the mutual influence between membrane proteins and their environment using numerical simulations. The study of a model protein detergent complex has revealed the presence of two competing forces : cohesion between detergents maintaining the micellar structure, and adhesive interactions to certain peptide surfaces. The balance between these forces leads to a certain frustration of the system, and to the exposure of hydrophobic surfaces to the solvent, explaining phenomena observed experimentally. These results show the importance of peptide surface topology on the organization of the complex. To characterize the influence of the protein component on amphiphiles, a configuartional entropy estimator has been developed. Measures realized on 15 coarse grained membrane systems show that the protein ability to match the membrane hydrophobic thickness to its own is the main factor responsible for entropic variations. However, beyond the simple contributions of protein hydrophobic width, the variety of behaviors in the first shell of lipids show a role of proteins in interaction modulation. Variations observed at longer ranges then seem to be a key factor in the interactions between membrane proteins. In the context of a collaboration, the description of a membrane plane by high speed atomic force microscopy allowed to characterize the energetic landscape of interactions between membrane proteins. By combining these results with those obtained by coarse grained molecular dynamics simulations, low energy paths have been identified and underly the importance of lipids in the organization and dynamics of proteins aggregates. All these data allow to further understand the mutual influence between proteins and amphiphiles constituting their environment and the aggregations phenomena in a biological and experimental context.

La synthèse de nitriles gras à partir de ressources renouvelables est un domaine qui attire depuis quelques temps les industries de la parfumerie, des polymères et des biocarburants pour avion. Ce travail de thèse s’est plus particulièrement intéressé à réduire de 100°C la température de travail pour les procédés en phase liquide et gaz, au moyen de catalyseurs plus efficaces. Le procédé en phase liquide a été étudié en terme de catalyse homogène et les formes actives à base de zinc ou indium ont été plus particulièrement détaillées ; des conditions ont été établies pour obtenir une réduction de 50°C de la température de travail. Le procédé en phase gaz a été étudié en terme de catalyse hétérogène, les catalyseurs obtenus ou synthétisés étant caractérisés par microcalorimétrie d’adsorption ; des corrélations entre la conversion de l’ester et l’acidité du lit catalytique ont été trouvées à 300°C, et des conditions expérimentales ont été développées pour obtenir une conversion totale à une température réduite de 100°C sur des catalyseurs choisis / The production of fatty nitriles from renewable sources has lately become attractive for the perfume, polymer and aviation biofuel industry. The present work investigated both liquidand gas-phase processes in the aim of developing catalysts working at 200°C, this is 100°C lower than the state-of-the-art. Homogeneous catalysis was described with zinc and indium based species for the liquid-phase process, succeeding in reducing by 50°C the operating temperature. Heterogeneous catalysts with acid-base features were characterized by adsorption calorimetry and tested in the gas-phase process, leading to correlations between acidity and ester conversion at 300°C, while conditions were found on selected catalysts in order for the process to perform the complete conversion of esters into nitriles at 200°C

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L’idée directrice de ce travail de thèse était d’introduire au sein de mésophases lipidiques des molécules de β-cyclodextrine (βCD) amphiphiles obtenue par bio-estérification afin d’obtenir des nano-assemblages plurimoléculaires et multi-compartimentés combinant trois fonctions essentielles pour le transport ou la vectorisation de molécules thérapeutiques : (i) la capacité d’incorporer une substance d’intérêt par formation de complexe d’inclusion avec la cyclodextrine ; (ii) être biocompatibles et aptes à passer facilement les barrières biologiques ; (iii) pouvoir co-incorporer une seconde substance d’intérêt, hydrophile ou hydrophobe, dont l’action biologique soit différente de celle assurée par la première substance. L’ensemble des travaux ont porté sur le dérivé βCD-C10 polysubstitué en face secondaire par des chaînes hydrocarbonées en C10 avec un degré moyen de substitution de 7,5. L’association de ce dérivé avec trois catégories de lipides a été envisagée : des tensioactifs micellaires non-ioniques (Brij 98, Polysorbate 80, n-dodécyl-β-D-maltoside), un lipide lyotrope non lamellaire formant des mésophases de type cubique bicontinue (monooléine), un phospholipide s’auto-organisant en bicouches propices à l’obtention de vésicules (dimyristoyl phosphatidylcholine). Selon une démarche principalement physico-chimique, différentes techniques ont été mises en œuvre pour caractériser les systèmes mixtes lipide/βCD-C10 aux échelles moléculaire et supramoléculaire : diffusion-diffraction des rayons X, calorimétrie différentielle, spectrophotométrie d’absorption UV-visible, spectroscopie de fluorescence, diffusion de la lumière statique (turbidimétrie) ou quasi-élastique, microscopie optique et microscopie électronique par cryo-transmission. L’ensemble des résultats démontrent que le dérivé βCD-C10 forme spontanément ou selon un protocole très simple, des assemblages plurimoléculaires mixtes avec les trois catégories de lipides, assemblages dont la topologie dépend de la structure chimique du lipide et du taux de cyclodextrine amphiphile incorporé (tubules, vésicules uni- ou oligolamellaires, cubosomes). Ces assemblages sont stables et capables d’incorporer une substance hôte hydrophobe, notamment les vésicules mixtes tensioactif non-ionique/ βCD-C10 et les cubosomes mixtes monooléine/P80/ βCD-C10. / The key idea of this Ph.D. thesis is to introduce amphiphilic β-cyclodextrin molecules (βCD), obtained by bio-transesterification, within lipid mesophases in order to obtain multi-compartment plurimolecular nano-assemblies, which combine three essential functions for transport or delivery of therapeutic molecules: (i) capacity to incorporate a substance of interest through formation of inclusion complexes with the modified cyclodextrin; (i) biocompatibility and ability to easily pass the biological barriers; and (iii) possibility for co-encapsulation of a second substance of interest, a hydrophilic or a hydrophobic one, whose biological action is different from that provided by the first substance. The performed Ph. D. work focused on the β-cyclodextrin derivative βCD-C10 with an average degree of substitution of 7.5 of the secondary face of the macrocycle by hydrocarbon chains C10. The association of this derivative with three classes of amphiphiles was studied: (i) nonionic micellar surfactants (Brij 98, Polysorbate 80, n-dodecyl β-D-maltoside), (ii) a lyotropic nonlamellar lipid forming bicontinuous cubic mesophases (monoolein), and (iii) a phospholipid (dimyristoyl phosphatidylcholine), which self-ssembles into bilayer membranes permitting the production of vesicles.The employed physical-chemical approach involved different techniques for characterization of the mixed βCD-C10/lipid systems at molecular and supramolecular levels: cryo-transmission electron microscopy, X-ray diffraction, differential scanning calorimetry, UV-visible absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy, turbidimetry, and quasi-elastic light scattering.The obtained results indicated that the βCD-C10 derivative forms spontaneously (or via a very simple preparation protocol) plurimolecular mixed nano-assemblies with the three types of lipids. The topologies of the resulting nano-assemblies essentially depend on the chemical structures of the lipids and the degree of incorporation of the amphiphilic cyclodextrin (tubules, unilamellar or oligolamellar vesicles, and cubosomes). These assemblies, namely the mixed vesicles of nonionic surfactant/βCD-C10 and the cubosomes of mixed monoolein/P80/βCD-C10 compositions, are stable and capable of incorporation of hydrophobic guest substances.

La notion de biomarqueurs est définie comme « une caractéristique mesurée objectivement et évaluée comme indicateur de processus biologiques normaux ou pathologiques, ou de réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique ». L'intérêt scientifique pour les biomarqueurs est de plus en plus important. Ils permettent, entre autres,une meilleure compréhension des processus pathologiques et de diagnostiquer, voire pronostiquer ces pathologies. Les études « omiques » telles que la lipidomique jouent un rôle essentiel dans la découverte de nouveaux biomarqueurs. La lipidomique consiste à explorer le lipidome d'un échantillon biologique et à déceler l'impact de la pathologie sur ce dernier. Les lipides constituent une vaste et importante famille de métabolites retrouvés dans toutes les cellules vivantes, dont leur nombre est estimé à plus de 100 000 espèces chez les mammifères. Ils sont impliqués, notamment, dans le stockage d'énergie et la transduction de signal. Mon travail de thèse a reposé sur la réalisation d'approches lipidomiques en LC-MS sur diverses applications en santé telles que le syndrome de déficit immunitaire combiné sévère associé à une alopécie et une dystrophie des ongles, le syndrome du nystagmus infantile et le rejet de greffe rénale. A cette fin, des analyses statistiques multivariées et univariées ont été employées pour déceler des potentiels lipides biomarqueurs. / Biomarker was defined as "a characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological processes, pathogenic processes, or pharmacological responses to therapeutic intervention". The scientific interest in biomarkers is more and more important. They allow, in particular, to better understand pathogenic processes and to diagnose, even to predict pathologies. "Omics" studies, such as lipidomics, play an essential role in the new biomarkers discovery. Lipidomics consist in exploring biological samples lipidome and in detecting pathogenic impact on this latter. Lipids are a large and important metabolite family found in all living cells. Their quantity is estimated to more than 100,000 species in mammals. They are involved, in particular, in the energy storage and the signal transduction. My PhD thesis involved carrying out lipidomics approaches with LC-MS through various health applications such as severe combined immunodeficiency associated with alopecia syndrome, infantile nystagmus syndrome and renal graft rejection. For this purpose, multivariate and univariate statistical analyses were carried out in order to detect potential lipid biomarkers.

Les peptides pénétrateurs de cellule (CPP) sont des oligopeptides cationiques faisant parti des vecteurs les plus étudiés dans le cadre du développement du transport ciblé de médicament à l’intérieur de l’organisme. Les applications principales sont par exemple le traitement des cancers ou la thérapie génique. Néanmoins, certaines caractéristiques des CPPs rendent leur utilisation médicale compliquée, tels que leur manque de spécificité à l’égard des cellules cibles ou la perte de leurs propriétés pénétrantes lorsqu’un cargo moléculaire leur est greffé. L’une des solutions envisagées pour résoudre ces problèmes est le greffage sur des polypeptides di-blocs auto-assemblés basés sur de l’élastine (ELPBC), des systèmes développés par l’équipe d’Ashutosh Chilkoti à l’Université de Duke (USA). Des travaux précédents ont montré que ces macromolécules, que l’on appelle CPP-ELPBC, retrouvaient les propriétés pénétrantes du CPP même en présence d’un cargo et permettaient également d’induire une spécificité à l’encontre des cellules cancéreuses. En revanche, le mécanisme de pénétration de ces systèmes restait inconnu.Dans cette thèse, je me suis concentré sur l’étude du mécanisme de pénétration des CPP et des CPP-ELPBC au travers de membranes lipidiques modèles, et en particulier sur l’adsorption de ces molécules à la surface de vésicules unilamellaires géantes (GUV). Le développement d’une nouvelle méthode de quantification de la fluorescence en microscopie confocale m’a permis de réaliser des mesures simples de comptage de peptides à la surface des vésicules, ce qui m’a permis par la suite de procéder à des mesures thermodynamiques de l’adsorption des peptides. / Cell-penetrating peptides (CPP) are cationic oligopeptides currently investigated as potential vectors for targeted drug delivery design, for applications in cancer treatment and/or gene therapy. Nevertheless, some drawbacks make the CPP complex for medical applications, such as their lack of specificity toward target cells or the loss of their penetrating properties once they have been grafted with a molecular cargo. One of the solutions studied to overcome these issues is the binding of the CPP unit on a self-assembling elastin-like diblock polypeptide (ELPBC), a macromolecular system designed by the team of Ashutosh Chilkoti from Duke University (USA). While it has already been proven that these molecules, named CPP-ELPBC, recover the penetrating properties of the CPP despite the presence of a cargo and also induce a selectivity toward tumorous cells, the exact mechanism of translocation is still under debate.In this PhD thesis, I focused on the investigation of the translocation mechanism of the CPP and CPP-ELPBC using model lipid membranes, and specifically the adsorption of these molecules at the surface of giant unilamellar vesicles (GUV). The development of a new quantification method of fluorescence in confocal microscopy allowed me to directly count the peptides adsorbed on the surface of the GUVs, which I used to perform thermodynamic measurements on the peptide adsorption.

Ce travail concerne l’altération du comportement de phase de membranes lipidiques lors de leur interaction avec des molécules hydrophiles ou hydrophobes. L’utilisation de sondes moléculaires de fluorescence sensibles à leur micro-environnement constitue un aspect majeur de ce travail. Les techniques de spectroscopie de fluorescence et de microscopie confocale ont été mises à profit pour l’étude du comportement de ces sondes, donnant accès au degré de compacité et d’ordre dans les membranes.Nos résultats montrent que le polystyrène, un plastique rencontré de façon commune dans les régions polluées des océans, présente la capacité de modifier le comportement de phase des membranes lipidiques, entrant notamment en compétition avec le cholestérol.Nous avons montré que la présence élevée de sucres, tel que l’on peut le rencontrer dans certaines situations relevant de la bio-préservation, a pour effet de rompre la qualité de compaction des lipides, et nous avons proposé un nouveau modèle thermodynamique pour interpréter nos résultats.Enfin, les effets sur la membrane de l’incorporation d’un polymère amphiphile comportant un cholestérol greffé ont été étudiés, dans le cadre de l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques à base de lipides. / This work focuses on the alterations of lipid membrane phase behavior upon interaction with hydrophobic and hydophilic molecules. One major aspect of this thesis is the employement of environment sensitive probes to obtain information on the lipid bilayer packing by means of confocal spectral imaging and fluorescence spectroscopy. Our results show that polystyrene, a commonly found plastic in ocean wastes, has the ability to disrupt the lipid bilayer phase behavior and has a competitive interaction with cholesterol. The presence of high concentration of sugars, relevant in the field of biopreservation, has been found to alter the lipid bilayer packing and a new thermodynamics model has been proposed to complement the experimental results. Finally, the effects of an amphiphilic cholesterol-grafted polymer on model membrane was investigated, providing insight into potential new lipid therapeutic strategies.

Les sphingolipides sont une famille de lipides membranaires dotés d'un rôle structural, influant sur les propriétés de la bicouche lipidique, mais ils agissent aussi comme des molécules effectrices au rôle essentiel dans de nombreux aspects de la biologie cellulaire. Les sphingolipides céramide, sphingosine et S1P ont des effets opposés: le céramide et la sphingosine inhibent la prolifération et promeuvent la réponse apoptotique à différents stimulus de stress, la S1P est un stimulateur de la prolifération et de la survie cellulaires. Le céramide peut être produit par la voie de synthèse de novo, et l'hydrolyse de la sphingomyéline membranaire catalysée par les sphingomyélinases. Ces deux voies peuvent être activées par la cytokine pro-inflammatoire TNFa, capable d’induire une perte musculaire et jouant un rôle crucial dans le développement de la cachexie. Nous avons fait l'hypothèse que le céramide, ou un de ses métabolites, peuvent être des médiateurs de la perte musculaire tumeur-induite. Nous avons examiné le rôle du céramide dans l'atrophie induite in vitro par le TNFa chez les myotubes, en utilisant des analogues de céramide et des inhibiteurs du métabolisme sphingolipidique. L'apport de céramides exogènes est capable de reproduire l'effet atrophique du TNFa, ce qui suggère que le céramide peut participer à l'atrophie musculaire. Pour vérifier si les céramides sont les médiateurs de l'atrophie induite par le TNFa, nous avons analysé l'effet d'inhibiteurs ciblant différentes étapes du métabolisme: l'inhibition de la voie de synthèse de novo est incapable de rétablir la taille des myotubes en présence de TNFa, alors que les inhibiteurs de sphingomyélinase neutre suppriment l'atrophie TNFa-induite. L’accumulation de céramide et de sphingosine augmente l’effet pro-atrophique, tandis que la S1P a un effet protecteur. Ces observations montrent que, dans les myotubes, le céramide, ou un métabolite produits par la voie de la sphingomyélinase neutre en réponse à une stimulation par le TNFa, participent à l'atrophie des cellules. Pour évaluer le rôle in vivo des sphingolipides, nous avons traité la souris BalbC porteuse d’un carcinome C26 avec myriocine, inhibiteur de la synthèse de novo, capable d'induire une déplétion du muscle en sphingolipides, Ce traitement protège partiellement les souris contre la perte de poids corporel et de poids des muscles induite par la tumeur, sans affecter la taille de celle-ci. De plus, la myriocine réverse significativement la perte de taille des fibres musculaires et réduit l'expression des atrogenes, ce qui montre qu'elle protège le muscle contre l'atrophie. Ces résultats suggèrent fortement que le céramide, ou un métabolite sphingolipidique en aval, est impliqué dans l'atrophie musculaire tumeur-induite. La voie des sphingolipides apparaît donc comme une nouvelle cible potentielle d'interventions pharmacologiques visant à protéger le tissu musculaire contre l'atrophie. / The sphingolipids are a family of membrane lipids with only a structural role, influencing lipid bilayer properties, but they also act as effector molecules with essential roles in many aspects of cell biology. The sphingolipids ceramide, sphingosine and S1P have shown opposite effects: whereas ceramide and sphingosine usually inhibit proliferation and promote apoptotic responses to different stress stimuli, S1P is known to stimulate cell growth, and promote cell survival. Ceramide can be produced through the de novo synthesis pathway, and by membrane sphingomyelin hydrolysis catalyzed by sphingomyelinases. Both pathways can be activated by the pro-inflammatory cytokine TNFa. Because this cytokine has been shown to promote muscle loss and seems to be crucial in the development of cachexia, we hypothesized that the formation of ceramide, or a metabolite, can be involved in tumor-induced muscle wasting. We investigated the role of ceramide in the in vitro atrophic effects of TNFa on differentiated C2C12 myotubes, by using cell permeant ceramides and inhibitors of sphingolipid metabolism. We observed that TNFa atrophic effects, as evaluated by the reduction in myotube area, are mimicked by exogenous ceramides, supporting the idea that ceramide can participate in muscle atrophy. To verify if ceramide is a mediator of TNFa-induced atrophy, and to identify the metabolites potentially involved, we analyzed the effects of drugs able to block sphingolipid metabolism at different steps: the inhibition of de novo synthesis pathway was unable to restore myotube size in the presence of TNFa whereas the inhibitors of neutral sphingomyelinases reversed TNFa-induced atrophy. Moreover, an accumulation of ceramide and sphingosine induced pro-atrophic effects, whereas sphingosine-1-phosphate had a protective effect. These observations establish that in C2C12 myotubes, ceramide or other downstream metabolites such as sphingosine, produced by the neutral sphingomyelinase pathway in response to TNFa stimulation, participate in cell atrophy. To evaluate the in vivo role of sphingolipids, we treated BalbC mice carrying C26 adenocarcinoma woth Myriocin, an inhibitor of the de novo pathway of ceramide synthesis, that is able to deplete muscle tissue in all sphingolipids, was administered daily to the animals. This treatment partially protected animals against tumor-induced loss of body weight and muscle weight, without affecting the size of tumors. Moreover, myriocin treatment significantly reversed the decrease in myofiber size associated with tumor development, and reduced the expression of atrogenes Foxo3 and Atrogin-1, showing that it was able to protect against muscle atrophy. These results strongly suggest that ceramide, or a downstream sphingolipid metabolite, is involved in tumor-induced muscle atrophy. The sphingolipid pathway thus appears as a new potential target of pharmacological interventions aiming at protecting muscle tissue against atrophy.