Les membranes plasmiques et les membranes du trans-Golgi des cellules eucaryotes présentent une asymétrie des lipides qui les composent, avec les aminophospholipides (APLs : phosphatidylsérine et phosphatidyléthanolamine) enrichis dans le feuillet cytosolique. La dissipation de cette asymétrie est impliquée dans de nombreux processus (patho)physiologiques. Plusieurs études suggèrent que les ATPases P4 sont les candidats les plus probables pour le transport des APLs et le maintien de leur distribution asymétrique ; leur délétion dans la levure inhibe le trafic membranaire. En outre, des études ont montré que les ATPases P4 interagissaient avec les protéines de la famille CDC50 ; cette interaction est essentielle pour l’adressage et peut-être aussi la fonction des ATPases P4. Afin de contribuer à la compréhension du mécanisme de transport des lipides par les ATPases P4, l’objectif de ce travail a été de mettre au point la co-expression fonctionnelle, dans la levure, de l’ATPase P4 Drs2p et de sa protéine partenaire Cdc50p. Nous avons obtenu une fraction membranaire enrichie à 3% avec la protéine Drs2p, majoritairement en complexe avec Cdc50p. L’étude fonctionnelle du complexe nous a permis de mettre en évidence un rôle crucial du phosphatidylinositol-4-phosphate (PI(4)P), un important régulateur du trafic membranaire, au cours d’une étape particulière du cycle catalytique. Nous avons également développé un protocole de purification sur résine streptavidine du complexe Drs2p/Cdc50p. Enfin, comme un site potentiel d’interaction avec le PI(4)P est présent sur l’extrémité C-terminale de Drs2p, nous avons engendré différentes constructions de Drs2p, dans lesquelles une partie de l’extrémité C-terminale a été délétée ; dans une autre construction, l’extrémité N-terminale a également été délétée. Notre travail ouvre la voie à la caractérisation fonctionnelle et structurale détaillée du complexe Drs2p/Cdc50p, et à l’étude du rôle du transport de lipides dans le trafic membranaire. / Trans-Golgi membranes and plasma membranes of eukaryotic cells are asymmetric, with their cytosolic leaflet enriched in aminophospholipids (APLs: phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine). Dissipation of this asymmetry is involved in many (patho)physiological processes. P4 ATPases are prime candidates for APL transport and for maintaining asymmetry across membranes. In addition, yeast deleted for P4 ATPases display membrane trafficking defects. Besides, CDC50 proteins have been shown to interact physically with P4 type ATPases, and this interaction is important for addressing the complex to the right destination, and possibly also for its function. To gain insight into the molecular mechanism of lipid transport by P4 ATPases, the goal of my thesis was to develop the co-expression, in yeast, of a functional P4 ATPase, Drs2p, together with its partner, Cdc50p. The strategy we developed allowed us to obtain a membrane fraction enriched in Drs2p (~3%), mainly in complex with Cdc50p. Functional characterization of the complex identified phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P), a major regulator of membrane trafficking, as a crucial component for rapid completion of the Drs2p/Cdc50p catalytic cycle. We also purified the complex in one step on streptavidin beads. Finally, we started investigating the potential auto-inhibitory roles of the C-terminus (as the C-terminus of Drs2p contains a PI4P binding site) and the N-terminus of Drs2p, by expressing various truncated versions of Drs2p. Our work sets the stage for detailed functional and structural characterization of the Drs2p/Cdc50p complex and its role in membrane traffic.

Les leishmanioses sont des parasitoses en constante évolution, et l’accroissement d’apparitions de résistances vis-à-vis des traitements disponibles en fait une des préoccupations majeures des organismes de santé publique dans le monde. La miltefosine est actuellement le seul antileishmanien actif par voie orale. Son mécanisme d’action implique les lipides et notamment les phospholipides membranaires du parasite.Afin d’évaluer les effets de la miltefosine sur le parasite ainsi que les mécanismes de résistances, une étude lipidomique d’un clone de Leishmania donovani cultivé sous différentes conditions (traité, résistant, résistant-traité) a été réalisée dans le présent travail. Des analyses couplant une séparation des phospholipides en Chromatographie Liquide Haute-Performance à polarité de Phase Normale (NP-HPLC) avec un Spectromètre de Masse (MS) équippé d’une source d’Ionisation ElectroSpray (ESI) ont été traitées par chimiométrie, à l’aide d’une Correction Orthogonale du Signal suivie d’une Analyse Discriminante par Moindre Carrés Partiels (OSC-PLS-DA). Les principales espèces moléculaires permettant de distinguer les différentes cultures ont ensuite fait l’objet d’une identification structurale par spectrométrie de masse en tandem. Des hypothèses métaboliques ont pu être posées.Puis l’étude a été étendue à une plus grande variété de lipides, séparés par NP-HPLC. Pour cela une comparaison des sources d’ionisation à pression atmosphérique (ESI, Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique et PhotoIonisation à Pression Atmosphérique) a été nécessaire afin de sélectionner la mieux adaptée pour un tel couplage. Les mécanismes d’action de la miltefosine et de l’amphotéricine B ont alors fait l’objet d’une étude lipidomique. / Leishmaniasis is a more and more spreading disease, and resistance of parasites toward antileishmanial drugs is a concern for public safety organizations troughout the world. Miltefosine is the only oral drug, and its mechanism of action implies membrane lipids, and phospholipids, of parasite cells.In order to assess this mechanism of action, and resistance mechanisms developed, a lipidomic study of Leishmania donovani strains (treated, resistant, treated-resistant) was performed in the present work. A Normal-Phase High-Performance Liquid Chromatography (NP-HPLC) was coupled to an ElectroSpray Ionisation Mass Spectrometer (ESI-MS) to analyze phospholipids, and data were computed using an Orthogonal Signal Correction-Partial Least Squares-Discriminant Analysis (OSC-PLS-DA). Molecular species responsible for the differenciation of strains were then structuraly identified using tandem mass spectrometry. Hypotheses on metabolic pathways implied were then proposed.The study was then extended to a broader range of lipids, also analyzed through NP-HPLC-MS. A comparison of Atmospheric Pressure Ion sources (ESI, Atmospheric Pressure Chemical Ionization and Atmospheric Pressure PhotoIonization) was thus necessary in order to select the most suitable source. A lipidomic study was then performed to assess mechanisms of action and mechanisms of resistance concerning miltefosine and Amphotericin B.

L’objectif de la thèse était d'identifier s’il existait des différences d’utilisation digestive et métabolique des glucides alimentaires entre deux lignes de truite sélectionnées pour leur teneur divergente en lipides intramusculaires: la lignée maigre (L) à faible taux de lipides dans le muscle et la lignée grasse (F) à teneur élevée de lipides musculaires. Dans ce but les deux lignées ont été nourries avec deux aliments, un contenant des glucides alimentaires (20% d’amidon), l’autre ne contenant pas. Chez les deux lignées, la présence d’amidon dans les régimes n’a pas eu d’effets sur la croissance, a été associée à une épargne protéique, et a provoqué une hyperglycémie postprandiale modérée, en induisant les acteurs impliqués dans la signalisation cellulaire (TOR/AMPK). Aucune différence entre les deux lignées n’a été observée pour la digestion de l'amidon, le niveau d’expression des gènes codant les transporteurs de glucose dans l’intestin, la glycémie postprandiale et l'utilisation périphérique du glucose (muscle et tissu adipeux). Par contre, la lignée F se caractérise par une croissance et une efficacité alimentaire plus faibles, des capacités plus élevées de stockage du glucose sous forme de glycogène hépatiques et de lipogenèse (sans impact sur l’utilisation des glucides) et un métabolisme lipidique spécifique (plus faible catabolisme des acides gras, plus fortes capacités à synthétiser des chylomicrons et à bio-convertir des acides gras). Dans une seconde étude, le remplacement de l'huile de poisson de l’aliment par un mélange d'huiles végétales a supprimé la plupart des différences moléculaires observées précédemment entre les deux génotypes. Toutefois, l’apport de glucides alimentaires a alors entrainé des modifications métaboliques au niveau intestinal et hépatique avec, par exemple, l’induction des capacités moléculaires de bioconversions des acides gras. Globalement, nos données ont donc démontré qu’il existait des différences métaboliques importantes entre les deux lignées mais que cela n’aboutissait pas à une meilleure utilisation des glucides alimentaires. En outre, nos travaux soulignent l'importance de la composition des aliments dans les réponses' des différents génotypes de poissons. / The aim of the thesis was to characterise the differences in digestive and metabolic utilisation of dietary carbohydrates between two lines of rainbow trout divergently selected for muscle fat content (Fat-F and Lean-L), when fed diets with (20%) or without gelatinised starch. In both lines, starch intake did not adversely affect growth, resulted in a moderate postprandial hyperglycemia, enhanced protein/lipid retention and a distinct intracellular signalling pattern in the liver involving the energy sensor AMPK and nutrient sensor TOR-S6. No difference between the two lines was observed for the apparent digestibility of starch, the mRNA levels of genes encoding glucose transporters in the intestine, regulation of postprandial glycemia and utilisation of glucose in the peripheral tissues (muscle and adipose tissue). However when compared to the L line, the F line was characterised by lower growth and feed efficiency; better capacity to store excess glucose as indicated by higher glycogen levels and mRNA levels of lipogenic markers in the liver (with no impact on glucose homeostasis); and a specific lipid metabolism (a greater potential to synthesise chylomicrons and to bioconvert fatty acids, coupled with a lower potential to oxidise fatty acids). In a separate study, replacement of fish oil in the diet with a blend of vegetable oils was found to suppress most of the molecular differences previously observed between the two genotypes. Starch intake under the vegetable oil diet regime led to different metabolic changes in the intestine and liver, for example, elicited a higher transcriptional response of key desaturase and elongase enzymes in both lines. Overall, our data demonstrated the existence of significant metabolic differences between the two trout lines, but it did not lead to better utilisation of dietary carbohydrates. In addition, our work highlights the importance of diet composition in the growth and metabolic response of different genotypes of fish.

Lors de la dégustation d’un vin, les tannins sont responsables de deux propriétés gustatives, l’amertume et l’astringence, respectivement dues à des associations avec les protéines salivaires et les récepteurs au goût amer. Néanmoins, leurs intensités perçues en bouche vont dépendre de multiples facteurs, notamment la présence de molécules externes aux complexes tannin-protéine tel que les lipides, qu’ils soient situés au niveau des membranes buccales ou issus de l’alimentation. L’objectif de cette thèse a ainsi été d’examiner l’impact des lipides sur ces sensations organoleptiques. Pour ce faire, cette étude, réalisée principalement par RMN, s’est intéressée aux interactions tannin-lipide sur des modèles de membranes buccales et d’émulsions de gouttelettes lipidiques. Nous avons pu alors étudier l’interaction tannin-lipide en termes de localisation, d’affinité et de dynamique. Nos résultats montrent dans un premier temps une localisation du tannin à l’interface de tous les modèles utilisés. En outre, l’insertion de tannins au niveau des vésicules multilamellaires, modèle utilisé pour mimer les membranes buccales, entraîne une fluidification de ce système lipidique. Il a été montré que cet effet fluidifiant dépend de la structure du tannin, de la présence d’éthanol et de la teneur en cholestérol du système lipidique. Enfin, un protocole permettant d’obtenir les constantes d’associations tannin-lipide par RMN a été établi. Ces dernières se sont révélées du même ordre de grandeur que celles relatives aux interactions tannin-protéine salivaire. Ces résultats montrent que les lipides auraient une influence d’une part sur l’astringence via une compétition entre les interactions tannin-lipide et les interactions tannin-protéines salivaires et d’autre part sur l’amertume en perturbant la dynamique de la membrane, ce qui pourrait induire une perturbation des récepteurs gustatifs. / When tasting a wine, tannins are responsible of two gustative properties, bitterness and astringency, respectively due to association between tannins and salivary proteins or bitter receptors. However, perceived intensities depend on several factors, including the presence of external molecules such as lipids, either located in the buccal membranes or from food. The main objective of this thesis was to study the effect of lipids on these two organoleptic properties. For that, this study, carried out mainly by NMR, is interested in tannin-lipid interaction using several models of buccal membranes and lipid droplets. We have studied these interactions in terms of localization, affinity and dynamics. Our results show a localization of tannins at the interface of all studied lipid models. Then, the insertion of tannins in multilamellar vesicles, used to mimic buccal membranes, causes a fluidification effect on these systems. This effect depends on the structure of the tannin, the presence of ethanol and the cholesterol content of the lipid system. Finally, a protocol to determine the tannin-lipid association constants was developed. The latter have proved to be in the same order of magnitude as those for tannin-salivary protein interaction. These results show that lipids could have an influence on the one hand on astringency, due to the competition between tannin-lipid interaction and tannin-salivary protein interaction, and on the other hand on bitterness due to the disturbance of the buccal membrane dynamics, which could induce a disturbance of the gustative receptors.

La tuberculose (TB) reste la maladie infectieuse la plus meurtrière au monde. L’absence de développement de médicaments accompagnée de l'émergence de la résistance aux molécules existantes se traduit principalement par l'échec du traitement et la mort. M. tb infecte l'homme par l'inhalation. Le patient peut rester en bonne santé sans aucun symptôme, on parle alors de tuberculose latente. Dans ce cas, la bactérie résider dans le macrophage. La principale caractéristique de M. tb est de rester cacher à l'intérieur de ces cellules, puis se réactiver lorsque le système immunitaire s’affaibli.Mon travail a été consacrée à l'étude de nouveaux analogues de Cyclophostin / Cyclipostins (CyCs) et Oxadiazolone. Nombreuses molécules présentaient des activités antibactériennes lorsque la bactérie était cultivée dans le milieu liquide ou à l'intérieur du macrophage sans aucun effet toxique sur les macrophages.En utilisant le meilleur inhibiteur de CyC17, nous avons identifié 23 protéines cibles potentielles, étant impliquées dans le métabolisme des lipides de M. tb et / ou dans la biosynthèse des lipides de la paroi cellulaire. Parmi ces cibles, Ag85C et TesA, ont été caractérisées biochimiquement et structurallemnent.De plus, nous avons établi que les CyC sont des inhibiteurs puissants et sélectifs de la croissance des mycobactéries. De manière intéressante, ces composés étaient également actifs contre de nombreuses souches cliniques de M. abscessus, un pathogène opportuniste également appelés « cauchemars pour les antibiotiques », ouvrant ainsi la voie à la recherche de solutions alternatives pour lutter contre les souches mycobactériennes résistantes. / Tuberculosis (TB) is one of the deadliest infectious diseases worldwide. The stagnation in drug development accompanied with the emergence of drug resistance mainly results in treatment failure and death. M. tb infect human through inhalation. Patient can remains healthy without any symptom in which case it is known as latent TB. In latent TB, the bacteria is known to be reside in the macrophage - a type of white blood cell of the immune system, that engulfs and digests infected microorganisms. The famous characteristic of M. tb is the ability to stay inside and avoid to be killed by these cells, then reactivate when the immune system is weak.My work was devoted to the study of two series of new compounds, namely analogs of Cyclophostin/Cyclipostins (CyCs) and Oxadiazolone (OXs). Many molecules exhibited antibacterial activities when the bacteria was grown in the liquid medium or inside the macrophage without any toxic effect to the macrophages.Using the best CyC17 inhibitor, we identified 23 potential candidate target proteins, being involved in M. tb lipid metabolism and/or in cell wall lipid biosynthesis. Among these targets, two important protein, i.e. Ag85C and TesA, were biochemically and structurally characterized.Moreover, we clearly established that the CyCs are powerful and selective growth inhibitors of mycobacteria, with no effect on Gram-negative or Gram-positive bacteria. Interestingly, these compounds were also active against numerous M. abscessus clinical strains, an opportunistic pathogens also called “nightmare for antibiotic”, thus opening the way to find alternative solutions to fight against resistant mycobacterial strains.

La cellule eucaryote compartimentalise ses tâches au sein d’organelles communiquant les unes avec les autres au moyen de vésicules de transport. Le trafic vésiculaire est contrôlé par des petites protéines G de la superfamille Ras, activées par un changement de nucléotide guanidique catalysé par un facteur d’échange (GEF). En particulier, au niveau du cis-Golgi la petite protéine G Arf1 est activée par GBF1, permettant le transport rétrograde des vésicules COPI vers le réticulum endoplasmique. Récemment, GBF1 a été impliqué dans d’autres fonctions, notamment dans le cycle réplicatif de certains virus ou dans le métabolisme des gouttelettes lipidiques.Les gouttelettes lipidiques sont les organelles ubiquitaires du stockage des lipides et ont un rôle majeur dans l’homéostasie des lipides à l’échelle de la cellule. Le trafic intracellulaire des ces organelles dynamiques serait contrôlé par des petites protéines G. Notre équipe à montré dans une précédente étude que GBF1 est localisé sur les gouttelettes lipidiques et est impliqué dans le recrutement de PLIN2 et de la lipase ATGL sur les gouttelettes lipidiques. Cette thèse montre, par des études de biologie cellulaire et de microscopie, que GBF1 possède un domaine de fixation aux phospholipides via une hélice amphipatique. Cette hélice est nécessaire et suffisante pour l’association aux gouttelettes lipidiques in cellulo. La régulation de la localisation de GBF1 repose sur l’interaction avec Rab1B (cascade entre Rab1 et Arf1 dans la voie sécrétoire précoce) ainsi que sur les interactions intramoléculaires entre les différents domaines de GBF1. / The eukaryotic cell physically separates its functions within several membrane-bound organelles, which communicate using vesicles. Vesicular trafficking is under the control of small GTPases that exist as an inactive GDP-bound form and an active GTP-bound form. The switch between GDP and GTP is catalyzed by a guanine nucleotide exchange factor (GEF). On cis-Golgi membranes, Arf1, activated by the large GEF GBF1, recruits the COPI coat. COPI coated vesicles ensure the retrograde transport from the Golgi to the ER. Recently, GBF1 has been implicated in other pathways, such as the life cycle of various viruses and lipid droplet metabolism.Lipid droplets (LD), the major lipid storage organelle, play a major role in lipid homeostasis within the cell. LDs are connected to membrane trafficking and are therefore under the control of GTPases. In previous studies, our team showed that GBF1 localizes around LDs and that it is required for protein loading onto the LD surface. Here, data support the idea that GBF1 localizes to the LD surface. Using cell biology tools and microscopy, we identified, within GBF1, a lipid binding domain. In this domain, a single amphipathic helix is necessary and sufficient for LD targeting in cells. The regulation of GBF1 localization relies on interaction with Rab1 (data support a Rab1-Arf1 cascade between the ER and the Golgi) and on intramolecular interactions between GBF1 domains.

Une nouvelle méthode de détection sans marquage des interactions biomoléculaires a été développée. Elle est basée sur la conception d’une couche sensible supportée innovante réalisée par la technique de Langmuir‐Blodgett. Cette couche est composée d'un lipide à tête polaire immobilisant un cation métallique divalent capable (i) de chélater une molécule possédant une affinité pour ce type de cation et (ii) de catalyser la réaction de chimiluminescence du luminol. L'intensité du signal chimiluminescent est modulée par la présence de biomolécules fixées en surface de la couche sensible, qui modifient l'environnement immédiat du cation métallique. La variation du signal chimiluminescent (issu de la catalyse par le cation immobilisé) a pu être quantifiée et corrélée à une gamme de concentration d’histamine et d’anticorps. Les potentialités de cette approche ont finalement été exploitées pour développer une puce de PMMA de type macropuce immobilisant la monocouche de lipides. / A new label‐free detection method for biomolecular interactions was developed. It is based on the development of an original sensitive layer performed with the Langmuir‐ Blodgett technique. This layer is composed of a lipid which immobilized a bivalent metallic cation on his polar head, able (i) to chelate a molecule which has an affinity for this cation and (ii) to catalyze the luminol chemiluminescent reaction. The chemiluminescent signal intensity is modulated by the presence of immobilized biomolecules on the sensitive layer surface, which modifies the immediate environmentof the metallic cation. The chemiluminescent signal variation (from catalysis by the metallic cation) has been quantified and correlated to a histamine and antibody concentration range. The potentialities of this approach have finally been employed to achieve a PMMA chip (macroarray type), immobilizing the lipid monolayer.

Le développement d'outils performants de criblage de nouvelles molécules capables d'induire une réponse cellulaire identique à celle d'un ligand (agoniste/ antagoniste, etc...), est un enjeu important pour la recherche pharmaceutique. Les principales cibles utilisées aujourd'hui sont les récepteurs trans-membranaires couplés aux protéines G (RCPG), dont l'activation déclenche une cascade de réactions intracellulaires (signalisation) régulant des fonctions essentielles de la cellule. L'objectif de ce travail de thèse est la détection de l'initiation de la signalisation cellulaire par spectrométrie de fluorescence pour le récepteur d opioïde murin (mDOR) qui induit un changement conformationnel responsable d'un épaississement de sa partie transmembranaire lors de la signalisation, au niveau de la membrane plasmique de cellules eucaryotes in vivo. Ce changement est supposé générer des modifications de phase lipidique de la membrane plasmique lors de cette interaction RCPG/agoniste, avec des redistributions locales de certains lipides comme le cholestérol, conduisant à la génération d'une phase liquide-ordonnée (lo). Pour cela deux nouvelles sondes fluorescentes membranaires de la famille des Pyrènecholestérol ont été synthétisées, le 3b-hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-one 1 et le 3b- hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-méthylidène 2. Dans un premier temps la comparaison du comportement de ces sondes vis-à-vis du cholestérol a été analysée dans différentes membranes modèles phospholipidiques. Les données de microcalorimétrie et de RMN-2H indiquent que ces composés induisent des perturbations des lipides comparables à celle du cholestérol. Les données d'absorption, combinées à la propriété hypochromique du chromophore pyrène, ont permis de mettre en évidence un comportement autoassociatif de ces sondes. Nous extrapolons ce résultat à celui du cholestérol car des simulations en dynamique moléculaire déduisaient cette même associativité. Nous retrouvons qu'elle augmente avec le degré d'insaturation des chaînes acyles et qu'elle diminue quand la quantité de cholestérol croît (plus grande miscibilité des sondes dans les membranes enrichies en cholestérol). Dans un deuxième temps la sensibilité du spectre d'émission de fluorescence à la polarité de l'environnement a été vérifiée et mise à profit dans des membranes modèles pour discriminer les membranes en phase ld de celles en phase lo (où la polarité du coeur de la membrane est plus faible). Enfin, l'incorporation de la sonde 2 dans la membrane plasmique de cellules vivantes CHO qui sur-expriment mDOR, a permit le suivi dans le temps, par spectrofluorimétrie et microspectrofluorimétrie, de la perturbation de phase induite par un agoniste de ce récepteur. Les bases d'un criblage sélectif sont donc posées.

Trois objectifs principaux ont été fixés pour cette thèse : un objectif technologique, analytique, et d'analyse des risques. Un premier objectif de cette étude était d'identifier les étapes critiques du procédé de transformation des noix et graines, afin de pouvoir par la suite proposer des solutions permettant de limiter le développement des réactions de Maillard et d'oxydation des lipides, ainsi que leur dégradation nutritionnelle. Pour ce faire, la formation des composés issus de ces réactions a été suivie au cours de la transformation des noix et graines en tenant compte de l'impact de la qualité de la matière première. La dégradation de certains nutriments thermolabiles, indicateurs de la sévérité du traitement thermique appliqué, a été aussi suivie au cours de la transformation industrielle afin d'appréhender l'influence du traitement thermique sur la qualité nutritionnelle de ces aliments. Les résultats montrent que les réactions d'oxydation des lipides sont amorcées dès les premières étapes de transformation et s'amplifient par la suite. Plusieurs étapes du procédé sont impliquées dans le développement des réactions d'oxydation et la dégradation nutritionnelle, cependant l'étape de torréfaction se révèle particulièrement déterminante dans la formation des CNF. L'étape de stérilisation de la tahina semble avoir aussi un effet significatif sur l'accumulation des produits d'oxydation et des CNF. Suite à ce criblage des étapes critiques, des modifications techniques doivent être apportées à la chaîne de transformation afin de l'optimiser, sans compromettre la salubrité et les qualités organoleptiques du produit fini. Un deuxième objectif était d'explorer le potentiel de la spectroscopie de fluorescence frontale comme outil d'évaluation quantitative rapide de la qualité des noix et graines, dans l'objectif d'améliorer le contrôle et la maîtrise de la sécurité chimique de ces aliments transformés. L'analyse multivoies des mesures de fluorescence frontale en 3D sur des échantillons industriels de noix et graines a révélé une information détaillée sur l'oxydation des lipides et la formation de CNF, ainsi que leur dégradation nutritionnelle, au cours de leur transformation industrielle. L'identification des fluorophores intrinsèques s'est rendue possible grâce à l'approche multivoies des données. Des modèles de calibration multivoies ont été développés afin de prédire les concentrations en CNF à partir de simples mesures de fluorescence, et ont donné des résultats très prometteurs. Ces méthodes pourraient être très intéressantes dans une perspective de contrôle en ligne, du fait de leur rapidité et leur non-destructivité. Enfin, l'évaluation de l'exposition des libanais adultes à ces CNF à partir des noix et graines transformées a été réalisée en croisant les données de consommation alimentaire obtenues par le biais d'une enquête de consommation alimentaire exécutée dans le cadre de cette recherche sur une population urbaine adulte âgée entre 25 et 64 ans, avec les données de contamination obtenues par les analyses chimiques. Les expositions quotidiennes moyennes à la CML et aux AGT, suite à la consommation de l'ensemble des oléagineux étudiés, ont été estimées à 0,76 mg/personne/jour et 0,32 g/personne/jour respectivement. Ces niveaux correspondent à 13 et 7% des valeurs de références pour la CML et les AGT respectivement, susceptibles d'induire des effets néfastes. Au percentile 95ème de l'exposition, les valeurs d'exposition à la CML par la seule consommation des oléagineux dépassent la valeur limite. Ces résultats montrent qu'il est nécessaire de porter une attention particulière à l'exposition de certains groupes de population tels que les forts consommateurs pour lesquels le risque d'être exposés à un niveau supérieur aux valeurs toxicologiques de référence vis-à-vis des CNF étudiés n'est pas nul, sachant qu'aux noix et graines transformées vient s'ajouter une liste non négligeable d'aliments contributeurs à l'exposition aux CNF.

Local delivery of medication to the lung is highly desirable as the principal advantages include reduced systemic side effects and higher dose levels of the applicable medication at the site of drug action. This administration could be particularly useful for patients with specifically chronic pulmonary infections or pulmonary diseases, such as cystic fibrosis, asthma or lung cancer. In order to deliver a high dose range of medication for highly-dosed drugs such as antibiotics, “carrier-free” DPI formulations of tobramycin were developed with the aim of minimizing the use of excipients. Briefly, dry powders were prepared by spray drying various suspensions of tobramycin in isopropanol. First, as particle size is a key parameter in defining drug deposition in the lungs, the new Spraytec® laser diffraction method specifically modified for measuring the PSD of aerosolized drug was evaluated. The dispersion properties of various dry powder formulations were investigated using different laser diffraction and impaction apparatuses at different flow rates and using different inhalator devices. Different correlations between geometric and aerodynamic size data were demonstrated in this study. As a potential application, for the flow rate, the different inhalation devices and the drug formulations examined, the tobramycin fine particle fraction could be predicted from measurements obtained from the Spraytec® using linear relationships. Correlations (R² > 0.9) between the MMAD and the percentage of particles with a diameter below 5 µm could be demonstrated between the results obtained from the laser diffraction technique and the impaction method. Consequently, the Spraytec® laser diffraction technique was proved to be an important tool for initial formulation and process screening during formulation development of DPIs. In order to modify the surface properties of the raw tobramycin powder, different powder compositions were formulated with the aim of studying the influence of the concentration of tobramycin in drug suspensions used for spray-drying, the lipid film composition (cholesterol:Phospholipon ratio) and the coating level (in percentage) on the physicochemical and aerodynamic characteristics of the antibiotic. The results indicated that the application of a lipid coating around the active particles allowed an improvement in particle dispersion from the inhalator, decreasing raw powder agglomeration and thus enhancing drug deposition deep in the lungs. Moreover, these results seemed to be influenced by the amount and composition of the lipids in the formulations. The evaluation of the influence of the coating level showed that the deposition of only 5% w/w lipids (on a dry basis) was sufficient to improve particle dispersion properties during inhalation. The FPF, which is around 36% for the uncoated micronized tobramycin, was increased to up to about 68% for the most effective lipid-coated formulation. Of particular importance, these results revealed the need to add sufficient amounts of covering material in order to significantly modify the particle surface properties and reduce their tendency to agglomeration, while limiting the lipid level in the formulations in order to avoid any undesirable sticking and to allow the delivery of more of the active drug to the deep lung. Another approach used to modify the surface properties of raw tobramycin was to coat the micronized particles with nanoparticles of the drug, produced by high pressure homogenization. The evaluation of the influence of the level of nanoparticle coating of the micronized particles showed that the presence of nanoparticles in the formulations improved the particle dispersion properties during inhalation. One microparticle was completely covered with a single layer or several layers of nanoparticles, in function of the percentage of nanoparticles in the mixture. Coating the fine drug particles with particles in the nanometer range was believed to reduce Van Der Waals forces and powder agglomeration. These various layers of nanoparticles also allowed a decrease in the cohesion of the powder by improving the slip between the particles. On the other hand, suspensions containing solely nanoparticles were spray dried with various concentrations of surfactant in order to produce easily dispersible and reproducible micron-size agglomerates of nanoparticles during inhalation. The evaluation of the influence of the concentration of surfactant showed that deposition of only 2% w/w (on a dry basis) of Na glycocholate is sufficient to improve particle dispersion properties during inhalation. Consequently, the use of nanoparticles in dry powder formulations increased the FPF from 36% for the uncoated micronized tobramycin to about 61% for this latter formulation. To modify the balance between the different forces of interactions without the need for any excipient, the influence of formulation components on the aerosolization characteristics of spray-dried tobramycin through the use of various proportions of water in the solvent used to prepare initial suspensions was investigated. These results showed that it is possible to modify the surface properties of the particles by coating the particles of drug with a homogeneously distributed film of the active compound dissolved in a solvent system containing a mixture of different solvents such as isopropanol and water. During nebulization of the suspension, droplets are composed of one or more particles in solid state surrounded with solvent containing the dissolved drug. It is hypothesized that during the drying step, dissolved tobramycin forms a coating of the amorphous drug around particles in suspension. The coating of drug particles can thus be used as an alternative approach that permits the modification of the surface properties of the particles, increasing the flowability, the desagglomeration tendency and the fine particle fraction deposited in the deep lung. So, the evaluation of the influence of the water content of the suspensions and the effect of the inlet temperature during spray-drying showed that the addition of 2% water v/v is sufficient to improve particle dispersion during inhalation. Of particular interest, as tobramycin is a very hygroscopic drug, the addition of water turned out to be a critical step. It was thus important to add a small amount of water to the solvent system and to process the drying step at a high temperature to produce formulations containing solely the active drug and showing a FPF of up to 50%. Moreover, stability studies demonstrated that these optimized formulations (lipid-coated formulation, nanoparticle formulation and amorphous drug-coated formulation) were stable over a long time period at various ICH temperature and relative humidity storage conditions (25°C/60% RH, 30°C/65% RH and 40°C/75% RH). The formulations were shown to keep their crystalline state, initial PSD, redispersion characteristics and deposition results for more than twelve months. In order to confirm these encouraging results, two optimized formulations (one with a lipid coating and another with amorphous drug coating) were selected and compared to the only commercially available tobramycin formulation for inhalation, Tobi® (nebulizer solution), by performing a combined in vivo scintigraphic and pharmacokinetic evaluation of tobramycin DPIs in nine CF patients. In comparison with Tobi®, it was estimated that lung deposition, expressed as a percentage of the nominal dose, was 7.0 and 4.5 times higher for the lipid-coated and amorphous tobramycin-coated formulations, respectively. Moreover, the pharmacokinetic data, adjusted to the same drug dose as that of the Tobi® deposited in the lungs, showed that the AUC values were found to be 1.6 times higher for Tobi® than for DPI formulations. So this evaluation confirmed the superiority of dry powder formulations in terms of drug deposition and reduced systemic exposure in comparison with the conventional comparator product, Tobi®. Thus, these new and orginal tobramycin DPI formulations based on the use of very low excipient levels and presenting very high lung deposition properties, were shown to offer very good prospects for improving the delivery of drugs to the pulmonary tract and to the widest possible patient population.