O câncer de mama representa um grave problema de saúde pública. Dentre os fármacos empregados, destaca-se o paclitaxel, um agente citotóxico eficaz, porém associado a severos efeitos colaterais. A metformina hidrocloreto tem obtido resultados promissores para o tratamento de neoplasias, porém é bastante hidrofílica, fator limitante da biodisponibilidade. A rapamicina tem demonstrado sinergismo com paclitaxel e potente atividade antitumoral. Todavia, é um fármaco lipofílico e possui desvantagens. Sistemas nanoestruturados de fármacos como lipossomas PEGlados são largamente empregados para a melhora da farmacocinética e potencialização da ação terapêutica. Ademais, a funcionalização de lipossomas com anticorpos monoclonais pode permitir a entrega seletiva do fármaco encapsulado à célula alvo. No presente trabalho objetivou-se desenvolver e caracterizar lipossomas e imunolipossomas funcionalizados com trastuzumabe, contendo paclitaxel, metformina hidrocloreto e/ou rapamicina, bem como avaliar as formulações através de estudos in vitro e in vivo. Os resultados mostraram que a metformina hidrocloreto foi encapsulada com baixa eficiência, menor que 20%, ao passo que paclitaxel e rapamicina puderam ser co-encapsulados com adequados valores de eficiência de encapsulação, equivalente a 56,32% para paclitaxel e 73,31% para rapamicina, e tamanho de partícula nanométrico, de 136,95 nm em composição biocompatível baseada em SPC:Col:DSPE-PEG(2000). Os dois fármacos apresentaram liberação lenta, e foram convertidos às formas molecular e amorfa, respectivamente para paclitaxel e rapamicina quando encapsulados. Os imunolipossomas foram funcionalizados com elevada eficiência com trastuzumabe e mantiveram o tamanho nanométrico, com adequados valores de encapsulação dos fármacos. Ainda, mostrou-se o sinergismo entre paclitaxel e rapamicina coencapsulados em lipossomas em células triplo negativas (4T1) e houve sinergismo entre os dois fármacos, mediado pelo anticorpo em imunolipossomas frente à linhagem celular HER2 positiva (SKBR3), em virtude do aumento do uptake celular mediado pelo trastuzumabe. Finalmente, os resultados obtidos in vitro foram confirmados in vivo, sendo que os lipossomas com paclitaxel e rapamicina coencapsulados foram capazes de controlar o crescimento tumoral em modelo de câncer de mama triplo negativo, ao passo que o imunolipossoma com os dois fármacos permitiu o controle do crescimento de tumores xenográficos HER2 positivos, cuja média de volume tumoral correspondeu a 25,27%, 44,38% e 47,78% das médias dos volumes tumorais de controle negativo, positivo e lipossoma, respectivamente. Portanto, a formulação desenvolvida nesse trabalho tem potencial para ser avaliada em estudos clínicos. / Breast cancer represents a severe public health problem. Among the drugs used in the treatment, paclitaxel is an effective cytotoxic drug, but associated with side effects. Hydrocloride metformin has shown promising results for cancer treatment, however it is very hydrophilic, a limiting factor for bioavailability. Rapamycin has demonstrated synergism with paclitaxel and potent anticancer activity, though it is a lipophilic drug with drawbacks that compromise its bioavailability. Nanostructured drug delivery systems, such as PEGylated liposomes are largely employed for pharmacokinetics improvement and enhancement of therapeutic effect. Furthermore, the functionalization of liposomes with monoclonal antibodies enables the selective delivery of the loaded drug to the target cell. In the present work, we aimed to develop and characterize liposomes and immunoliposomes functionalized with trastuzumab, containing paclitaxel, hydrocloride metformin and/or rapamycin, as well as to evaluate the formulations through in vitro and in vivo studies. The results showed that hydrocloride metformin was encapsulated with low efficiency, less than 20%, on the other hand paclitaxel and rapamycin could be co-loaded with suitable values of encapsulation efficiency, 56.32% for paclitaxel and 73.31% for rapamycin and nanometric particle size, 136.95 nm, based on a SPC:Chol:DSPE-PEG(2000) composition. The two drugs displayed slow release, and were converted to molecular and amorphous form, respectively for paclitaxel and rapamycin when encapsulated. The immunoliposomes were developed with high efficiency with trastuzumab and kept the nanometric size, with adequate encapsulation of drugs. Moreover, herein it was shown the synergism between paclitaxel and rapamycin co-loaded in liposomes in triple negative cells (4T1) and there was synergism between the two drugs mediated by the antibody in immunoliposomes in the HER2-positive cell line (SKBR3), due to the improved cell uptake mediated by trastuzumab. Finally, the results obtained in vitro were confirmed in vivo. Co-loaded paclitaxel and rapamycin were able to control tumor growth in a triple negative breast cancer animal model, while the immunoliposome containing the two drugs allowed for better control of tumor growth in a HER2-positive breast xenograft model, whose average tumor volume corresponded to 25.27%, 44.38% and 47.78% of the tumor volumes of positive control, negative control and liposome, respectively. Therefore, the formulation developed herein has potential to be evaluated in clinical trials.

A terapia fotodinâmica (TFD) tem se apresentado nos últimos anos como uma alternativa para o tratamento de tumores cutâneos, viscerais e sistêmicos, demonstrando resultados promissores, tanto em estudos in vitro como in vivo. Trata-se de uma técnica simples e não invasiva. A terapia consiste na excitação de um fármaco fotossensibilizante por uma fonte de luz visível que depois de absorvida pela molécula, leva a produção espécies reativas de oxigênio (EROs) em presença do oxigênio molecular por uma sequencia de reações fotoquímicas. Nesse trabalho propõe-se a preparação, caracterização e detreminação da atividade fotodinâmica de uma nanoemulsão rica em colesterol e de lipossomas ultradeformáveis como novos sistemas de liberação para o fármaco fotossensibilizante cloro alumínio ftalocianina (PcAlCl), comparando com um sistema clássico de lipossoma convencional. Como modelo celular foram utilizadas células de glioblastoma (U87MG) e de melanoma (B16F10). As formulações apresentaram características desejáveis como reprodutibilidade, tamanho de partícula, estabilidade curto e em longo prazo e deformidade adequados para a utilização como meio de veiculação da PcAlCl. Pela análise dos estudos fotofísicos de rendimento quântico de fluorescência (?F), tempo de vida de fluorescência (?) e rendimento quântico de oxigênio singleto (??) da PcAlCl em etanol e incorporada nas formulações, pode-se observar que a incorporação a um veículo de liberação melhorou as características da PcAlCl. Nos estudos em células nenhum dos sistemas apresentou citotoxicidade na ausência de luz, mas apresentaram um aumento da atividade fotodinâmica da PcAlCl de até 80% quando comparadas à PcAlCl livre quando irradiadas. Todas as formulações apresentaram características que corrobora com o emprego como sistemas de liberação para o aumento da atividade fotodinâmica da PcAlCl podendo serem empregados no tratamento de glioblastoma e de melanoma / The Photodynamic therapy (PDT) has been an alternative for the treatment of skin, and brain tumors, and has shown promising results, both in vitro and in vivo, is a simple and non-evasive technique. The therapy consists into a light-sensitive drug excitation by a light visible source that once absorbed by the molecule lead to produce reactive oxygen species (ROS) in the molecular oxygen presence by a sequence of photochemical reactions. This work proposes the preparation and characterization of a cholesterol-rich nanoemulsion and ultradeformable liposomes as new delivery systems for the drug photosensitizer chloro aluminum phthalocyanine (PcAlCl) compared to a classical system as the conventional liposome and their photodynamic activity in glioblastoma cells line (U87MG) and melanoma cells line (B16F10). The formulations showed suitable characteristics such as reproducibility, particle size, short and long-term stability and deformity for their use as drug delivery for PcAlCl. For the photophysical studies: absorption, fluorescence, fluorescence quantum yield (?F), fluorescence lifetime (?) and quantum yield of singlet oxygen (??) of PcAlCl in ethanol and incorporated in the formulations demonstrated that the incorporation was able to improve its photophysical characteristics. In in vitro studies, the drug delivery systems showed no cytotoxicity in the absence of light, but demonstrated increased in PcAlCl photodynamic activity up to 80% over the PcAlCl free when irradiated. All formulations showed characteristics, which cooperates with the use of these drug delivery systems for, increased the PcAlCl photodynamic activity for glioblastoma and melanoma treatment

Ftalocianina de alumínio-cloro (AlClPc) é um fotossensibilizador de segunda geração em terapia fotodinâmica (TFD) caracterizado por seu caráter anfifílico e tendência de auto-agregação em meio aquoso, o que prejudica seu potencial de aplicação. O aCHC é um substrato de transportadores de monocarboxilato (MCT) superexpresso em células de MCF-7. Objetivando a solubilização da AlClPc e aumento de internalização em tecidos neoplásicos nos propomos aqui o uso de DSPC e DOPC em diferentes proporções para formar vesículas lipidicas mistas (LV) na presença de aCHC como sistemas veiculadores de fármaco. Lv foi preparado pelo método de injeção etanólica e formou vesículas de dimensões nanométricas (aproximadamente 100 nm) com bom índice de polidispersão, valores negativos de potencial zeta e estáveis em meio aquoso por mais de 50 dias. AlClPc se complexou com o fosfato das LV o que conferiu uma localização interfacial às moléculas de AlClPc como demonstrado pelos resultados de supressão de fluorescência. Medidas de anisotropia, fluorescência estática e resolvida no tempo corroboram com estes resultados e demonstram que a auto-agregação da AlClPc ocorre mesmo em lipossomas. Entretanto, a veiculação da AlClPc por LV em carcinoma de células escamosas oral (OSCC) levou a um processo de desagregação demonstrado por (FLIM). Este incrível comportamento é novo e aumenta o conhecimento científico sobre o mecanismo intracelular de ação de fotossensibilizadores em TFD. Em TFD, ambos os sistemas LVIII+AlClPc e LVIII+AlClPc+aCHC não apresentaram toxicidade no escuro no período de incubação de 3 h com as concentrações de lipídios, AlClPc e aCHC iguais a 0,15 mmol/L, 0,5 umol/L e 10,0 umol/L, respectivamente. De maneira inesperada, o sistema LVIII+AlClPc foi mais eficiente em TFD que o sistema LVIII+AlClPc+aCHC, devido ao caráter antioxidante do aCHC. Estes resultados abrem uma nova perspectiva do potencial uso de LV-AlClPc para o tratamento fotodinâmico. / Aluminum phthalocyanine chloride (AlClPc) is a second-generation photodynamic therapy (PDT) photosensitizer characterized for its high hydrophobicity and self-aggregation tendency in aqueous media, which hampers its potential application. The aCHC is a monocarboxylate transporter substrate (MCT) overexpressed in MCF-7 line cell. Aiming at AlClPc solubilization and uptake increase we proposed here the use of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) at different proportions to form mixed lipid vesicles (LV) in presence of aCHC as a drug delivery system. LV were prepared by ethanol injection method and formed nano-sized vesicles (about 100 nm) with suitable polydispersity index, negative zeta potential, and stable in aqueous medium for at least 50 days. AlClPc strongly interacts with LV (high binding constant values), especially due to aluminum-phosphate specific interactions, which gives a surface localization to AlClPc molecules as demonstrated by fluorescence quenching data. Anisotropy, static and time-resolved fluorescence measurements corroborated with these results and demonstrated that AlClPc self-aggregation occurred even in the liposomes. However, formulation uptake by oral squamous cell carcinoma (OSCC) the AlClPc suffered a disaggregation process demonstrated by fluorescence life-time imaging microscopy. This amazing behavior is new and increases the scientific knowledge about the intracellular mechanism of action of PDT photosensitizers. In PDT, both systems LVIII+AlClPc e LVIII+AlClPc+aCHC did not show toxicity in the dark at 3 h incubation period with lipid, AlClPc, and aCHC concentrations equal at 0,15 mmol/L, 0,5 umol/L, and 10,0 umol/L, respectively. Unexpectedly, the system LVIII+AlClPc was more effective in PDT that the LVIII+AlClPc+aCHC, devido ao caráter antioxidante do aCHC due to the antioxidant character of aCHC. These results open a new perspective to the potential use of ALClPc-LV formulations for photodynamic treatment.

O carcinoma de células escamosas (SCC) é um tumor maligno de origem epitelial no qual o receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR) está superexpresso e associado a malignização. O cetuximabe é um anticorpo monoclonal, capaz de se ligar seletivamente ao EGFR. A combinação de cetuximabe com o quimioterápico hidrofílico 5-fluorouracil (5-FU) é utilizada na clínica pela via intravenosa e é associada a efeitos colaterais. A administração tópica de 5-FU também é realizada a partir de cremes convencionais, porém sua eficácia é limitada a doenças pré-cancerosas e o carcinoma basocelular. Estima-se que a conjugação do cetuximabe à superfície de lipossomas, os quais podem ser administrados na pele em associação a um método físico, como a iontoforese, seja capaz de direcionar a liberação do 5-FU para as camadas da pele onde os tumores estão presentes, além de aumentar o uptake celular em linhagem EGFR positiva, viabilizando o tratamento tópico de SCC. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do cetuximabe conjugado a um lipossoma (imunolipossoma) na penetração cutânea passiva e iontoforética do 5-FU e na regressão do SCC. Para tanto, um método analítico e um método bioanalítico foram desenvolvidos e validados para quantificação de 5-FU. Lipossomas convencionais foram preparados a partir de diferentes composições lipídicas, métodos de preparo e razão fármaco/lipídeo para selecionar aqueles que encapsulassem maior porcentagem de 5-FU. Lipossomas compostos por 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina e colesterol (DSPC:Chol, 55:45), preparados por hidratação do filme lipídico, na razão fármaco/ lipídeo 0,1, de aproximadamente 140 nm, foram escolhidos por encapsularem cerca de 50% de 5-FU. Para obtenção dos imunolipossomas, o cetuximabe foi primeiramente conjugado ao lipídeo DSPE acoplado ao ligante maleimida(polietilenoglicol)-2000 (DSPE-PEG-Mal), resultando em 94% de eficiência de conjugação. Os imunolipossomas foram então obtidos da mesma forma que os lipossomas e apresentaram tamanho e porcentagem de encapsulação do 5-FU semelhante a apresentada pelos lipossomas. Estudo in vitro em linhagem EGFR positiva (A431) mostrou sinergismo entre 5-FU e imunolipossoma, resultando em valores de IC50 cerca de 3 vezes menores do que o apresentado pelo 5-FU em solução. O uptake celular do imunolipossoma foi 3,5 vezes maior do que o do lipossoma. Nos estudos de penetração cutânea in vitro observou-se que, em relação a uma solução de 5-FU, lipossomas e imunolipossomas diminuíram a quantidade de 5- FU que atravessou a pele. A iontoforese aumentou a penetração do 5-FU a partir de todas as formulações. Neste caso, o acúmulo de 5-FU na epiderme viável, onde os tumores estão presentes, foi duas vezes maior quando este estava encapsulado no imunolipossoma em relação ao lipossoma. In vivo, as formulações foram administradas por via subcutânea ou tópica usando iontoforese em modelo xenográfico de SCC. O tratamento com os imunolipossomas diminuiu o crescimento tumoral em mais de 60% em relação ao controle e em torno de 50% em relação aos tratamentos com solução e lipossoma de 5-FU. A administração tópica por iontoforese apresentou maior redução tumoral do que a subcutânea quando os tumores foram tratados com solução de 5-FU e lipossomas, mas foi igualmente eficaz para os imunolipossomas. Análise imunohistológica revelou que o potencial de proliferação celular foi reduzido para os grupos tratados. Desta forma, a administração por iontoforese de imunolipossomas contendo 5-FU é uma estratégia promissora para o tratamento tópico de SCC / Squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant tumor of epithelial origin in which the epidermal growth factor receptor (EGFR) is overexpressed and associated with malignization. Cetuximab is a monoclonal antibody, able to selectively bind EGFR. The combination of the chemotherapy with the hydrophilic drug 5-fluorouracil (5- FU) and cetuximab is applied in the clinic by intravenous injection and is associated with side effects. Cetuximab conjugation onto liposomal surface, which can be administered topically onto the skin using physical methods, such as iontophoresis, is able to direct 5-FU release to the skin layers where tumors are localized and to increase cellular uptake in EGFR positive cells, making possible the topical treatment of SCC. Thus, the objective of this work was to investigate the influence of cetuximab conjugation to liposomes (immunoliposomes) in the passive and iontophoresis skin penetration of 5-FU and SCC regression. For this purpose, an analytical and a bioanalytical method were developed and validated for 5-FU quantification. Then, conventional liposomes were prepared using different lipid compositions, preparation methods and drug to lipid ratios in order to select those able to load higher percentages of 5-FU. Liposomes composed by 1,2-Distearoylsn- glycero-3-phosphocholine and cholesterol (DSPC:Chol, 55:45) prepared by the thin lipid film hydration with drug/lipid ratio 0.1 with approximately 140 nm, were chosen because they encapsulated about 50% of 5-FU. For the obtainment of immunoliposomes, cetuximab was first coupled to the lipid DSPE linked to maleimide (polyethylene glycol)-2000 (DSPE-PEG-Mal) as an anchor for the antibody conjugation, resulting in 94% coupling efficiency. The immunoliposomes were obtained similarly to liposomes, with similar particle size and loading efficiency of 5-FU. In vitro studies using EGFR positive cells (A431) showed synergism for 5-FU and cetuximab, resulting in IC50 values about 3 times lower than 5-FU solution. Cellular uptake of immunoliposomes increased 3.5-fold compared to the liposomes. In vitro skin penetration studies revealed that, compared to the 5-FU solution, liposomes and immunoliposomes reduced the amount of 5-FU that passed through the skin. Iontophoresis increased the amount of 5-FU retained in viable epidermis for all formulations. In this case, the amount of 5-FU in viable epidermis, where tumors are localized, was 2 times higher when it was encapsulated in immunoliposomes compared to liposomes. In vivo, the formulations were administered subcutaneously or topically with iontophoresis in xenograft animal model of SCC. Treatment with immunoliposomes reduced tumor growth more than 60% compared to the negative control and about 50% compared to the treatments with 5-FU solution and liposomes. The topical administration using iontophoresis resulted in improved tumor reduction compared to the subcutaneous administration when tumors were treated with 5-FU solution and liposomes, but was equally effective for the immunoliposomes. The histological analysis showed the reduction of cellular proliferation for the treated groups. In conclusion, the administration of immunoliposomes containing 5-FU using iontophoresis is a promising strategy for the topical treatment of SCC

A síntese, aspectos estruturais, fotoquímica, fotofísica, atividade farmacológica e a fotoatividade citotóxica in vitro do complexo [Ru(NO)(ONO)pc] (pc = ftalocianina) são descritas neste trabalho. O efeito biológico do complexo de rutênio foi estudado na presença e ausência de irradiação luminosa na janela terapêutica (600 - 850 nm), sob linhagem de células B16F10. Comparativamente, a atividade citotóxica de [Ru(NO)(ONO)pc] foi muito maior que [Rupc], sob diferentes níveis de potência do laser, sugerindo a liberação de óxido nítrico pós-produção de oxigênio singlete, após irradiação luminosa, pode ser um importante mecanismo pelo qual o complexo nitrosilo de rutênio apresenta maior atividade biológica, na linhagem de célula estudada. Após a ativação por irradiação luminosa, o complexo [Ru(NO)(ONO)pc] apresentou diminuição da viabilidade celular na linhagem B16/F10, com eficácia dependente da potência do laser. O encapsulamento de [Ru(NO)(ONO)pc] em lipossoma aumentou em cerca de 25 % a atividade citotóxica do complexo nitrosilo, quando comparado com o mesmo, porém em solução de PBS. Esta eficácia foi diretamente proporcional à quantidade de rutênio no interior da célula, cuja concentração foi determinada por espectrometria de massa ICP-MS, evidenciando maior eficácia no mecanismo de transporte do complexo nitrosilo para o interior da célula. A atividade fotocitotóxica foi atribuída principalmente aos fenômenos de apoptose, cujo o mecanismo foi derivado da análise por citometria de fluxo. O mecanismo de liberação de NO dá-se por processo redutimétrico do complexo [Ru(NO)(ONO)pc], haja vista que a vasodilatação estudada é dependente do NO, liberado do complexo nitrosilo, e independente da irradiação luminosa. Aliás, concentração da ordem de 1,0 x 10-7 M do complexo de rutênio em PBS ocasionou 100 % de vasodilatação, cuja concentração é semelhante ao do nitroprussiato de sódio, medicamento utilizado em clínica médica com severas restrições. Em princípio, a liberação de óxido nítrico pós-produção de oxigênio singlete, oriundo da irradiação luminosa na janela terapêutica, do complexo nitrosilo de rutênio, pode constituir-se num poderoso mecanismo para aumentar a eficácia da terapia fotodinâmica, uma portentosa terapia clínica que encontra limitação dependente do tamanho da área cancerígena bem como da vascularização desta área. / The synthesis, structural aspects, photochemistry, photophysical, farmacological studies and in vitro photoinduced cytotoxic properties of [Ru(NO)(ONO)pc] (pc = phthalocyanine) are described in this work. Its biological effect was studied in the presence and absence of therapeutic window light irradiation (600 - 850 nm) in B16/F10 cell line by means nitric oxide and singlet oxygen production. At comparable light irradiation potency levels [Ru(NO)(ONO)pc] was more effective than [Rupc] suggesting nitric oxide release followed by singlet oxygen production upon light irradiation may be an important mechanism by which the nitrosyl ruthenium complex exhibits more biological activity in cells. Following visible light activation, the [Ru(NO)(ONO)pc] complex showed an increased potency with photoinduced dose modifications in the B16/F10 cells. The liposome containing [Ru(NO)(ONO)pc] complex was over 25 % more active than the corresponding ruthenium complex in PBS solution. It was directly proportional to the amount of ruthenium inside the cell obtained by ICP-mass spectrometry evidencing the cross membrane barrier providing phenomenal increase of [Ru(NO)(ONO)pc] complex concentration inside the cell. The photocytotoxic activity was mainly attributed to the apoptosis phenomena by flux cytometry analysis. The mechanism of NO release occurs by reductimetric process of [Ru(NO)(ONO)pc] complex, considering the vasodilation studies, which vasorelaxation showed dependence on NO concentration and independence on light irradiation. Moreover, concentration of 1.0 x 10-7 M of the ruthenium complex in PBS caused 100% vasodilation, which is similar to the concentration of sodium nitroprusside, a drug used in medical clinic with severe restrictions. Furthermore, the nitric oxide release followed by singlet oxygen production upon light irradiation of the nitrosyl ruthenium complex produced two radicals capable to improve photodynamic therapy, a clinical therapy which efficiency is actually limited by the cancer area and vascularization

Made available in DSpace on 2018-06-27T18:56:19Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Nadia Marcia Dumke.pdf: 2321167 bytes, checksum: 449f4b9310f3670661f832eb53390630 (MD5) Nadia Marcia Dumke.pdf.txt: 113132 bytes, checksum: 2dbb738eb27d08559ba1ed0a6ad3c11f (MD5) Nadia Marcia Dumke.pdf.jpg: 3327 bytes, checksum: ea01888a8e3478355c0a38cbe96a336e (MD5) Previous issue date: 2014-08-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A great number of nosocomial infections are associated with the use of hospital medical devices, such as urinary catheter, and biofilm formation mainly caused by fungi of the genus Candida. The treatment results in a high cost hospitalization, thereby increasing the permanence of the patient in the hospital environment and increased morbidity and mortality. This is especially harmful in patients with some immune deficiency, such as those caused by old age or with pre-existing medical conditions and also increasing resistance of microorganisms to conventional treatments. In order to investigate new therapies against this microorganism and combine with nanotechnology, studies with the drug escin and liposomes containing this active ingredient have been performed. The characterization of liposomes was carried out, demonstrating a particle size of liposome containing escin to 224 nm and a polydispersity index of 0.288 and liposome without drug, of 354.2 nm and the polydispersity index 0,215. Therefore methods of formation and adherence of biofilm on urinary catheter in vitro using assays for quantification of the biofilm exopolysaccharides and proteins of Candida albicans have been developed. It was subsequently treated with liposomes containing 0.5% escin, liposome without the drug and free drug. The results demonstrated the occurrence of fungal growth inhibition measured at Calcofluor White Stain method and the minimal inhibitory concentration, at a concentration of 1.56 mg/mL for liposome drug containing escin, achieving g a reduction of biofilm by 75% when compared using the free drug. It was observed that the liposome is containing 0.5% escin at a concentration of 1.56 mg/mL, decreased adherence and biofilm formation on medical hospital material, through the techniques used in the study, highlighting the effectiveness of liposome nanostructures against the microorganism C. albicans / Um número elevado de infecções hospitalares está associado ao uso de material médico hospitalar. Um exemplo é o cateter urinário e, com a formação de biofilme, principalmente causada por fungos do tipo Candida spp. O tratamento hospitalar gera um custo elevado em relação à internação, aumentando assim, a permanência do enfermo em ambiente hospitalar e uma maior morbi-mortalidade. Tal fator se apresenta mais evidente em pacientes com alguma imunodeficiência, tais como aquelas causadas pela idade avançada ou condições clínicas pré-existentes, assim como, também pelo aumento da resistência dos microrganismos aos tratamentos convencionais. Com o intuito de investigar novas terapias contra esse microrganismo e aliar a esse a nanotecnologia, foram realizados estudos com o fármaco escina e com lipossomas contendo esse princípio ativo. A caracterização dos lipossomas foi realizada demonstrando que os mesmos possuem um tamanho de partícula para o lipossoma contendo escina de 224 nm e um índice de polidispersão de 0,288 e para o lipossoma branco, sem o fármaco, de 354,2 nm e índice de polidispersão de 0,215. Deste modo, foram avaliados métodos de formação e aderência de biofilme in vitro em cateter urinário utilizando ensaios para quantificação de proteínas e exopolissacarídeos do biofilme de Candida albicans. Posteriormente, foi realizado um tratamento com lipossomas contendo escina a 0,5%, lipossoma sem o fármaco e o fármaco livre. Os resultados demonstraram a ocorrência de inibição do crescimento fúngico avaliados pelo método de Calcofluor White Stain e a concentração inibitória mínima, na concentração de 1,56 μg/mL para o lipossoma contendo o fármaco escina, obtendo uma redução do biofilme em 75% quando comparado com o uso do fármaco livre. Observou-se que o lipossoma contendo escina a 0,5% na concentração de 1,56 μg/mL, diminuiu a aderência e a formação do biofilme em material médico hospitalar, através das técnicas utilizadas no estudo, salientando a eficiência das nanoestruturas lipossomais contra o microrganismo C. albicans

Ftalocianina de alumínio-cloro (AlClPc) é um fotossensibilizador de segunda geração em terapia fotodinâmica (TFD) caracterizado por seu caráter anfifílico e tendência de auto-agregação em meio aquoso, o que prejudica seu potencial de aplicação. O aCHC é um substrato de transportadores de monocarboxilato (MCT) superexpresso em células de MCF-7. Objetivando a solubilização da AlClPc e aumento de internalização em tecidos neoplásicos nos propomos aqui o uso de DSPC e DOPC em diferentes proporções para formar vesículas lipidicas mistas (LV) na presença de aCHC como sistemas veiculadores de fármaco. Lv foi preparado pelo método de injeção etanólica e formou vesículas de dimensões nanométricas (aproximadamente 100 nm) com bom índice de polidispersão, valores negativos de potencial zeta e estáveis em meio aquoso por mais de 50 dias. AlClPc se complexou com o fosfato das LV o que conferiu uma localização interfacial às moléculas de AlClPc como demonstrado pelos resultados de supressão de fluorescência. Medidas de anisotropia, fluorescência estática e resolvida no tempo corroboram com estes resultados e demonstram que a auto-agregação da AlClPc ocorre mesmo em lipossomas. Entretanto, a veiculação da AlClPc por LV em carcinoma de células escamosas oral (OSCC) levou a um processo de desagregação demonstrado por (FLIM). Este incrível comportamento é novo e aumenta o conhecimento científico sobre o mecanismo intracelular de ação de fotossensibilizadores em TFD. Em TFD, ambos os sistemas LVIII+AlClPc e LVIII+AlClPc+aCHC não apresentaram toxicidade no escuro no período de incubação de 3 h com as concentrações de lipídios, AlClPc e aCHC iguais a 0,15 mmol/L, 0,5 umol/L e 10,0 umol/L, respectivamente. De maneira inesperada, o sistema LVIII+AlClPc foi mais eficiente em TFD que o sistema LVIII+AlClPc+aCHC, devido ao caráter antioxidante do aCHC. Estes resultados abrem uma nova perspectiva do potencial uso de LV-AlClPc para o tratamento fotodinâmico. / Aluminum phthalocyanine chloride (AlClPc) is a second-generation photodynamic therapy (PDT) photosensitizer characterized for its high hydrophobicity and self-aggregation tendency in aqueous media, which hampers its potential application. The aCHC is a monocarboxylate transporter substrate (MCT) overexpressed in MCF-7 line cell. Aiming at AlClPc solubilization and uptake increase we proposed here the use of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) at different proportions to form mixed lipid vesicles (LV) in presence of aCHC as a drug delivery system. LV were prepared by ethanol injection method and formed nano-sized vesicles (about 100 nm) with suitable polydispersity index, negative zeta potential, and stable in aqueous medium for at least 50 days. AlClPc strongly interacts with LV (high binding constant values), especially due to aluminum-phosphate specific interactions, which gives a surface localization to AlClPc molecules as demonstrated by fluorescence quenching data. Anisotropy, static and time-resolved fluorescence measurements corroborated with these results and demonstrated that AlClPc self-aggregation occurred even in the liposomes. However, formulation uptake by oral squamous cell carcinoma (OSCC) the AlClPc suffered a disaggregation process demonstrated by fluorescence life-time imaging microscopy. This amazing behavior is new and increases the scientific knowledge about the intracellular mechanism of action of PDT photosensitizers. In PDT, both systems LVIII+AlClPc e LVIII+AlClPc+aCHC did not show toxicity in the dark at 3 h incubation period with lipid, AlClPc, and aCHC concentrations equal at 0,15 mmol/L, 0,5 umol/L, and 10,0 umol/L, respectively. Unexpectedly, the system LVIII+AlClPc was more effective in PDT that the LVIII+AlClPc+aCHC, devido ao caráter antioxidante do aCHC due to the antioxidant character of aCHC. These results open a new perspective to the potential use of ALClPc-LV formulations for photodynamic treatment.

A síntese, aspectos estruturais, fotoquímica, fotofísica, atividade farmacológica e a fotoatividade citotóxica in vitro do complexo [Ru(NO)(ONO)pc] (pc = ftalocianina) são descritas neste trabalho. O efeito biológico do complexo de rutênio foi estudado na presença e ausência de irradiação luminosa na janela terapêutica (600 - 850 nm), sob linhagem de células B16F10. Comparativamente, a atividade citotóxica de [Ru(NO)(ONO)pc] foi muito maior que [Rupc], sob diferentes níveis de potência do laser, sugerindo a liberação de óxido nítrico pós-produção de oxigênio singlete, após irradiação luminosa, pode ser um importante mecanismo pelo qual o complexo nitrosilo de rutênio apresenta maior atividade biológica, na linhagem de célula estudada. Após a ativação por irradiação luminosa, o complexo [Ru(NO)(ONO)pc] apresentou diminuição da viabilidade celular na linhagem B16/F10, com eficácia dependente da potência do laser. O encapsulamento de [Ru(NO)(ONO)pc] em lipossoma aumentou em cerca de 25 % a atividade citotóxica do complexo nitrosilo, quando comparado com o mesmo, porém em solução de PBS. Esta eficácia foi diretamente proporcional à quantidade de rutênio no interior da célula, cuja concentração foi determinada por espectrometria de massa ICP-MS, evidenciando maior eficácia no mecanismo de transporte do complexo nitrosilo para o interior da célula. A atividade fotocitotóxica foi atribuída principalmente aos fenômenos de apoptose, cujo o mecanismo foi derivado da análise por citometria de fluxo. O mecanismo de liberação de NO dá-se por processo redutimétrico do complexo [Ru(NO)(ONO)pc], haja vista que a vasodilatação estudada é dependente do NO, liberado do complexo nitrosilo, e independente da irradiação luminosa. Aliás, concentração da ordem de 1,0 x 10-7 M do complexo de rutênio em PBS ocasionou 100 % de vasodilatação, cuja concentração é semelhante ao do nitroprussiato de sódio, medicamento utilizado em clínica médica com severas restrições. Em princípio, a liberação de óxido nítrico pós-produção de oxigênio singlete, oriundo da irradiação luminosa na janela terapêutica, do complexo nitrosilo de rutênio, pode constituir-se num poderoso mecanismo para aumentar a eficácia da terapia fotodinâmica, uma portentosa terapia clínica que encontra limitação dependente do tamanho da área cancerígena bem como da vascularização desta área. / The synthesis, structural aspects, photochemistry, photophysical, farmacological studies and in vitro photoinduced cytotoxic properties of [Ru(NO)(ONO)pc] (pc = phthalocyanine) are described in this work. Its biological effect was studied in the presence and absence of therapeutic window light irradiation (600 - 850 nm) in B16/F10 cell line by means nitric oxide and singlet oxygen production. At comparable light irradiation potency levels [Ru(NO)(ONO)pc] was more effective than [Rupc] suggesting nitric oxide release followed by singlet oxygen production upon light irradiation may be an important mechanism by which the nitrosyl ruthenium complex exhibits more biological activity in cells. Following visible light activation, the [Ru(NO)(ONO)pc] complex showed an increased potency with photoinduced dose modifications in the B16/F10 cells. The liposome containing [Ru(NO)(ONO)pc] complex was over 25 % more active than the corresponding ruthenium complex in PBS solution. It was directly proportional to the amount of ruthenium inside the cell obtained by ICP-mass spectrometry evidencing the cross membrane barrier providing phenomenal increase of [Ru(NO)(ONO)pc] complex concentration inside the cell. The photocytotoxic activity was mainly attributed to the apoptosis phenomena by flux cytometry analysis. The mechanism of NO release occurs by reductimetric process of [Ru(NO)(ONO)pc] complex, considering the vasodilation studies, which vasorelaxation showed dependence on NO concentration and independence on light irradiation. Moreover, concentration of 1.0 x 10-7 M of the ruthenium complex in PBS caused 100% vasodilation, which is similar to the concentration of sodium nitroprusside, a drug used in medical clinic with severe restrictions. Furthermore, the nitric oxide release followed by singlet oxygen production upon light irradiation of the nitrosyl ruthenium complex produced two radicals capable to improve photodynamic therapy, a clinical therapy which efficiency is actually limited by the cancer area and vascularization

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é um tratamento usado principalmente na terapia anticâncer e que depende da retenção de um composto fotossensibilizante nas células tumorais e posterior irradiação dessas células com luz visível. Após ativação, o fármaco pode gerar espécies reativas de oxigênio (EROs), como o oxigênio singlete (1O2) e radicais (O2-, OH), que são capazes de danificar membranas, DNA e outras estruturas celulares, induzindo a apoptose ou necrose das células tumorais. O ácido fólico, por ser super expressado na superfície das células de alguns tipos de cânceres (principalmente os ginecológicos), pode desempenhar o papel de vetorizador, tornando-se um importante aliado aos sistemas de liberação de fármacos. Neste trabalho foi avaliado o uso de ácido fólico como aditivo aos lipossomas contendo ftalocianina de cloro-alumínio como fármaco fotossensibilizante, aplicados em TFD com células MCF7. Os estudos demonstraram que os sistemas lipossomais desenvolvidos apresentam tamanho nanométrico (menor que 200 nm) e possuem biocompatibilidade quando avaliados em cultura celular de monocamada. Além disso, foi possível observar o efeito fototóxico satisfatório das formulações e o aumento da internalização do fármaco, quando utilizado o ácido fólico como vetorizador. / Photodynamic Therapy (PDT) is mainly used in anticancer therapy. The efficiency of this treatment is dependent on retention of photosensitizer compound at the tumor cells and posterior irradiation of these cells with visible light. After activation, the drug may generate reactive oxygen species (ROS) such as singlet oxygen (1O2) and radicals (O2-, OH), which are capable of damaging membranes, DNA and other cell structures, inducing apoptosis or necrosis of tumor cells. Folic acid is super-expressed on the surface of some cancers cells (especially gynecological cancer cells) and can play the role of target system, becoming an important ally for drug delivery systems. This study evaluated the use of folic acid as an additive to liposomes containing chloro-aluminum phthalocyanine as a photosensitizer drug, applied in PDT with MCF7 cells. These studies showed that liposomal systems have nanometer size (less than 200 nm) and have biocompatibility when evaluated in monolayer cell culture. Moreover, it was possible to observe satisfactory phototoxic effect of the formulations and increased internalization of the drug when folic acid is used.

Os neutrófilos são células fagocíticas do sistema imunológico mobilizadas principalmente no combate a infecções. Estas células são capazes de matar os micro-organismos através da desgranulação, que leva à liberação de moléculas antimicrobianas, e da produção de espécies reativas de oxigênio. Embora o recrutamento de neutrófilos seja essencial para a proteção do organismo, sua ativação excessiva resulta na intensa liberação de moléculas citotóxicas no meio extracelular, o que pode desencadear o desenvolvimento e/ou agravar o quadro clínico de doenças autoimunes e inflamatórias, como a artrite reumatoide. Uma possível abordagem terapêutica para o tratamento destas doenças é a modulação das funções efetoras dos neutrófilos. Estudos prévios mostraram que o extrato etanólico das folhas de Baccharis dracunculifolia (EEBd) possui grande potencial terapêutico, uma vez que apresenta expressiva atividade antioxidante frente ao metabolismo oxidativo dos neutrófilos. Para dar continuidade à investigação da atividade anti-inflamatória e/ou imunomoduladora deste extrato, o presente trabalho avaliou, na primeira etapa, o seu efeito modulatório sobre importantes funções efetoras de neutrófilos que medeiam o reconhecimento a e eliminação de patógenos - fagocitose, desgranulação e atividade microbicida - e sobre a atividade de enzimas lisossomais. Verificou-se que o EEBd, dependendo da concentração, inibe o metabolismo oxidativo dos neutrófilos sem alterar a capacidade de defesa das células. Na segunda etapa, foi avaliada a atividade antioxidante de sete compostos isolados do EEBd - ácido cafeico, ácido cumárico, ácido ferúlico, ácido cinâmico, aromadendrina-4?-metil éter, isosacuranetina e hispidulina - frente ao metabolismo oxidativo dos neutrófilos, a fim de propor possíveis marcadores químicos para as atividades biológicas do extrato. Os resultados apontaram o ácido cafeico como um potencial marcador químico da atividade biológica em questão. Na terceira etapa, com o intuito de aumentar a biodisponibilidade e favorecer o uso terapêutico dos produtos naturais estudados, o EEBd e o ácido cafeico foram incorporados em lipossomas, e constatou-se que a incorporação não alterou suas atividades antioxidantes frente aos neutrófilos, quando comparado às respectivas amostras na forma livre. Por fim, foi avaliado o efeito terapêutico do EEBd e do ácido cafeico, ambos na forma livre e incorporada em lipossomas, em um modelo animal de artrite. Verificou-se que as amostras na forma livre melhoraram expressivamente os parâmetros inflamatórios nas articulações, promovendo redução do edema e da migração de células totais e de neutrófilos, e discreta diminuição da concentração das citocinas inflamatórias TNF-?, IL-6 e IL-1?. Além disso, a incorporação do EEBd e do ácido cafeico em lipossomas pode auxiliar na redução das suas concentrações necessárias para a obtenção dos efeitos terapêuticos desejados. Assim, pode-se concluir que o EEBd tem grande potencial para se tornar um agente terapêutico adjuvante no tratamento de doenças inflamatórias mediadas por neutrófilos, sendo o ácido cafeico um possível marcador químico para a atividade anti-inflamatória do extrato. / Neutrophils are phagocytic immune cells mobilized primarily to fight against infections. These cells are capable to kill microorganisms through degranulation, which leads to the release of antimicrobial molecules, and production of reactive oxygen species. Although neutrophil recruitment is essential for host protection, excessive activation of these cells culminates in intense discharge of cytotoxic molecules to the extracellular milieu, which can elicit the development of and/or aggravate the clinical condition in autoimmune and inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis. Modulation of the effector functions of neutrophils is a possible therapeutic approach to treat these diseases. Previous studies have shown that the ethanolic extract of Baccharis dracunculifolia leaves (EEBd) has a great therapeutic potential due to its significant antioxidant effect towards the oxidative metabolism of neutrophils. To continue investigating the anti-inflammatory and/or immunomodulatory action of such extract, the first part of the present work examined its modulator effect on three important effector functions of human neutrophils that mediate recognition and clearance of pathogens - phagocytosis, degranulation, and microbial killing - and on the activity of lysosomal enzymes. EEBd inhibited the oxidative metabolism of neutrophils without affecting their defense ability, depending on the extract concentration used. To propose possible chemical markers for the biological effects of the extract, the second part of this study evaluated the antioxidant activity of seven compounds isolated from EEBd - caffeic acid, coumaric acid, ferulic acid, cinnamic acid, aromadendrin-4\'-methyl ether, isosakuranetin, and hispidulin - towards the oxidative metabolism of neutrophils. The results pointed to caffeic acid as a potential chemical marker for this biological activity. The third part of this investigation aimed to improve the bioavailability and favor the therapeutic use of the natural products studied. EEBd and caffeic acid were incorporated into liposomal carrier systems. The incorporation of both samples into liposomes did not alter their antioxidant activity towards neutrophils, as compared with their respective free forms. Finally, this study examined the therapeutic effect of EEBd and caffeic acid, both in the free form and incorporated into liposomes, in an animal model of arthritis. The free samples markedly improved the joint inflammatory parameters: they reduced edema and migration of total cells and neutrophils, and slightly lowered the levels of the inflammatory cytokines tumor necrosis factor ? and interleukin 6 and 1? (TNF-?, IL-6, and IL-1?, respectively). In addition, incorporation of EEBd and caffeic acid into liposomes can help to reduce their concentrations required to achieve the desired therapeutic effect. Based on the set of results obtained in this study, we conclude that EEBd has a great potential to become a therapeutic adjuvant in the treatment of neutrophil-mediated inflammatory diseases, and that caffeic acid is a possible chemical marker of the anti-inflammatory activity of the extract.