Nos últimos anos, vegetais têm sido responsáveis por surtos de enfermidades transmitidas por alimentos (ETA) em diversas regiões do mundo por serem veículos dos mais diferentes micro-organismos patogênicos, entre eles Salmonella spp, Listeria monocytogenes e Escherichia coli produtora de toxina de Shiga (STEC). O uso de sanitizantes nem sempre reduz de maneira significativa a população de micro-organismos presentes nos vegetais, sendo necessária a aplicação de técnicas mais eficientes, entre elas, a radiação gama. Assim, os objetivos do presente estudo foram avaliar o efeito da irradiação na redução de STEC, Salmonella spp. e L. monocytogenes inoculadas em espinafre minimamente processado, bem como sobre os atributos físico-químicos e sensoriais do vegetal. Amostras de espinafre (Tetragonia expansa) foram inoculadas com um \"pool\" de cepas de Salmonella spp, um \"pool\" de cepas de L. monocytogenes e um \"pool\" de cepas de STEC, separadamente, e expostas às doses de 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 kGy. Os valores de D10 para Salmonella spp, L. monocytogenes e STEC foram, respectivamente, 0,19 a 0,20 kGy, 0,20 a 0,21 kGy e 0,17 kGy. Foram avaliados os comportamentos de Salmonella spp, L. monocytogenes e STEC em amostras de espinafre expostas à doses cinco vezes maiores do que o valor D10 obtido para cada micro-organismo: 1,0; 1,05 e 0,85 kGy, respectivamente, e em amostras não irradiadas armazenadas por 12 dias a (4±1) °C e a (10±1) °C. Os resultados mostram que as doses empregadas reduziram a população de Salmonella e de STEC em aproximadamente 6 ciclos log no dia zero tendo permanecido abaixo do limite de detecção (<10 UFC/g), mesmo após 12 dias de armazenamento em ambas as temperaturas. A dose de 1,05 kGy reduziu a população de L. monocytogenes em, aproximadamente, 5 log imediatamente após a irradiação, porém com recuperação de 2,62 log nas amostras armazenadas a (10±1) °C ao final do período de armazenamento. Amostras de espinafre expostas às doses de 1 e 1,5 kGy e a amostra-controle, mantidas sob refrigeração (4±1) ºC, foram utilizadas para a avaliação da vida de prateleira (VP), análise sensorial, análise de cor, determinação de ácido ascórbico, flavonoides, compostos fenólicos e capacidade antioxidante. A VP da amostra exposta à dose de 1 kGy foi de 15 dias, dois dias a mais que a da amostra-controle, enquanto a exposta a 1,5 kGy apresentou VP de 12 dias. Todas as amostras expostas à radiação foram aceitas pelos provadores. A irradiação não provocou alterações significativas na concentração de compostos fenólicos e atividade antioxidante, porém houve alteração na cor e na concentração de flavonoides. As estações do ano, por sua vez, tiveram influência sobre a coloração, concentração de compostos fenólicos e atividade antioxidante. Apesar da alteração na coloração ter sido observada na análise instrumental, esta não foi percebida pelos provadores durante a análise sensorial. O processo de irradiação mostrou ser uma boa alternativa para aumentar a segurança microbiológica de espinafre sem alterar as características sensoriais. No entanto, o uso das Boas Práticas de Fabricação nunca deve ser negligenciado. / In recent years, fresh produce have been responsible for foodborne disease outbreaks worldwide, due to their contamination by different pathogenic microorganisms such as Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). The use of sanitizers does not always significantly reduce the microbial populations present in vegetables, and thus, the application of more efficient techniques such as gamma radiation, is required. The objectives of this study were to evaluate the effect of irradiation on the reduction of the populations of STEC, Salmonella spp. and L. monocytogenes, inoculated on minimally processed spinach, as well as to assess its effect on the sensory and physicochemical characteristics of the vegetable. Spinach (Tetragonia expansa) samples were individually inoculated, with a cocktail of three strains of Salmonella spp, three strains of L. monocytogenes and three strains of STEC and exposed to doses of 0, 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 and 1.0 kGy. The D10 values determined in this study ranged from 0.19 to 0.20 kGy for Salmonella spp, 0.20 to 0.21 kGy for L. monocytogenes, and 0.17 kGy for STEC. The behavior of Salmonella spp., L. monocytogenes and STEC were evaluated in spinach samples exposed to doses of 1.0, 1.05 and 0.85 kGy, respectively, and in non-irradiated samples, stored for 12 days at (4±1) °C and (10±1) °C. The results showed that the populations of Salmonella and STEC were reduced at about 6 log, on day zero, and remained below the detection limit (<10 CFU/g) even after 12 days of storage at both temperatures tested. The 1.05 kGy dose reduced the population of L. monocytogenes in approximately 5 log, but in the samples stored at (10±1) °C, the growth of the microorganism (2,62 log) was observed at the end of the storage time. Spinach samples exposed to 1 and 1.5 kGy, as well as the control sample, all kept under refrigeration (4±1) °C were used for the evaluation of the product shelf life, sensory analysis, color analysis, determination of ascorbic acid, flavonoids, phenolic compounds and the antioxidant capacity. The samples exposed to 1 kGy displayed a shelf life of 15 days, two days longer than that observed for the control sample, while those exposed to 1.5 kGy showed a shelf life of 12 days. All samples exposed to radiation were accepted by the sensorial panel. The irradiation had no significant effect either on the concentration of phenolic compounds or on the antioxidant activity. Nevertheless, there was a reduction in the concentration of flavonoids and change on the color. The color, phenolic compounds concentration and antioxidant activity were influenced by the seasons of the year. Although the change in color was observed by instrumental analysis, this was not perceived by the panelists during sensory analysis. The irradiation process is a great alternative for microbiological safety purpose together with Good Manufacturing Practices.

Os ramnolipídeos (RL) são biossurfatantes que apresentam características de grande interesse para a indústria de alimentos, tais como alta biodegradabilidade, baixa toxicidade e propriedades emulsionantes. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana do ramnolipídeo comercial (RL-Com - Jeneil Co.) e do ramnolipídeo produzido e purificado no Laboratório de Biotecnologia Microbiana (RL-LBM) sobre culturas de Listeria monocytogenes, através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) utilizando o método de microdiluição em caldo. Os valores de CIM dos RLs variaram entre 78,1 &mu;g mL-1 e 2500 &mu;g mL-1 sendo que a CIM predominante foi de 2500 &mu;g mL-1. Dentre as 32 L. monocytogenes testadas 68,7% foram sensíveis ao RL-LBM e 90,6% sensíveis ao RL-Com. O efeito do ramnolipídeo sobre L. monocytogenes mostrou-se predominantemente bacteriostático. O RL aumentou a permeabilidade celular de L. monocytogenes, contudo este efeito não foi relacionado à sua atividade antimicrobiana. A interação entre os antimicrobianos RL-Com e nisina foi avaliada sobre dois isolados de L. monocytogenes com sensibilidades diferentes ao RL, o L17 menos sensível, com CIM de 2500 &mu;g mL-1, e o L12 mais sensível, com CIM de 156,2 &mu;g mL-1. O índice CIF obtido para os isolados foi de 0,078 e 0,18 , para L17 e L12 respectivamente, caracterizando o efeito sinérgico da combinação entre RL e nisina. As curvas de sobrevivência dos isolados L12 e L17 mostraram que a interação entre a nisina e o RL foi bactericida em concentrações menores que as obtidas individualmente para cada antimicrobiano. Para a L12 a combinação de 78,1 &mu;g mL-1 de RL e 160 UI mL-1 de nisina reduziu completamente a população em 30 min de tratamento, e para a L17 a combinação de 156,2 &mu;g mL-1 de RL e 320 UI mL-1 de nisina foi bactericida após 2 h. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que o ramnolipídeo possui potencial como agente de controle de L. monocytogenes assim como efeito sinérgico quando combinado à nisina. / The rhamnolipids (RL) are biodegradable biosurfactants which have low toxicity and surface activity properties that can be useful for food processing industries. The objective of this study was to evaluate the susceptibility of Listeria monocytogenes with two rhamnolipids products: the rhamnolipid from P. aeruginosa LBI that was produced and purified in the Microbial Biotechnology Laboratory (RLMBL) and a commercial product (RL-Com - Jeneil Co.). Susceptibility tests were performed by the minimal inhibitory concentration (MIC) using the micro-broth dilution technique. The MIC values varied from 78.1 &mu;g mL-1 to 2500 &mu;g mL-1 and the 2500 &mu;g mL-1 concentration was the predominant value . Among the 32 tested cultures, 68.7% were susceptible to RL-MBL and 90.6% to RL-Com. Results showed that the rhamnolipid activity was primarily bacteriostatic. The RL increases the membrane permeability of L. monocytogenes, however this effect was not directly related to its antimicrobial activity. The combined effect of nisin and RL-Com was evaluated against two wild-type isolates of L. monocytogenes, L12 more sensitive (MIC 156.2 &mu;g mL-1) and L17 less sensitive (2500 &mu;g mL-1). The FIC index for the isolates were 0.18 and 0.078 for L12 and L17 respectively, indicating a particular synergistic effect. The survival curve of isolates L12 and L17 showed that the combination between nisin and RL was bactericidal at lower concentration than for the individual antimicrobials. For L12 isolate 78.1 &mu;g mL-1 of RL and 160 UI mL-1 of nisin eliminated the population after 30 min of incubation. The combination of 156.2 &mu;g mL-1 of RL and 320 UI mL-1 of nisin reduced completely L17 population after 2 h of incubation. This work demonstrated the potential antimicrobial activity of rhamnolipids against L. monocytogenes, as well as the synergistic effect of this biosurfactant with nisin.

A demanda por frutas e hortaliças frescas, associada à necessidade de maior praticidade da vida atual, está causando um aumento no interesse, por parte dos consumidores, nos produtos minimamente processados (MP). Processamento mínimo inclui as operações de lavagem, corte, descascamento e embalagem do produto. Entre os microrganismos patogênicos que, potencialmente, podem ser transmitidos por vegetais MP citam-se: Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 e Salmonella sp. A pesquisa destes microrganismos é usualmente demorada mas, a cada dia, novos métodos para detecção rápida de patógenos em alimentos são lançados no mercado. Dentre estes métodos, aqueles que empregam ferramentas moleculares têm se tornado mais populares, cabendo destacar os que empregam a reação de polimerização em cadeia (PCR). Para a pesquisa de Listeria monocytogenes existe no mercado o sistema automatizado BAX®System que permite a detecção de L. monocytogenes em, no máximo, 54 h. Neste estudo, buscou-se avaliar a microbiota de vegetais folhosos MP além do emprego do sistema BAX® para a detecção de L. monocytogenes nestes produtos. Foram examinadas, no período de março a julho de 2003, 181 amostras de saladas MP coletadas em diferentes estabelecimentos comerciais no município de São Paulo, SP. Em 133 amostras foram feitas determinações das populações de coliformes totais e fecais, Enterobacteriaceae, microrganismos psicrotróficos aeróbios e pesquisa de Salmonella sp. L. monocytogenes foi pesquisada nas 181 amostras empregando-se o sistema BAX® e, paralelamente, a semeadura do caldo de enriquecimento em placas contendo ágar Palcam e Oxford, com a identificação das colônias suspeitas através de testes bioquímicos tradicionais. Das 133 amostras, 51% apresentaram populações de microrganismos psicrotróficos aeróbios > 106 UFC/g e 42% apresentaram populações de Enterobacteriaceae entre 105 – 106 UFC/g. Coliformes fecais estiveram presente em populações superiores a 102 UFC/g em 97 amostras (73%) e Salmonella foi detectada em 4 amostras (3%). L. monocytogenes estava presente em 1 (0.6%) amostra de espinafre das 181 amostras examinadas, tendo sido detectada, simultaneamente, por ambos os métodos empregados. As outras espécies de Listeria encontradas, empregando-se a semeadura em placa foram: L. welshimeri (1 amostra de alface mimosa) e L. innocua (2 amostras de agrião). Os resultados indicam que grande parte dos vegetais MP examinados, apresentaram qualidade microbiológica deficiente e podem ser veículos de patógenos como a Salmonella. O BAX®System é de grande utilidade para as análises de vegetais MP, que permite a obtenção de resultados mais rapidamente que o método tradicional, sem perda na sensibilidade e na especificidade. / The increasing demand for fresh fruits and vegetables, associated with the desire of convenient goodies, is causing an expansion on the market share of minimally processed products (MP). Minimal processing includes operations such as washing, cutting, peeling and packaging of the product. Amongst pathogenic microorganisms that can be transmitted by MP vegetables are: Listeria monocytogenes (Lm), Escherichia coli O157:H7 and Salmonella sp. Searching for these microorganisms is labor intense and time-consuming, however new methods for fast detection of pathogens are commercially available. Methods employing molecular technology are becoming more popular and the polymerase chain reaction (PCR) is now a good choice. There is an automatized PCR system (BAX®System) that can be used for Lm detection in up to 54 h. The aims of this study was to evaluate the microflora of MP vegetables and to evaluate the effectiveness of the BAX®System for screening Lm on those products. From March to July 2003, 181 samples of MP salads were collected at retail level in the city of São Paulo, SP. Total and faecal coliforms, Enterobacteriaceae, psychrotrophic microorganisms enumeration and Salmonella evaluation were conducted in 133 samples. L. monocytogenes was assessed in 181 samples using the BAX®System and also by plating the enrichment broth onto palcam and Oxford agars. Suspected colonies of Listeria were submited to classical biochemical tests. Population of psychrotrophic microorganisms >106 CFU/g was observed in 51% of the 133 samples and Enterobacteriaceae population between 105 - 106 CFU/g was in 42%. 97 samples (73%) showed population of faecal coliforms >102 CFU/g (Brazilian standard) and Salmonella was detected in 4 samples (3%). L. monocytogenes was detected in 1 spinach sample (0,6%) out of the 181 examined MP vegetables. This positive sample was simultaneously detected by both methods. The other Listeria species identified by plating were L. welshimeri (1 sample of curly lettuce) and L. innocua (2 watercress samples). The results indicate that the MP vegetables had poor microbiological quality and could be vehicle of pathogens such as Salmonella. BAX®System showed good specificity and sensitivity when used for vegetable analysis and was easier to perform and faster than the classical method.

Os ramnolipídeos (RL) são biossurfatantes que apresentam características de grande interesse para a indústria de alimentos, tais como alta biodegradabilidade, baixa toxicidade e propriedades emulsionantes. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana do ramnolipídeo comercial (RL-Com - Jeneil Co.) e do ramnolipídeo produzido e purificado no Laboratório de Biotecnologia Microbiana (RL-LBM) sobre culturas de Listeria monocytogenes, através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) utilizando o método de microdiluição em caldo. Os valores de CIM dos RLs variaram entre 78,1 &mu;g mL-1 e 2500 &mu;g mL-1 sendo que a CIM predominante foi de 2500 &mu;g mL-1. Dentre as 32 L. monocytogenes testadas 68,7% foram sensíveis ao RL-LBM e 90,6% sensíveis ao RL-Com. O efeito do ramnolipídeo sobre L. monocytogenes mostrou-se predominantemente bacteriostático. O RL aumentou a permeabilidade celular de L. monocytogenes, contudo este efeito não foi relacionado à sua atividade antimicrobiana. A interação entre os antimicrobianos RL-Com e nisina foi avaliada sobre dois isolados de L. monocytogenes com sensibilidades diferentes ao RL, o L17 menos sensível, com CIM de 2500 &mu;g mL-1, e o L12 mais sensível, com CIM de 156,2 &mu;g mL-1. O índice CIF obtido para os isolados foi de 0,078 e 0,18 , para L17 e L12 respectivamente, caracterizando o efeito sinérgico da combinação entre RL e nisina. As curvas de sobrevivência dos isolados L12 e L17 mostraram que a interação entre a nisina e o RL foi bactericida em concentrações menores que as obtidas individualmente para cada antimicrobiano. Para a L12 a combinação de 78,1 &mu;g mL-1 de RL e 160 UI mL-1 de nisina reduziu completamente a população em 30 min de tratamento, e para a L17 a combinação de 156,2 &mu;g mL-1 de RL e 320 UI mL-1 de nisina foi bactericida após 2 h. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que o ramnolipídeo possui potencial como agente de controle de L. monocytogenes assim como efeito sinérgico quando combinado à nisina. / The rhamnolipids (RL) are biodegradable biosurfactants which have low toxicity and surface activity properties that can be useful for food processing industries. The objective of this study was to evaluate the susceptibility of Listeria monocytogenes with two rhamnolipids products: the rhamnolipid from P. aeruginosa LBI that was produced and purified in the Microbial Biotechnology Laboratory (RLMBL) and a commercial product (RL-Com - Jeneil Co.). Susceptibility tests were performed by the minimal inhibitory concentration (MIC) using the micro-broth dilution technique. The MIC values varied from 78.1 &mu;g mL-1 to 2500 &mu;g mL-1 and the 2500 &mu;g mL-1 concentration was the predominant value . Among the 32 tested cultures, 68.7% were susceptible to RL-MBL and 90.6% to RL-Com. Results showed that the rhamnolipid activity was primarily bacteriostatic. The RL increases the membrane permeability of L. monocytogenes, however this effect was not directly related to its antimicrobial activity. The combined effect of nisin and RL-Com was evaluated against two wild-type isolates of L. monocytogenes, L12 more sensitive (MIC 156.2 &mu;g mL-1) and L17 less sensitive (2500 &mu;g mL-1). The FIC index for the isolates were 0.18 and 0.078 for L12 and L17 respectively, indicating a particular synergistic effect. The survival curve of isolates L12 and L17 showed that the combination between nisin and RL was bactericidal at lower concentration than for the individual antimicrobials. For L12 isolate 78.1 &mu;g mL-1 of RL and 160 UI mL-1 of nisin eliminated the population after 30 min of incubation. The combination of 156.2 &mu;g mL-1 of RL and 320 UI mL-1 of nisin reduced completely L17 population after 2 h of incubation. This work demonstrated the potential antimicrobial activity of rhamnolipids against L. monocytogenes, as well as the synergistic effect of this biosurfactant with nisin.

A formação de biofilme representa preocupação à indústria de alimentos pois é uma fonte crônica de contaminação. Encontrar estratégias eficientes para controlar o crescimento de microrganismos continua a ser um importante desafio. Uma delas é o uso dos ramnolipídeos (RLs), um biossurfatante produzido tipicamente por P. aeruginosa que apresenta potencial como agente antimicrobiano, anti-adesivo e dispersivo. Sua baixa toxicidade, biodegradabilidade, eficiência e especificidade em comparação aos surfatantes sintéticos podem torná-los promissores agentes de biocontrole. O presente estudo teve como objetivo estudar o potencial de uso de ramnolipídeos, em diferentes condições de concentração e temperatura, no controle e remoção de biofilmes de patógenos alimentares formados em meio de cultura e leite. Foram utilizadas Escherichia coli ATCC 43895, Listeria monocytogenes ATCC 19112, Staphylococcus aureus ATCC 8095, reconhecidos patógenos alimentares. Os biofilmes foram formados em placas de microtitulação de poliestireno nos meios de cultivo: caldo nutriente (CN), extrato de levedura com triptona de soja (TSYE) e matriz alimentar (leite) à 37 &deg;C, por 24 h (E. coli) e 48 h (S. aureus e L. monocytogenes). Os biofilmes foram avaliados pela quantificação da biomassa, viabilidade celular, hidrofobicidade de superfície e análises qualitativa (microscopia eletrônica de varredura e de fluorescência) e quantitativa (caracterização da matriz polimérica). O ramnolipídeo foi submetido à análise físico-química de espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Os resultados obtidos para E. coli mostraram que a concentração de RL que mais removeu o biofilme foi 2 &permil;, porém em temperaturas diferentes, para o CN à 25 &deg;C e para o leite à 37 &deg;C, com 33 &permil; e 80 &permil; de remoção, respectivamente. Para o biofilme de S. aureus em caldo nutriente os resultados mais eficientes foram à 25 &deg;C, na concentração de 0,1 &permil; de RL e em leite 4 &deg;C, na concentração de 0,05 &permil; de RL, com remoção de 35 &permil; e 89 &permil;, respectivamente. O biofilme de L. monocytogenes em TSYE mostrou-se mais sensível à 37 &deg;C, na concentração 0,5 &permil; de RL, o qual foi possível remover 35,3 &permil; da biomassa. Enquanto que em leite a 4 °C e 0,5 &permil; de RL, com remoção de 63,6 &permil; .Quanto à redução das células viáveis foi observado que para as bactérias Gram-positivas o tratamento mais efetivo foi à 4 &deg;C com 0,05 &permil; de RL, nos meios CN e TSYEe 1 &permil; em leite. Para os biofilmes de E. coli a maior redução da viabilidade ocorreu em leite, após tratamento com RL 0,05 &permil; à 37 &deg;C. As imagens de microscopia mostraram uma morfologia heterogênea na presença dos diferentes meios de cultivos, com destaque para os biofilmes de S. aureus (leite) e L. monocytogenes (TSYE), nos quais houve grande produção de matriz polimérica extracelular (MPE), e também apresentaram as maiores quantidades de carboidratos e proteínas. O tratamento com o ramnolipídeo reduziu a hidrofobicidade dos biofilmes. As análises de DLS e SAXS mostraram uma predominância em número de micelas com diâmetro entre 1-10 nm, independente das concentrações e temperaturas analisadas. De modo geral, a aplicação de ramnolipídeo promoveu remoção da biomassa celular como também redução de células viáveis presentes no biofilme. As evidências obtidas aqui, podem ser importantes subsídios para futuras investigações sobre as interações físico-químicas entre ramnolipídeos e a camada de biofilme visando aplicação como agentes sanitizantes em indústria de alimentos. / Biofilm formation is a concern to the food industry because it is a chronic source of contamination. Finding effective strategies to control the growth of microorganisms remains a major challenge. One strategy is the use of rhamnolipids (RLs), a biosurfactant typically produced by P. aeruginosa that has potential as antimicrobial, anti-adhesive and biofilm disrupting agent. RLs low toxicity, biodegradability, efficiency and specificity comparatively to synthetic surfactants, makes them promising biocontrol agents. This work aimed to study the potential use of rhamnolipid at different conditions of concentration and temperature, to control and removal of biofilms of food pathogens established in culture medium and milk. The bacterial strain utilized Escherichia coli ATCC 43895, Listeria monocytogenes ATCC 19112, Staphylococcus aureus ATCC 8095, are well-recognized food pathogens. The biofilms were formed in polystyrene microtiter plates in culture media: nutrient broth (NB), yeast extract and tryptone soya (TSYE) and in food matrix (milk) at 37 &deg;C for 24 h (E. coli) and 48 h (S. aureus and L. monocytogenes). Biofilms were assessed by biomass quantification, cell viability, surface hydrophobicity, qualitative (scanning electron microscopy and fluorescence) and quantitative (characterization of polymer matrix) analysis. The rhamnolipid was subjected to physical and chemical analysis of dynamic light scattering (DLS) and X-ray small angle scattering (SAXS). E. coli biofilms were removed more efficiently using 2 &permil; RL, but at different temperatures for NB (25 °C) and milk (37 &deg;C) showing 33 &permil; and 80 &permil; respectively. For the biofilm of S. aureus in NB the best results was obtained at 25 &deg;C and 0.1 &permil; RL and in milk medium at 4 &deg;C with 0.05 &permil; RL showing 35 &permil; and 89 &permil; of biofilm disruption, respectively. The biofilm of L. monocytogenes in TSYE was more sensitive to the treatment at 37 &deg;C with 0.5 &permil; RL, removing 35.3 &permil; of the biofilm; while in milk at 4 °C and 0.5 &permil; RL, biofilm removal reached 63.6 &permil;. Reduction on cell viability was more effective for Gram-positive bacteria at 4 &deg;C with 0.05 &permil; RL, for NB and TSYE and at 1 &permil; in milk. For E. coli biofilms the largest reduction of viability occurred in milk after treatment with 0.05 &permil; RL at 37 &deg;C. The microscopy images showed a heterogeneous morphology in the presence of different media, especially biofilms of S. aureus (milk) and L. monocytogenes (TSYE), in which there was a great production of extracellular polymeric matrix (EPM), and also the highest amounts of carbohydrates and protein. The treatment with RL reduced the hydrophobicity of biofilms. The DLS and SAXS analysis of RL showed a predominance of micelles with diameters between 1-10 nm, independent of the concentrations and temperatures utilized. In general, the application of rhamnolipid promoted a reduction in biofilm mass as well in cell viability. The evidences obtained can provide a basis for future research on the physical and chemical interactions between rhamnolipid and biofilm layer aiming their application as sanitizers in food industry.

Listeria monocytogenes é um microrganismo patogênico psicrotrófico e consequentemente de grande importância para alimentos conservados em refrigeração. Vários estudos têm demonstrado que é possível utilizar antimicrobianos naturais, como bacteriocinas e compostos fenólicos, para retardar a multiplicação desse patógeno em produtos cárneos refrigerados. Entretanto, sabe-se que a atividade antimicrobiana desses compostos pode ser influenciada pelos componentes da matriz alimentar. Esse trabalho de mestrado pretendeu avaliar a influência dos ingredientes de lingüiça frescal de suíno na ação inibitória de óleo essencial de orégano (OEO) e nisina sobre Listeria monocytogenes. Foram realizados testes com diferentes modelos alimentares preparados com carne suína moída adicionada de cada um dos ingredientes utilizados na fabricação de lingüiça frescal (sais de cura, açúcar, antioxidante, emulsificante, condimentos e NaCl) separadamente, comparando-se os resultados com os obtidos no modelo contendo todos os ingredientes simultaneamente. Pretendeu-se também avaliar a interferência do tempo de contato da nisina e óleo essencial de orégano com os diferentes modelos alimentares na ação antimicrobiana sobre L. monocytogenes. Os resultados indicaram que os antimicrobianos foram capazes de inibir a multiplicação de L. monocytogenes em todos os modelos analisados armazenados à 5ºC por até 72h. Comparando-se todos os modelos compostos por carne adicionada de apenas um dos ingredientes, a maior atividade antilisterial foi observada no modelo composto de carne com antioxidante. Entretanto, essa atividade inibitória foi menor do que a obtida no modelo contendo todos os ingredientes em conjunto. Quanto à influência do tempo prévio de contato entre os antimicrobianos e os modelos estudados na ação antilisterial, observou-se que na formulação com todos os ingredientes a ação foi mais intensa quando o contato foi de 2h. Entretanto, neste modelo o efeito mais duradouro foi obtido com 12h de contato prévio. Nos demais modelos, o maior efeito foi obtido no tempo zero. Os resultados permitem concluir que cada um dos ingredientes da formulação da lingüiça contribui com uma parcela na ação antilisterial do OEO e nisina nesse produto, e que essa ação é influenciada pelo tempo de contato prévio entre os modelos e os agentes antimicrobianos. / Listeria monocytogenes is psychrotrophic pathogen and, consequently, very important for cold-preserved foods. Many studies have demonstrated that natural antimicrobials such as bacteriocins and phenolic compounds can be used to inhibit the growth of this pathogen in refrigerated meat products. However, it is known that the antimicrobial activity of these antimicrobials may be influenced by components of the food matrix. The aim of the present study was to evaluate the influence of the ingredients of \"lingüiça\" in the inhibitory activity of O.E.O. and nisin against L. monocytogenes. The study was carried out with different food models prepared with minced raw pork meat added separately of each ingredient used for manufacturing \"lingüiça\" (curing salts, sugar, antioxidants, emulsifiers, condiments and NaCl), and results were compared to those obtained in a model containing all ingredients simultaneously. The study also aimed to evaluate the interference of the contact time between the food models and the antimicrobials on the effect against L. monocytogenes. Results indicated that the antimicrobials added to the models were able to inhibit the growth of the pathogen at 5ºC up to 72h. Comparing the models, the highest antilisterial activity was observed in the model containing pork meat and antioxidants. However, this inhibitory activity was lower than that observed in the model with all ingredients. What concerns the influence of contact time in antilisterial activity, we observed that in the model containing all ingredients the antilisterial activity was more intense after 2h of contact, but the more lasting effect was observed after 12h of contact. In the other models, the most intense effect was noted in time zero. The conclusions of the study are that each ingredient used in manufacture of \"lingüiça\" has its share in the antilisterial activity of nisin and OEO in this product and that this activity is influenced by the contact time between the food matrix and the antimicrobials.

A aplicação das bacteriocinas de bactérias láticas como agentes de bioconservação de alimentos é dependente de vários fatores, com destaque para composição química do alimento que pode interferir na eficácia da atividade antimicrobiana. Esse estudo objetivou avaliar a influência de ingredientes da matriz alimentar na multiplicação e produção das bacteriocinas por Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a e na atividade das bacteriocinas produzidas, trabalhando-se com um modelo composto de extrato de carne, extrato de levedura, proteose peptona e amido, adicionado de 4% de NaCl e/ou 0,5% de glicose e mantido em refrigeração (4&#176; C) por até 10 dias. O estudo foi realizado com os seguintes materiais contendo as bacteriocinas: 1. sobrenadante concentrado livre de células obtido a partir da cultura de L. sakei 2a em caldo MRS; 2. extrato ácido neutralizado obtido do sedimento da cultura em caldo MRS e 3. extrato ácido neutralizado e semi-purificado por cromatografia líquida. Listeria monocytogenes Scott A foi empregada como microrganismo indicador da atividade antimicrobiana e Lactobacillus sakei ATCC 15521 como controle não produtor de bacteriocinas. Os resultados indicaram que nenhum dos ingredientes do modelo avaliado teve papel importante na multiplicação de L. sakei 2a e na bacteriocinogênese. No entanto, 4% de NaCl interferiu negativamente na produção das bacteriocinas, enquanto 0,5% de glicose auxiliou a produção, mesmo na presença de 4% de NaCl. Em relação à atividade das bacteriocinas, verificou-se que nem os ingredientes do modelo, nem 4% de NaCl e nem 0,5% de glicose apresentaram interferência marcante ao longo dos dez dias estudados, independentemente do material contendo as bacteriocinas testado. / The application of bacteriocins produced by lactic acid bacteria as biopreservatives in foods depends of several factors, such as the chemical composition of the food, which can interfere with the antimicrobial activity. This study aimed to evaluate the influence of food ingredients on the growth and production of bacteriocins by Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a, and on the activity of the bacteriocins produced, by means of a food model prepared with meat extract, yeast extract, proteose-peptone and starch, added of 4% 4% de NaCl and/or glucose, maintained under refrigeration (4&#176; C) for up to 10 days. The study was carried out with the following bacteriocins-containing materials: 1. the concentrated cell-free supernatant from an overnight culture of L.sakei 2a in MRS broth; 2. acid extract obtained from the sediment of the overnight culture of L. sakei 2a in MRS broth and 3. acid extract submitted to a semi-purification by HPLC. Listeria monocytogenes Scott A was used as the antimicrobial activity indicator microorganism and Lactobacillus sakei ATCC15521 as the non-bacteriocinogenic negative control. Results indicated that none of the ingredients presented a significant role in the growth of L.sakei 2a, and in the production and activity of the bacteriocins. However, 4% of NaCl caused a reduction on the production of bacteriocins, while 0,5% of glucose stimulated their production, even in the presence of 4% of NaCl. The interference of the ingredients of the model, 4% of NaCl and/or 0,5% of glucose on the activity of the bacteriocins was not marked, regardless the materials used in the tests.

O controle de Listeria monocytogenes (Lm) nas plantas processadoras de alimentos é uma tarefa difícil, devido à sua capacidade em formar biofilmes e se adaptar às condições adversas do ambiente. A sobrevivência a altas concentrações de cloreto de sódio, além da multiplicação em temperaturas de refrigeração são outras duas importantes características de isolados de Lm, incluindo os dois sorotipos mais prevalentes da espécie (4b e 1/2a). Os objetivos deste estudo foram avaliar o comportamento de multiplicação, da expressão gênica global e da virulência dos dois principais sorotipos de Lm em ambientes de estresse encontrados por esses micro-organismos na indústria de alimentos. Para tanto, 22 cepas de Lm - 12 isoladas de casos clínicos (seis cepas sorotipo 4b e seis sorotipo 1/2a) e 10 isoladas de alimentos (seis sorotipo 4b e quatro sorotipo 1/2a) - além de uma cepa de Listeria monocytogenes Scott A e outra de Listeria innocua, foram inoculadas em caldo BHI com atividade de água (aw) 0,94 (11% NaCl) e incubadas a 4°C, 10°C e 25°C durante 73, 42 e 15 dias, respectivamente. A 4°C, a maior parte das cepas, tanto clínicas como de origem alimentar, conseguiu se manter viável ou ainda se multiplicar e aumentar até 2 log UFC/ml a partir da população inicial. Já a 10°C, a maioria das cepas conseguiu se multiplicar, porém diferenças significativas (p < 0,05) na duração da fase lag entre as cepas dos sorotipos 1/2a e 4b, independentemente da origem das mesmas, foram observadas (lag1/2a > lag4b). Diferenças estatísticas também foram observadas no que diz respeito às cepas de Lm sorotipo 4b, quando incubadas a 25°C em meio de cultura BHI com aw 0,94, apresentando maiores taxa de multiplicação e concentração populacional máxima (p < 0,05) em comparação às cepas de Lm sorotipo 1/2a submetidas às mesmas condições. Já com relação ao potencial de virulência das cepas, não foram detectadas diferenças estatísticas entre os sorotipos com relação a sua capacidade hemolítica, entretanto, a capacidade de invasão das cepas sorotipo 4b em células Caco-2 foi maior (p < 0,05) em comparação ao sorotipo 1/2a. Além disso, análises comparativas pré e pós-estresse osmótico confirmaram o aumento no potencial de invasão (p < 0,05) tanto das cepas sorotipo 1/2a, quanto 4b após o contato com elevadas concentrações de sal. O papel dos reguladores de transcrição Sigma B e PrfA na sobrevivência de Listeria monocytogenes, sob condição de estresse osmótico, também foi avaliado. Ensaios de microarray com cepas das linhagens I e II demonstraram maiores níveis de transcrição para 173 e 68 genes, respectivamente, na cepa selvagem quando comparada à cepa mutante &#916sigB, incluindo genes relacionados à virulência (internalinas), sobrevivência a condições de estresse e metabolismo. Os resultados obtidos confirmam a habilidade de cepas de Lm se manterem viáveis ou mesmo se multiplicarem em baixas temperaturas, bem como em ambientes com elevada pressão osmótica, independentemente do sorotipo ou origem, enfatizando a necessidade de tomada de medidas efetivas de controle desse patógeno pela indústria de alimentos uma vez que cepas de Lm podem, além de sobreviver às condições adversas, ter seu potencial de virulência aumentado. Os dados obtidos também indicam a necessidade de mais estudos de avaliação comportamental e viabilidade de Lm em ambientes com concentração de sal modificada, uma vez que a discussão sobre a diminuição nos teores de sal em alimentos vem ganhando importância mundialmente. / The control of Listeria monocytogenes (Lm) in food processing plants is difficult due to its ability to form biofilms and adapt to adverse environmental conditions. The survival at high concentrations of sodium chloride and growing at low temperatures are two other important features of Lm isolates, including the two most prevalent serotypes (1/2a and 4b). The objectives of this study were to evaluate the growing behavior, global gene expression profile and virulence potential of the two main serotypes of Lm under osmotic stress environments encountered by these microorganisms in the food industry. 22 Lm strains - 12 isolated from clinical cases (six strains serotype 4b and six serotype 1/2a) and 10 isolated from food (six serotype 4b and four serotype 1/2a) - plus one L. monocytogenes Scott A and one Listeria innocua were inoculated into BHI broth with water activity (aw) 0.94 (11% NaCl) and were incubated at 4°C, 10°C and 25°C during 73, 42 and 15 days respectively. At 4°C, the majority of strains both clinical and food were able to remain viable and to grow (up to 2 log CFU/ml). At 10°C, most strains could grow but significant differences (p < 0.05) on the lag phase duration between the serotypes 1/2a and 4b strains, regardless their origin, were observed (lag1/2a > lag4b). Statistical differences were also observed related to Lm serotype 4b strains when grown in BHI with aw 0.94 at 25°C, that showed higher maximum growth rate and final density (p < 0.05) compared to Lm serotype 1/2a strains. Regarding the virulence potential, there were no statistical differences among serotypes with respect to its hemolytic activity, however, the invasiveness of serotype 4b strains in Caco-2 cells was higher (p <0.05) than serotype 1/2a. Furthermore, comparative analyzes before and after osmotic stress confirmed the increased potential for invasion (p < 0.05) in both serotypes (1/2a and 4b) after being submitted to high salt concentrations. The role of transcription regulators sigma B and PrfA in L. monocytogenes survival under osmotic stress condition was also evaluated. Microarray assay using lineage I and II strains showed increased transcription levels in 173 and 68 genes, respectively, when comparing the wild type strains to the mutant &#916sigB strain. This included genes related to virulence (internalina), survival under stress conditions and metabolic genes. The results confirm the ability of Lm strains in remain viable or even grow at low temperatures and in high osmotic pressure environments, regardless of serotype or origin. They also emphasize the need for effective measures to control this pathogen by food industry since it is possible that Lm strains survive under adverse conditions and also increase its virulence potential. The data also indicate the need for additional studies regarding the behavior of Lm in environments with modified sodium chloride concentration since the discussion about salt levels in foods is increasing worldwide.

O aumento na demanda por alimentos saudáveis e minimamente processados impulsiona a busca por novos agentes antimicrobianos. As bacteriocinas são peptídeos produzidos via ribossomo por algumas espécies de bactérias, podendo ser usadas na conservação e garantia da inocuidade de alimentos, não apresentando as possíveis ações tóxicas de conservadores clássicos amplamente utilizados na indústria alimentícia. Carnobacterium maltaromaticum C2 foi isolado de peixe defumado brasileiro (Surubim, Pseudoplatystoma sp.), e apresenta grande capacidade de inibir a multiplicação de Listeria monocytogenes, demonstrando seu potencial para aplicação na bioconservação de alimentos. Em estudos anteriores, foi demonstrado que essa linhagem bacteriana produz compostos antimicrobianos de origem proteica. Neste trabalho, foram avaliados aspectos gerais da produção de bacteriocinas por C. maltaromaticum C2, assim como sua purificação e caracterização. C. maltaromaticum C2 produz bacteriocinas entre 5 e 25ºC, com ótimo entre 20 e 25ºC. Do mesmo modo, a produção desses compostos foi maior em caldo APT (All purpose Tween), entretanto para as etapas de purificação foram utilizados o caldo BHI (Brain heart infusion) e CAA (Casamino acids), por causarem menos interferência no processo. Lactobacillus sakei e L. monocytogenes foram inibidos pelas bacteriocinas parcialmente purificadas produzidas por C. maltaromaticum C2, e seus peptídeos antimicrobianos apresentaram moderada estabilidade térmica quando expostos a 100ºC por 30 minutos. Foram utilizadas duas técnicas para extração e purificação das bacteriocinas, a técnica de adsorção-dessorção às células produtoras, e a purificação com a resina XAD-16, baseada em interações hidrofílicas e hidrofóbicas com os peptídeos, seguida de extração em fase sólida, sendo que este último processo de purificação resultou em um extrato com alto teor de pureza, como observado durante as análises por cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa. Com o auxílio de técnicas de espectrometria de massas, foi detectado nos extratos obtidos a presença das carnobacteriocinas BM1 e B1, assim como o peptídeo antimicrobiano CbnX. Este trabalho é pioneiro na purificação de CbnX, pois anteriormente havia somente a descrição de seu gene, mas não havia sido descrita a purificação do peptídeo. Neste sentido, a linhagem estudada é única até o momento e poderá favorecer estudos de expressão gênica de bacteriocinas, bem como a otimização de processos de bioconservação. / The high demand for healthy and minimally processed foods has increased the search for new antimicrobial agents. Bacteriocins are ribosomally synthesized peptides produced by some bacteria, and are useful for biopreservation and food safety, without the possible toxic effects of classical preservatives widely used in food industry. Carnobacterium maltaromaticum C2 was isolated from Brazilian smoked fish (Surubim, Pseudoplatystoma sp.), and it inhibits Listeria monocytogenes, an important foodborne pathogen. In previous studies, it was demonstrated that this bacterial strain produces bacteriocins. In this study, general aspects of the production of bacteriocins by C. maltaromaticum C2 were evaluated, as well as their purification and characterization. C. maltaromaticum C2 produces bacteriocins between 5 and 25ºC, with the optimum incubation temperature between 20 and 25ºC. Similarly, the production of these compounds was higher in APT (All-purpose Tween) broth. However, for the purification steps, BHI (Brain heart infusion) broth and CAA (Casamino acids) broth were used due to their low interference with the processes. Lactobacillus sakei and L. monocytogenes were inhibited by the partially purified bacteriocins produced C. maltaromaticum C2, and their antimicrobial peptides showed moderate thermal stability when tested at 100ºC by 30 minutes. Two techniques for extraction and purification of the antimicrobial peptides were used, the adsorption-desorption of bacteriocins to the producer cells, and the purification with XAD-16 resin, based on hydrophilic and hydrophobic interactions with the peptides, followed by a step of solid phase extraction. The latter resulted in an extract with high purity, as observed by the analysis with reverse-phase high performance liquid chromatography. With mass spectrometry techniques, carnobacteriocins BM1 and B1 were detected, as well as the antimicrobial peptide CbnX. This is an innovative work because the purification of CbnX had never been reported, except its gene. In this respect, this C. maltaromaticum strain is unique until this moment, and may promote researches on gene expression, as well the optimization of biopreservation processes.

Leite integral de búfala foi experimentalmente contaminado com Mycobacterium fortuitum e Listeria monocytogenes. Foi feita a análise quantitativa dos agentes imediatamente antes e depois de dois tratamentos térmicos: pasteurização (do leite) e filagem (da Mozzarella). Na análise da Listeria, foi empregada metodologia adaptada para a obtenção do NMP, usando os meios UVM, Fraser e Palcam como pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo e isolamento, respectivamente. O Mycobacterium foi semeado em placas com meio Löwenstein-Jensen modificado. Os resultados mostraram que a pasteurização do leite reduziu em média 6,0 log NMP/mL de Listeria sp e 4,0 log UFC/mL de Mycobacterium sp. A filagem da coalhada reduziu em média 8,37 log NMP/g de Listeria sp e 6,3 log UFC/g de Mycobacterium sp. Concluiu-se que a filagem da Mozzarella foi mais eficiente que a pasteurização do leite na redução do inóculo de Listeria monocytogenes e Mycobacterium fortuitum em cerca de 2 logaritmos de cada agente. / Whole buffalo milk was experimentally contaminated with Mycobacterium fortuitum and Listeria monocytogenes. The quantitative analysis of the agents was made immediately before and after two thermal treatments: pasteurization (of milk) and stretching (of Mozzarella). In the analysis of the Listeria, methodology adapted for the attainment of the MPN was used, employing UVM, Fraser and Palcam as not selective enrichment, selective enrichment and isolation, respectively. The Mycobacterium was plated onto modified Löwenstein-Jensen. The results had shown that the pasteurization of milk reduced 6,0 log MPN/mL Listeria sp on average, and 4,0 log CFU/mL de Mycobacterium sp. The stretching of the curd reduced 8,37 log MPN/g de Listeria sp on average, and 6,3 log CFU/g de Mycobacterium sp. It has been concluded that the stretching of Mozzarella was more efficient than the pasteurization of milk in the reduction of Listeria monocytogenes inoculum and Mycobacterium fortuitum in about 2 logarithms of each agent.