O transtorno do espectro autista atinge uma em cada 150 crianças. Sua etiologia ainda é desconhecida, apesar de fortes evidências de fatores genéticos e recentes achados de interferências ambientais, particularmente a ativação imune materna durante a gestação. Em nossos estudos prévios expusemos ratas Wistar no início da gestação ao lipopolissacarídeo (LPS), que mimetiza uma infecção bacteriana (100 µg/kg, intraperitoneal [i.p.], no dia gestacional [GD] 9,5) e observamos prejuízos no comportamento de brincar da prole masculina. Sabendo que esse teste é classicamente usado para avaliação de modelos animais de autismo e da ligação do autismo com fatores ambientais, propusemos que nosso modelo seria um modelo animal de autismo. Para avaliar essa possibilidade, foi objetivo do presente trabalho estudar se nosso modelo de LPS pré-natal (100 µg/kg, i.p., no GD 9,5) causaria os outros sintomas típicos de autistas: anormalidades na comunicação (avaliado pelo teste da vocalização ultrassônica), comportamentos repetitivos e inflexibilidade cognitiva (teste de alternação espontânea no labirinto em T), ausência de demonstração de medo em situações potencialmente perigosas (estímulo olfativo aversivo do odor de gato) e hiperatividade (atividade geral em campo aberto). Visto que alguns autistas apresentam níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias e cortisol, bem como neuroinflamação, foram quantificados os níveis de IL-1β, TNF-α e corticosterona séricos, e estudado os astrócitos e micróglia do estriado e bulbo olfatório. Outro objetivo deste trabalho foi estudar os mecanismos centrais associados ao LPS pré-natal, especialmente o sistema dopaminérgico (expressão gênica e proteica de tirosina hidroxilase e receptores dopaminérgicos D1a e D2) do estriado e bulbo olfatório, baseado nos nossos achados prévios de redução de dopamina nessas regiões cerebrais. Também foram avaliados os níveis séricos de corticosterona, o desempenho reprodutivo e o tecido placentário nas mães expostas ao LPS durante a gestação. Por fim, sabendo que o autismo é mais prevalente em homens do que em mulheres, foram avaliadas também as fêmeas expostas pré-natalmente ao LPS: comportamento de brincar, interação social adulta e níveis séricos de corticosterona. A exposição pré-natal ao LPS prejudicou a comunicação, a cognição, a demonstração de medo em situações potencialmente perigosas, além de induzir comportamentos repetitivos/restritos e elevação dos níveis de IL-1β na prole masculina de ratas; as fêmeas não apresentaram os prejuízos observados nos machos. Esses achados sugerem fortemente que nosso modelo de LPS pré-natal induziu comportamentos do tipo autismo em ratos, corroborando com a hipótese dos fatores ambientais no autismo. Acrescenta de maneira inédita um modelo que mimetiza uma infecção bacteriana no início da gestação como indutor do autismo. Mais ainda, a redução da expressão proteica de tirosina hidroxilase estriatal causada pelo LPS pré-natal inclui a hipoatividade do sistema dopaminérgico estriatal como um possível aspecto para explicar o autismo. A elevação nos níveis de corticosterona, prejuízo no desempenho reprodutivo e danos no tecido placentário das ratas ajudaram no entendimento da gênese dos prejuízos na prole. O estabelecimento do modelo experimental de autismo com o LPS pré-natal significa um passo importante para o entendimento dessa desordem e pode auxiliar também na busca por eventuais tratamentos, baseados nas alterações neuroimunes encontradas. / One child in about 150 children has autism spectrum disorder. Despite strong evidence of genetic factors and recent findings of environmental interferences, particularly maternal immune activation during pregnancy, autism etiology is still unknown. In our previous study, we exposed Wistar rats in the beginning of the gestation to lipopolysaccharide (LPS, 100 µg/kg, intraperitoneally [i.p.], on gestational day [GD] 9.5), which mimics a bacterial infection and observed impairments in the play behavior of male offspring. Knowing that play behavior is classically used to evaluate autism animal models and the link between autism and environmental factors, we proposed that our model would be an autism animal model. To evaluate this possibility, the aim of this study was to know whether our prenatal LPS model (100 µg/kg, i.p., on GD 9.5) causes other autism typical symptoms: communication abnormalities (evaluated by the ultrasonic vocalization test), repetitive behavior and cognitive inflexibility (T-maze spontaneous alternation test), absence of fear demonstration in potentially dangerous situations (aversive exposure to cat odor test) and hyperactivity (open field general activity). Because some autistic patients presents high levels of proinflammatory cytokines and cortisol as well as neuroinflammation, we quantified IL-1β, TNF-α and corticosterone serum levels, and studied astrocytes and microglia of striatum and olfactory bulb. Another objective was to study the central mechanisms associated with prenatal LPS, particularly the dopaminergic system (gene and protein expression of tyrosine hydroxylase and dopamine D1a and D2 receptors) of striatum and olfactory bulb, based on our previous findings of reduced dopamine in these brain regions. We also evaluated the corticosterone serum levels, the reproductive performance and the placental tissue of mothers exposed to LPS during pregnancy. Finally, because autism is more prevalent in men than in women, we also evaluated females prenatally exposed to LPS: play behavior, social interaction and adult corticosterone serum levels. Prenatal LPS exposure impaired communication, cognition, fear demonstration of potentially dangerous situations, induced repetitive/restricted behaviors and elevated IL-1β levels of male offspring; females did not present the impairments observed in males. These findings strongly suggest that our model of prenatal LPS induced autism like behaviors in rats, corroborating the hypothesis of environmental factors in autism. It adds an unprecedented way a model that mimics a bacterial infection in early pregnancy as an inducer of autism. Moreover, the striatal tyrosine hydroxylase protein expression reduction caused by prenatal LPS includes hypoactivity of the striatal dopaminergic system as a possible aspect to explain autism. The increase in the corticosterone levels, impairment of reproductive performance and placental tissue injuries of dams helped in understanding the genesis of the offspring impairments. The importance of establishing an experimental model of autism with prenatal LPS is an extra step to better understand this disorder and may also help in the search for possible treatments, based on the observed neuroimmune changes.

A depressão é hoje a doença mental mais comum do mundo, afetando mais de 121 milhões de pessoas. Além disso, estima-se que em aproximadamente uma década ela se torne a 2º doença responsável pela perda prematura de vida entre todas as idades e sexos. Diferentes propostas foram feitas no intuito de se compreender os mecanismos pelos quais essa doença incide, contudo a etiologia dos transtornos depressivos ainda não é totalmente entendida. Existem consideráveis evidências de que a administração perinatal de lipopolissacarídeo (LPS), uma endotoxina bacteriana, promove efeitos persistentes no desenvolvimento e comportamento da prole de camundongos, os quais podem-se manter até a idade adulta. Ainda, esses eventos podem ter implicações evolucionárias ligadas a alterações transgeracionais. Tendo em vista que a ativação do sistema imune pode estar relacionada com os transtornos depressivos, o presente trabalho expos pré-natalmente ao LPS uma geração de camundongos avaliando os efeitos comportamentais dessa exposição em três gerações subsequentes levando-se em consideração os comportamentos depressivos e não depressivos de cada geração avaliada. Para isso camundongos fêmeas, após terem o comportamento selecionado pelo teste de suspensão da cauda (TSC), foram cruzadas com machos de mesmo comportamento recebendo 100g/kg de LPS ou solução salina no 15º dia de prenhez. Após os nascimentos, as gerações subsequentes tiveram o comportamento em questão avaliado pelo TSC, bem como a atividade geral em campo aberto. Além disso, a interação materno-filhote foi avaliada, uma vez que alterações na mesma poderiam contribuir para os efeitos do tratamento com a endotoxina. Ainda, foi-se realizado um desafio com LPS na geração filial 3, na qual o nível de citocinas e a expressão do comportamento doentio foram avaliadas. Os resultados mostraram que (i) a administração do LPS na geração parental não afetou o comportamento depressivo e não depressivo nas três gerações avaliadas, dado que animais com comportamento depressivo tiveram mais filhotes com o mesmo comportamento em todas as gerações. (ii) Foram observadas alterações no comportamento materno da geração parental, possivelmente ligadas a motivação materna desses animais. (iii) Foram encontradas alterações transgeracionais na atividade geral de camundongos machos e fêmeas das gerações filiais 1 e 2. Tais alterações foram mais x expressivas nos machos e, havendo diferenças entre o comportamento. Esses dados apontam que a exposição a endotoxina possui diferentes consequências de acordo com o comportamento e, (iv) os animais da geração filial 3 quando desafiados com a endotoxina apresentaram maior comportamento doentio e maiores níveis de citocinas. Esses dados apontam para um forte componente genético na transmissão do comportamento, além de, uma influencia epigenética na modulação do mesmo. Ainda, foi possível concluir que a inflamação gerada pela administração pré-natal do LPS atua de forma distinta entre os sexos, bem como o histórico comportamental, no caso, o comportamento depressivo e não depressivo estudados nesse trabalho / Depression disorders are to be considered the most common mental illness affecting more than 121 million people worldwide. It is estimated that approximately one decade it becomes the 2nd disease most responsible for premature loss of life of all ages and sexes. Different proposals to understand this disorders have been made in the past years, however its etiology it is still yet fully understood. There is considerable evidence that the administration of lipopolysaccharide (LPS), a bacterial endotoxin, promotes persistent effects on development and behavior of the offspring of mice, which are maintained into adulthood. Still, these events may have evolutionary implications related to transgenerational changes. Given that activation of the immune system may be related to depressive disorders, this study aimed to expose a generation of mice to LPS evaluating the behavioral effects on three subsequent generations taking into account the depressive-like and non depressive-like behaviors assessed on each generation by the tail suspension test (TST). For this, female mice after behavior selected by the tail suspension test (TST) were crossed with males of the same behavior and exposed to 100g/kg of LPS or saline solution on day 15th of pregnancy. After births, the subsequent generations were also evaluated on the TST and in the open field for general activity. In addition, the maternal interaction was also evaluated, since changes on this parameter could contribute to the treatment effects of the endotoxin. Yet, has been performed a challenge with LPS in the generation branch 3, wherein the level of expression of cytokines and sickness behavior were evaluated. The results showed that (i) the administration of LPS in the parental generation did not affect the depressive-like behaviors on the three generations evaluated, since animals with depressive-like and non depressive-like behavior had more offspring with the same behavior in all generations. (ii) Changes were observed in maternal behavior of the parental generation which is possibly related to a change in motivational state of those animals. (iii) Transgenerational alterations were found in the general activity of male and female mice of the filial generation 1 and 2. These changes were more significant in males and differences between depressive-like e non depressive-like behaviors were also observed. Together, these data indicate that the exposure to endotoxin has different consequences according to the animal historical behavior and, xii finally, (iv) the animals of filial generation 3 when challenged with endotoxin had higher sickness behavior and higher levels of cytokines when evaluated in the open field test. These data point to a strong genetic component in the transmission of behavior and, besides, a possible influence of epigenetic mechanism of the same. Furthermore it was possible to concluded that inflammation state created by the prenatal LPS exposure acts differently according to the animal historical behavior, in this case, the depressive-like and non depressive-like behavior studied, and also acting differently according to the sexes

Die Arbeit sollte klären, ob die pulmonalprotektiven Effekte von AT III bei LPS-induziertem ARDS auch auf einer Stimulation der pulmonalvaskulären PGI2-Freisetzung beruhen. Die Freisetzung von Big ET-1 und ET-1 unter septischen Bedingungen sollte quantifiziert sowie mögliche Effekte von AT III auf diese Freisetzung untersucht werden. Dabei wurde das Modell der isolierten Rattenlunge verwendet. Die Perfusion der Lunge mit LPS führte zu einer Steigerung der Kon-zentration von 6-Keto-PGF1(, dem stabilen Metaboliten von PGI2, auf das 1,6fache und der Konzentration von TxB2, dem stabilen Metaboliten von TxA2, auf das 2,9fache gegenüber der Kontrollgruppe. Die Konzentration von ET-1 erhöhte sich unter LPS auf das 1,6fache, während der Big ET-1 Spiegel konstant blieb. Die Gabe von AT III hatte keinen Effekt auf die Freisetzung von PGI2 und TxA2. Die kombinierte Gabe von LPS und AT III wirkte ebenso wie die Gabe von LPS allein. Die Konzentrationen von Big ET-1 und ET-1 erhöhten sich unter 2 U/ml AT III auf das 1,7- bzw. 1,2fache und unter 5 U/ml AT III auf das 1,6- bzw. 1,3fache gegen-über den Kontrollen. Die kombinierte Gabe von LPS und AT III führte zu einem signifikant höheren Big ET-1-Spiegel vom 2,6fachen des Basalwertes, während sich die Konzentration von ET-1 nicht von der unter LPS bzw. AT III allein unterschied. Die Gabe von Cicaprost, einem stabilen synthetischen PGI2-Analogon, beeinflußte weder die basale noch die durch 2 U/ml AT III und 50 µg/ml LPS stimulierte Big-ET-1- und ET-1-Freisetzung. Nicardipin, ein Blocker der L-Typ-Kalzium-Kanäle, Heparin und N-Acetyl-Heparin, ein nicht an AT III bindendes Heparin, antagonisierten jeweils den stimulierenden Effekt von AT III auf die Big-ET-1- und ET-1-Freisetzung komplett. Staurosporin, ein Proteinkinase C-Inhibitor und Genistein, ein Tyrosinkinase-Inhibitor hatten keinen Effekt auf die durch AT III stimulierte Big-ET-1- und ET-1-Freisetzung. SCHLUßFOLGERUNGEN: Das für den protektiven Effekt des AT III bei ARDS verantwortlich gemachte PGI2 scheint nichtpulmonalen Ursprungs zu sein. Eine PGI2-mediierte Hemmung der pulmonalen ET-1-Sekretion war nicht zu beobachten und scheint somit nicht am protektiven Effekt des AT III beim septischen ARDS beteiligt zu sein. Der beobachtete stimulierende Effekt des AT III auf die Freisetzung der pulmonalen Endotheline ist von möglicher pathophysiologischer Relevanz, da er die erwähnte protektive Wirkung des AT III mit hoher Wahrscheinlichkeit abschwächt. Dieser stimulierende Effekt des AT III scheint dabei an der intakten Rattenlunge weder von der Proteinkinase C noch von Tyrosinkinasen vermittelt zu sein. Weiterhin ist festzustellen, daß die stimulierende Wirkung des AT III auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big ET-1 und ET-1 von einem Kalziumeinstrom durch L-Typ-Kalzium-Kanäle und damit von der intrazellulären Kalziumkonzentration abhängig ist. Wie die gleiche Wirksamkeit von Heparin und N-Azetyl-Heparin zeigt, erfordert die Blockade des AT-III-Effektes durch die Heparine keine direkte Bindung an AT III, was auf die zusätzliche Rolle der intrazellulären Kalziumfreisetzung über IP3 hinweist. / The aim of the present study was to clarify if the pulmonary protective effects of AT III in LPS-induced ARDS can be attributed to a stimulation of the pulmonary vascular release of PGI2. The pulmonary vascular release of big ET-1 and ET-1 under septic conditions and the possible influence of AT III was to be investigated. To this end, we used the model of the isolated perfused rat lung. Exposure of the lung to LPS increased the release of 6-Keto-PGF1(, the stable metabolite of PGI2, 1.6fold and the production of TxB2, the stable metabolite of TxA2, 2.9fold compared with control lungs. The release of ET-1 increased 1.6fold under LPS, whereas the concentration of big ET-1 was unchanged. The application of AT III had no effect on the release of PGI2 and TxA2. The effects following combined application of LPS and AT III were similar to the effects of LPS alone. Compared with controls, AT III, at 2 U/ml, increased the perfusate levels of big ET-1 and ET-1 1.7fold and 1.2fold, respectively; the administration of 5 U/ml AT III raised big ET-1 and ET-1 1.6fold and 1.3fold, respectively. Combined application of LPS and AT III resulted in a 2.6fold rise of big ET-1 levels compared with controls, whereas concentrations of ET-1 did not differ from those in the presence of LPS or AT III alone. Cicaprost, a stable PGI2 analogue, affected neither the basal nor the AT III plus LPS-stimulated release of big ET-1 and ET-1. Nicardipin, an L-type calcium channel blocker, heparin and N-acetyl heparin, a heparin derivative devoid of AT III affinity, each antagonized completely the AT III-stimulated increase in big ET-1 and ET-1 levels. Staurosporin, an inhibitor of protein kinase C, and genistein, an inhibitor of tyrosine kinases, did not influence the AT III effects on endothelins. CONCLUSIONS: In ARDS, the well-known rise in plasma PGI2 in response to AT III obviously originates from non-pulmonary sources. PGI2 does not suppress the pulmonary ET-1 secretion; therefore, this mechanism seems not involved in the AT III-induced lung protection during septic ARDS. The AT III-mediated stimulation of the release of pulmonary endothelins is of potential pathophysiological relevance, because it may blunt the protective effects of AT III in ARDS. In the intact rat lung, this stimulatory effect of AT III is mediated neither by protein kinase C nor by tyrosine kinases. Moreover, the observed effect of AT III on pulmonary endothelins is based on calcium influx through L-type calcium channels and depends on the intracellular calcium activity. The equipotency of heparin and N-acetyl heparin in inhibiting the AT III action demonstrates that direct binding of AT III is not essential for the blocking effect of heparins. This fact points to additional involvement of an IP3-dependent intracellular calcium release.

Foi investigada a utilização de Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas (SMDFA) para remoção de lipolissacarídeos (LPS) de preparações contendo proteínas recombinantes de interesse farmacêutico, como a proteína verde fluorescente (GFPuv). Os SMDFA são constituídos por soluções de tensoativos contendo micelas e oferecem ambientes hidrofóbico e hidrofílico, que possibilitam seletividade na partição de biomoléculas de acordo com sua hidrofobicidade, permitindo a remoção de LPS contaminante. Neste trabalho, foi realizada a implementação do método para a quantificação de LPS em amostras contaminadas e a obtenção de LPS e GFPuv puros a partir de cultivo de E. coli recombinante. Além disso, foi estudada a influência do Triton X-114 na metodologia de quantificação de LPS, e a adição de MgSO4, CaCl2, KI e (NH4)2SO4 na partição de GFPuv e LPS puros em SMDFA. E ainda, realizou-se um planejamento experimental (22) para avaliar os maiores KGFPuv e %RECGFPuv. O homogeneizado celular de E. coli foi testado nas melhores condições obtidas com o planejamento experimental. E finalmente, o processo por cromatografia de afinidade por íons metálicos (IMAC) foi empregado para investigar a adsorção de LPS em matriz IDA-Ca2+. Conforme os resultados obtidos, o TX-114 causou elevada interferência no método cinético cromogênico, em função da similaridade desta molécula com os LPS. Os LPS apresentaram partição preferencial para a fase concentrada em micelas, com altos valores de remoção, %REMLPS>98,0%. Ao contrário, a GFPuv foi recuperada preferencialmente na fase diluída, na qual existe maior volume disponível, resultando em valores de KGFPuv>1. A adição de sais ocasionou diminuição nos valores KGFPuv, provavelmente por causa da carga negativa que GFPuv adquiriu nas condições avaliadas. Os resultados do planejamento experimental mostraram que a melhor condição de partição obtida foi na região do ponto central, 4,0% (p/p) a 60,0°C, com KGFPuv>10. O processo por IMAC apresentou as maiores capacidades de adsorção de LPS-IDA-Ca+2 nas condições de menor pH e maior força iônica 4,0 e 1,0 mol/L, respectivamente. O processo de purificação por SMDFA empregado para a remoção de LPS contaminante presente em meio fermentado contendo GFPuv, demonstrou ser eficiente em recuperar a biomolécula-alvo na fase diluída e separar o principal contaminante na fase rica em micelas. Portanto, pode ser empregado como primeira etapa para a remoção de altas concentrações de LPS na purificação de proteínas hidrofílicas como a GFPuv. / The Aqueous Two-Phase Micellar System (ATPMS) was investigated for endotoxin (LPS) removal from preparations containing recombinant proteins of pharmaceutical interest, such as the green fluorescent protein (GFPuv). These systems usually consist of micellar surfactants solutions and offer both hydrophobic and hydrophilic environments, providing selectivity to the biomolecules partitioning according to its hydrophobicity. In this work, the implementation of the method for LPS quantification in contaminated samples was accomplished, as well as the obtaining of pure LPS and GFPuv from recombinant E. coli. Furthermore, the influence of Triton X-114 in the methodology for LPS quantification was studied, as the addition of MgSO4, CaCl2, KI, and (NH4)2SO4 into the partition of pure GFPuv and LPS in ATPMS. In addition, a statistical design (22) was carried out to evaluate the highest KGFPuv and %RECGFPuv. The E. coli cell lysate was tested under optimum conditions obtained with the statistical design. And, finally, the process by ionmetal affinity chromatography (IMAC) was used to investigate the adsorption of LPS in IDA-Ca2+ matrix. The results showed that the TX-114 caused high interference in the kinetic chromogenic method, according to the similarity of this molecule to LPS. The LPS showed preferential partitioning to the micellerich phase, with high values of removal, %REMLPS>98.0%. In the other hand, the GFPuv was preferentially recovered in the micelle-poor phase, in which there is greater volume available resulting in values of KGFPuv>1. The addition of salts caused a reduction in the values KGFPuv, probably because of the negative charge that the GFPuv acquired at the conditions evaluated. The results of the statistical design showed that the best partitioning condition obtained was in the central point region, 4.0% (wt/wt) at 60.0°C, with KGFPuv>10. The process by IMAC showed the highest adsorption of LPS-IDA-Ca+2 capacities at the conditions of lower pH and higher ionic strength 4.0 and 1.0 mol/L, respectively. The purification process for the LPS contaminant removal from E. coli fermentation containing GFPuv by ATPMS proved to be efficient in the recovering of target biomolecule in the micelle-poor phase, and separating the main contaminant in the micelle-rich phase. Furthermore, this system can be exploited as the first step for removal of higher LPS concentrations from hydrophilics protein purification.

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico de origem natural ou antropogênica, encontrada em grandes concentrações no cigarro, além de ser produto da biotransformação do benzeno. Nosso grupo de pesquisa tem demonstrado que a exposição à HQ compromete a resposta inflamatória in vivo. Dando continuidade a estas investigações, este trabalho visou investigar os efeitos da exposição in vivo à HQ sobre funções do tecido traqueal e atividades de macrófagos alveolares. Para tanto, camundongos Swiss machos foram expostos à HQ 25ppm (1,5mg/60mL/1h; 5 dias) ou veículo (solução salina etanol 1:20) por via sistêmica (nebulização). Concentrações de mediadores inflamatórios (interleucina (IL) 1β, IL-6, IL-10, IL-4, IL-12 fator de necrose tumoral-α (TNF-α) ou proteína quimiotáxica de monócitos (MCP-1); ensaio imunoenzimático (ELISA) e óxido nítrico (NO; reação de Griess) foram quantificados no lavado bronco-alveolar (LBA) em condições basais ou 3 horas após estímulo inflamatório (LPS in vivo; 100µL/mL; 10min) e no sobrenadante de macrófagos (MΦs) alveolares ou de cultura da traquéia obtidos dos animais e posteriormente estimulados in vitro (MΦs: 5µg/mL de LPS + 10ng/mL de IFN-γ; traquéia: 1µg/mL de LPS; 24h). Atividades fagocítica e fungicida (microscopia óptica) e a expressão de receptores envolvidos na fagocitose toll-like receptor (TLR, TLR-2, TLR4 e dectina-1; citometria de fluxo) foram determinadas após incubação in vitro de MΦs alveolares com o fungo Candida albicans e a expressão protéica de MyD88 foi realizada em MΦs alveolares (western blot). Quantificação do RNAm para MCP-1 (reação da transcriptase reversa em cadeia de polimerase, RT-PCR) foi realizada em tecido traqueal e células de linhagem monocítica humana THP-1 foram empregadas em ensaios de quimiotaxia in vitro (Câmara de Boyden) frente a diferentes concentrações de MCP-1. Reatividade do tecido traqueal foi quantificada frente à metacolina. Os resultados obtidos mostraram que a exposição in vivo à HQ reduziu a concentração de MCP-1 (54,98% vs. controle LPS) e IL-12 (51,45% vs. controle LPS) no LBA após inflamação; reduziu a secreção de MCP-1 por MΦs (basal: 87,96%; LPS+INF-γ: 61,20%) e tecido traqueal em cultura (79,77% vs. controle LPS). Neste último tecido, a diminuição foi dependente da menor expressão gênica. Concentrações de MCP-1 semelhantes à detectada no sobrenadante de cultura de traquéia de animais expostos à HQ induziram migração de células THP-1 menor (38,2%) que à provocada pela concentração de MCP-1 no sobrenadante da cultura traquéia de animais controles. Traquéias de animais expostos à HQ apresentaram hiperreatividade (193,48%), a qual foi revertida pela remoção do epitélio traqueal. Adicionalmente, cultura de MΦs obtidos de animais expostos à HQ apresentaram maior atividade fagocítica (porcentagem de fagocitose: 36,30%; índice de fagocitose: 83,97%) e fungicida (68,47%), que não foram dependentes de alterações nos receptores TLR2, TLR4 e dectina-1, mas podem ser decorrentes da menor expressão protéica de MyD88. Em conjunto, os dados obtidos apontam para alterações importantes resultantes da exposição in vivo à HQ sobre funções de MΦs alveolares e do tecido traqueal que, em conjunto, podem ser determinantes para a toxicidade observada nestes animais que culmina com prejuízo na defesa do organismo. / Hydroquinone (HQ) is a phenolic compound of natural or anthropogenic source, also found in high concentrations in cigarette, as well as benzene´s metabolite. Our research group has demonstrated that exposure to HQ impairs in vivo inflammatory response. Following these investigations, this work aimed to study the effects of in vivo exposure to HQ on tracheal tissue and alveolar macrophages (MΦs) activities. For this purpose, male Swiss mice were systemically (aerolised) exposed to 25ppm HQ (1.5 mg/60mL/1h; 5 days) or vehicle (saline ethanol solution, 1:20). Concentrations of inflammatory mediators (interleukin (IL) IL-1β, IL- 6, IL-10, IL-4, IL-12 tumor necrosis factor-α (TNF-α ) or monocyte chemoattractant protein (MCP-1); (enzyme immune assay, ELISA)) and nitric oxide (NO; Griess reaction) were quantified in bronchoalveolar lavage (BAL) at baseline or 3 hours after inflammatory stimulus (in vivo LPS, 100µL/mL; 10min); in the supernatant of cultured alveolar macrophages (MΦs) or trachea obtained from animals and subsequently in vitro stimulated (MΦs: 5µg/mL of LPS plus 10ng/mL IFN-γ; trachea: 1µg/mL LPS; 24 hours). Phagocytic and fungicidal activities (light microscopy) and expression of receptors involved in phagocytosis (toll-like receptor (TLR, TLR2, TLR4 and dectin-1, flow cytometry) were determined after in vitro incubation of alveolar MΦs with Candida albicans fungus and expression of MyD88 pathway was held in alveolar MΦs (western blot). Quantification of mRNA for MCP-1 (reaction of reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) was performed in tracheal tissue and cells human monocytic THP-1 were used in in vitro chemotaxis assays (Boyden chamber) using different concentrations of MCP-1. Tracheal reactivity was measured in response to methacholine. The results showed that in vivo HQ exposure reduced the concentration of MCP-1 (54.98% vs. control) and IL-12 (51.45% vs. control) in the BAL after inflammation; decreased secretion of MCP-1 by MΦs (basal: 87.96%, LPS+INF-γ: 61.20%) and in tracheal culture after LPS stimulation (79.77% vs. control). In the latter tissue, the MCP-1 protein content was dependent on impaired gene expression. Concentrations of MCP-1 similar to those detected in the supernatant of tracheal from HQ exposed rats induced smaller migration of THP-1 cells (38.2%) than that evoked by the MCP-1 concentration obtained in trachea supernatants collected from control animals. Tracheas from HQ exposed rats showed hyper reactivity (193.48%), which was reversed by removal of the tracheal epithelium. Additionally, culture of MΦs obtained from HQ exposed rats showed increased phagocytic (percentage of phagocytosis: 36.30%; phagocytosis index: 83.97%) and fungicide activity (68.47%), which were not dependent on changes in the receptors TLR2, TLR4 and dectin-1, but could be due to reduced MyD88 expression. Together, these data point out important alterations on MΦs and trachea after in vivo HQ exposure, which may be crucial for the toxicity observed in these animals that culminates with impaired host defense.

Lipopolissacarídeos (LPS) de L. interrogans, S. enterica e B. pertussis foram extraídos e as subfrações monofosforil lipídeo A (MPLA) preparadas por hidrólise. O LPS é responsável por forte resposta imunológica e endotóxica em mamíferos, enquanto o MPLA apresenta baixa endotoxicidade e boa capacidade imunomoduladora. Estudamos a atividade adjuvante de LPS e de MPLA em formulações com antígenos LigA ou OmpA contra leptospirose. Testes de imunização e desafio em hamsters confirmaram alta atividade imunoprotetora de LigA e capacidade adjuvante do MPLA de salmonela e de LPS de leptospiras, mas as formulações não foram capazes de bloquear a colonização renal na leptospirose. Os resultados sugerem diferenças na imunidade protetora sistêmica da imunidade protetora renal. / Lipopolysaccharides (LPS) of L. interrogans, S. enterica and B. pertussis were extracted and the subfraction monophosphoril lipid A (MPLA) prepared by hydrolysis. The LPS is responsible for immunological response and endotoxicity in mammallians, while MPLA has reduced endotoxic activity, but maintain the immunomodulatory capacity. We studied the adjuvant capacity of LPS and MPLA in formulations with LigA or OmpA antigens against leptospirosis. Tests of immunization and challenge in hamsters confirmed the high immune protection activity of LigA and adjuvant capacity of MPLA of salmonela and LPS of lepstopiras, however formulations did not block the renal colonization. The results suggest that there are differences in the systemic immune protection from the kidney immune protection.

O transtorno do espectro autista atinge uma em cada 150 crianças. Sua etiologia ainda é desconhecida, apesar de fortes evidências de fatores genéticos e recentes achados de interferências ambientais, particularmente a ativação imune materna durante a gestação. Em nossos estudos prévios expusemos ratas Wistar no início da gestação ao lipopolissacarídeo (LPS), que mimetiza uma infecção bacteriana (100 µg/kg, intraperitoneal [i.p.], no dia gestacional [GD] 9,5) e observamos prejuízos no comportamento de brincar da prole masculina. Sabendo que esse teste é classicamente usado para avaliação de modelos animais de autismo e da ligação do autismo com fatores ambientais, propusemos que nosso modelo seria um modelo animal de autismo. Para avaliar essa possibilidade, foi objetivo do presente trabalho estudar se nosso modelo de LPS pré-natal (100 µg/kg, i.p., no GD 9,5) causaria os outros sintomas típicos de autistas: anormalidades na comunicação (avaliado pelo teste da vocalização ultrassônica), comportamentos repetitivos e inflexibilidade cognitiva (teste de alternação espontânea no labirinto em T), ausência de demonstração de medo em situações potencialmente perigosas (estímulo olfativo aversivo do odor de gato) e hiperatividade (atividade geral em campo aberto). Visto que alguns autistas apresentam níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias e cortisol, bem como neuroinflamação, foram quantificados os níveis de IL-1β, TNF-α e corticosterona séricos, e estudado os astrócitos e micróglia do estriado e bulbo olfatório. Outro objetivo deste trabalho foi estudar os mecanismos centrais associados ao LPS pré-natal, especialmente o sistema dopaminérgico (expressão gênica e proteica de tirosina hidroxilase e receptores dopaminérgicos D1a e D2) do estriado e bulbo olfatório, baseado nos nossos achados prévios de redução de dopamina nessas regiões cerebrais. Também foram avaliados os níveis séricos de corticosterona, o desempenho reprodutivo e o tecido placentário nas mães expostas ao LPS durante a gestação. Por fim, sabendo que o autismo é mais prevalente em homens do que em mulheres, foram avaliadas também as fêmeas expostas pré-natalmente ao LPS: comportamento de brincar, interação social adulta e níveis séricos de corticosterona. A exposição pré-natal ao LPS prejudicou a comunicação, a cognição, a demonstração de medo em situações potencialmente perigosas, além de induzir comportamentos repetitivos/restritos e elevação dos níveis de IL-1β na prole masculina de ratas; as fêmeas não apresentaram os prejuízos observados nos machos. Esses achados sugerem fortemente que nosso modelo de LPS pré-natal induziu comportamentos do tipo autismo em ratos, corroborando com a hipótese dos fatores ambientais no autismo. Acrescenta de maneira inédita um modelo que mimetiza uma infecção bacteriana no início da gestação como indutor do autismo. Mais ainda, a redução da expressão proteica de tirosina hidroxilase estriatal causada pelo LPS pré-natal inclui a hipoatividade do sistema dopaminérgico estriatal como um possível aspecto para explicar o autismo. A elevação nos níveis de corticosterona, prejuízo no desempenho reprodutivo e danos no tecido placentário das ratas ajudaram no entendimento da gênese dos prejuízos na prole. O estabelecimento do modelo experimental de autismo com o LPS pré-natal significa um passo importante para o entendimento dessa desordem e pode auxiliar também na busca por eventuais tratamentos, baseados nas alterações neuroimunes encontradas. / One child in about 150 children has autism spectrum disorder. Despite strong evidence of genetic factors and recent findings of environmental interferences, particularly maternal immune activation during pregnancy, autism etiology is still unknown. In our previous study, we exposed Wistar rats in the beginning of the gestation to lipopolysaccharide (LPS, 100 µg/kg, intraperitoneally [i.p.], on gestational day [GD] 9.5), which mimics a bacterial infection and observed impairments in the play behavior of male offspring. Knowing that play behavior is classically used to evaluate autism animal models and the link between autism and environmental factors, we proposed that our model would be an autism animal model. To evaluate this possibility, the aim of this study was to know whether our prenatal LPS model (100 µg/kg, i.p., on GD 9.5) causes other autism typical symptoms: communication abnormalities (evaluated by the ultrasonic vocalization test), repetitive behavior and cognitive inflexibility (T-maze spontaneous alternation test), absence of fear demonstration in potentially dangerous situations (aversive exposure to cat odor test) and hyperactivity (open field general activity). Because some autistic patients presents high levels of proinflammatory cytokines and cortisol as well as neuroinflammation, we quantified IL-1β, TNF-α and corticosterone serum levels, and studied astrocytes and microglia of striatum and olfactory bulb. Another objective was to study the central mechanisms associated with prenatal LPS, particularly the dopaminergic system (gene and protein expression of tyrosine hydroxylase and dopamine D1a and D2 receptors) of striatum and olfactory bulb, based on our previous findings of reduced dopamine in these brain regions. We also evaluated the corticosterone serum levels, the reproductive performance and the placental tissue of mothers exposed to LPS during pregnancy. Finally, because autism is more prevalent in men than in women, we also evaluated females prenatally exposed to LPS: play behavior, social interaction and adult corticosterone serum levels. Prenatal LPS exposure impaired communication, cognition, fear demonstration of potentially dangerous situations, induced repetitive/restricted behaviors and elevated IL-1β levels of male offspring; females did not present the impairments observed in males. These findings strongly suggest that our model of prenatal LPS induced autism like behaviors in rats, corroborating the hypothesis of environmental factors in autism. It adds an unprecedented way a model that mimics a bacterial infection in early pregnancy as an inducer of autism. Moreover, the striatal tyrosine hydroxylase protein expression reduction caused by prenatal LPS includes hypoactivity of the striatal dopaminergic system as a possible aspect to explain autism. The increase in the corticosterone levels, impairment of reproductive performance and placental tissue injuries of dams helped in understanding the genesis of the offspring impairments. The importance of establishing an experimental model of autism with prenatal LPS is an extra step to better understand this disorder and may also help in the search for possible treatments, based on the observed neuroimmune changes.

A cavidade peritoneal de camundongos abriga uma variedade de células do sistema imune. Inicialmente, devido as limitações metodológicas, acreditava-se que, aproximadamente, 90% das células peritoneais era representada por macrófagos. Em seguida, graças aos extensos estudos com células peritoneais, observou-se que, além dos macrófagos, o peritônio abrigava muitos linfócitos B, principalmente do subtipo B-1. Utilizando metodologias contemporâneas de FACS - citometria de fluxo, este trabalho mostra que, aproximadamente, 30% das células peritoneais são macrófagos, 55% são linfócitos B-1, dos quais 40% pertencem ao subtipo B-1a e 15% ao subtipo B-1b. Os 15%-20% restantes representam outros subtipos celulares, como linfócitos T, linfócitos B-2, linfócitos NK, eosinófilos, além da presença de outras populações de células que não foram possíveis de ser identificadas com os marcadores de superfície utilizados neste trabalho. Em contraste com a literatura, nossos estudos mostraram que os macrófagos da cavidade peritoneal de camundongos representam uma população heterogênea. Por meio da co-expressão de CD11b e F4/80, foi possível descrever dois subtipos funcionais de macrófagos, denominados aqui de PM-1 (CD11bhigh, F4/80high) e PM-2 (F4/8010W, CD11bint). As células PM-2 encontram-se em menor abundância (-10% do total de macrófagos) no peritônio não estimulado e, diferentemente de células PM-1, espraiam-se de forma alongada (bipolar) quando colocadas em cultura. Curiosamente, PM-2 são os únicos macrófagos peritoneais que expressam MHC-II e, ainda, 30% dessa população expressa CD11c, o marcador típico de células dendríticas. Já as células PM-1 possuem morfologia arredondada, estão em abundância no peritônio e produzem altas doses de NO após estímulo com LPS. Ambas as células são capazes de fagocitar bactérias in vivo, no entanto, as células PM-2 parecem mais eficientes, sendo capazes de internalizar quantidades maiores de bactérias. Após infecção in vivo, o número absoluto e a porcentagem de PM-2 aumenta muito no peritônio, chegando a representar metade dos fagócitos da cavidade peritoneal. Os macrófagos PM-1 e PM-2 parecem não representar monócitos já que não compartilham do fenótipo de monócitos presentes no sangue periférico. Deve-se ressaltar que, além das células PM-1 e PM-2, outras subpopulações do peritônio também expressam CD11b e F4/80. Com base na literatura atual, acredita-se que todas as células B-1 do peritônio expressam CD11b, uma molécula que é co-expressa com CD18 para formar o receptor de complemento e a molécula de adesão Mac-1. Entretanto, os estudos, apresentados neste trabalho, mostram que metade de cada subtipo de B-1 (B-1a e B-1b) não expressa CD11b. As células B-1 CD11b+ são maiores, mais granulosas e expressam quantidades maiores de IgM de superfície. As células CD11b+ possuem uma curiosa tendência de se juntar e formar duplas (doublets) fortemente ligadas entre si que estão presentes em abundância no peritônio de camundongos adultos. Além de ligarem entre si, as células B-1 podem formar duplas com macrófagos PM-1 e PM-2. Durante a ontogenia, as células CD11b- surgem primeiro no peritônio e são as progenitoras das células B-1 CD11b+. Após estímulo inflamatório (LPS í. v.) os linfócitos B-1 CD11b+ migram do peritônio para o baço, onde proliferam e transformam-se em células secretoras de anticorpos (plasmócitos). No peritônio, as células B-1 não são capazes de se diferenciar em plasmócitos (células CD138high). Os resultados apresentados aqui mostraram que, diferentemente dos macrófagos PM-2, os PM-1 são os responsáveis por inibir a formação de células secretoras de anticorpos derivadas de B-1. Em suma, nossos dados sugerem que, mediante estímulo inflamatório, as células B-1 maduras (CD11b+) migram do peritônio para o baço, afastandose de macrófagos PM-1. Já no baço, as células B-1 encontram um micro-ambiente favorável para se proliferarem e diferenciarem-se em plasmócitos, secretando a maioria dos anticorpos naturais vistos logo nas primeiras horas pós-estímulo. / Mouse peritoneal cavity (PerC) represents the source for a variety of cellular subsets of the immune system. In early studies, marred by Iimited methodological tools, it was thought that macrophages comprise roughly 90% of total PerC cells. Shortly thereafter, it was recognized that, beside macrophages, the mouse peritoneal cavity shelters large amount of B-lymphocytes, specially the B-1 subset. In essence, by applying contemporary technology, studies presented here show that, roughly 30% of PerC cells comprise macrophages, 55% comprise B-1 cells, which 40% represents the B-1 a subset and roughly 15% are B-1b cells. The remaining 15%-20% of PerC cells comprise a variety of known immune cells, including B-2, T, NK and eosinophils. In addition, there were some other cellular subsets that could not be identified in these studies, probably due to limited cell surface molecules analyzed. Surprisingly, the data presented here show that peritoneal macrophages represent a highly heterogeneous population. Based on the co-expression of both CD11b and F4/80, we have identified two functionally distinct subsets of peritoneal macrophages, named here as PM-1 (CD11bhigh, F480high) and PM-2 (CD11bint, F4/80low). PM-2 are less abundant (-10% within total macrophages) in the PerC of unstimulated mouse, however, unlike PM-1, these cells are able to spread in spindle (bipolar) morphology upon sorting and in vitro culture. Curiously, PM-2 is the only PerC macrophage that expresses surface MHC-II. In addition, one third of PM-2 population expresses CD11c, a universal marker for dendritic cells. In turn, PM-1 cells are round shaped cells, represent the majority of PerC macrophages (-90%) and secrete high amounts of NO upon LPS stimulation. In vivo phagocytosis assay revealed that both cells could internalize bacteria, however, PM-2 cells showed to be more efficient, in that it was able to phagocyte higher amounts of bacteria when compared to PM-1. After i.p. in vivo stimulation, the absolute number and percentage of PM-2 cells increase drastically in the peritoneum, reaching almost half of the total PerC macrophages. Importantly, PM-1 and PM-2 macrophages seem not to represent PerC monocytes since it does not share any of the phenotype expressed by blood monocytes. Interestingly, in addition to PM-1 and PM-2, some other cellular subsets in the PerC, such as eosinophils, are able to express CD11b and F4/80. PerC B-1 cells have long been known to express CD11b, which is co-expressed with CD18 to form the Mac-1/CR3 complement receptor and adhesion molecule. However, although all PerC B-1 cells are commonly believed to express CD11b, we show here that nearly half of the cells in each of the PerC B-1 subsets (B-1a and B-1b) do not express this surface receptor. The CD11b+ cells in each B-1 subset are larger, more granular and express higher levels of surface IgM than the CD11b- B-1 cells. Surprisingly, the CD11b+ B-1 subset has the curious tendency to initiate the formation of tightly associated doublets that are present at high frequency in adult PerC. In addition to binding to each other, B-1 cells can also form doublets with PM-1 and PM-2. During ontogeny, CD11b- B-1 cells arise earlier in the mouse PerC and are the progenitors of CD11b+ B-1 cells. Upon LPS stimulation, PerC CD11b+ B-1 cells migrate to the spleen where they proliferate and differentiate into antibody-secreting cells (plasma cells). Within the PerC, B-1 cells are not able to differentiate into plasma cells (CD138high cells). The data shown in here reveal that, unlike PM-2, PM-1 macrophages are the cellular subset responsible for inhibiting the formation of B-1-derived antibody-secreting cells. Altogether, our data suggest that, upon inflammatory stimuli, mature CD11b+ B-1 cells migrate from the PerC to the spleen, avoiding the inhibitory effect of PM-1 cells. In the spleen, B-1 cells find an appropriate environment to proliferate and terminally differentiate into antibody-secreting cells, thus, secreting the majority of immunoglobulin seen in few hours after in vivo stimulation.

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico encontrado em grandes quantidades no cigarro, em medicamentos e alimentos, além de ser um dos mais importantes metabólitos tóxicos do benzeno (BZ). Temos mostrado que a exposição sistêmica à HQ compromete a resposta inflamatória in vivo. Complementando estas investigações, o objetivo do presente projeto foi investigar o efeito da exposição ambiental à HQ sobre o recrutamento leucocitário para o pulmão induzido pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS) e sobre os eventos celulares envolvidos neste processo, bem como sobre a formação de adutos de DNA no tecido pulmonar. Para tanto, 12,5, 25 ou 50 ppm de HQ ou veículo (solução salina 5% de etanol) foram nebulizadas em caixa de exposição (60 mL/1h; 5 dias) onde 5 camundongos Swiss machos estavam alocados. Uma hora após as últimas exposições, a inflamação pulmonar foi induzida pela inalação de LPS (0,1 mg/mL; 10 min). Os animais expostos à HQ e na vigência ou ausência de inflamação foram empregados para: 1) coleta do lavado broncoalveolar (LBA) três horas após a inalação de LPS para quantificação do número de leucócitos (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico®); 2) coleta de sangue para quantificação do número de leucócitos circulantes antes e 3 horas após a inalação de LPS (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico®); para a quantificação da expressão de moléculas de adesão em leucócitos de animais não inflamados induzida ou não pelo formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) in vitro (citometria de fluxo); para obtenção de plasma para quantificação de malonaldeído (HPLC) e de neutrófilos para quantificação de espécies reativas de oxigênio intracelular (EROs; citometria de fluxo) de animais não inflamados pelo LPS; 3) coleta de tecido pulmonar para quantificação da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais e para quantificação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) 3 horas após a inalação de LPS e para quantificação de adutos de DNA em tecido de animais não inflamados. Adicionalmente, a concentração de HQ na caixa de exposição foi quantificada por HPLC. Os resultados obtidos mostraram que a exposição à HQ não afetou os números de leucócitos circulantes, mas reduziu o número de leucócitos polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) no LBA; aumentou a atividade de MPO no tecido pulmonar; reduziu a expressão de L-selectina em PMN estimulados in vitro pelo fMLP; aumentou a expressão de β2 integrinas em PMN na vigência ou ausência (basal) de estimulação pelo fMLP; aumentou a expressão de β3 integrinas e PECAM-1 em condições basais; aumentou a formação de EROs por PMN; não alterou a expressão das moléculas de adesão endoteliais PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, JAM-C, P e Eselectinas e VE-Caderina; não aumentou significantemente a formação de adutos 8-oxo-7,8-dihidro- 2\'-desoxiguanosina e 1,N2-propano-2\'-deoxiguanosina no tecido pulmonar; aumentou a concentração de malonaldeído plasmático. A saturação da concentração de HQ na caixa de exposição foi 10 vezes menor que as preconizadas para a exposição ocupacional pelas agências regulamentadoras, indicando que mesmo a baixas concentrações de exposição, a HQ prejudica a resposta do hospedeiro a um agente infeccioso. O mecanismo tóxico pode estar relacionado à ativação das células na circulação, dependente da produção de espécies reativas de oxigênio, e que a toxicidade pode não ser detectada na ausência de resposta do organismo ao trauma. / Hydroquinone (HQ) is a phenolic compound found in large quantities in cigarettes, medicines and food, besides it is one of the most important toxic metabolites of benzene (BZ). We have shown that systemic exposure impairs in vivo inflammatory response. Following these investigations, this work aimed to study the effects of environmental exposure to HQ on leukocyte recruitment to the inflamed lung induced by lipolissacarideo of E. coli (LPS), the cell events involved in this process, and adducts formation on DNA of pulmonary tissue cells . For that 12.5, 25, or 50 ppm of HQ or vehicle (saline solution with 5% of ethanol) we aerosolized into an exposure box (60 mL/1h; 5 days) containing 5 male Swiss mice. One hour after the last exposures, the pulmonary inflammation was induced by LPS inhalation (0.1 mg/mL; 10 min). Animals exposed to HQ in presence or absence of inflammation were used for: 1) BAL collection three hours after LPS inhalation to quantify the leukocytes in BAL (Neubauer chamber and Panótico® stained smears); 2) blood collection to quantify the circulating leukocytes before and three hours after LPS inhalation (Neubauer chamber and Panótico® stained smears); to quantify the expression of adhesion moleculas in leukocytes from non-inflamed animals induced or not for formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) in vitro (flow citometry); to obtain blood plasma and quantify the formation of malondialdehyde (MDA; HPLC) and neutrophils to quantify the intracellular generation of reactive oxygen spices (ROS; flow citometry) from non-inflamed animals; 3) pulmonary tissue collection to quantify the expression oh adhesion molecules on endothelial cells and quantify the mieloperoxydase (MPO) activity, three hours after LPS inhalation and to quantify the DNA adducts on pulmonary tissue obtained from non-inflamed animals. Additionally, the concentration of HQ in the exposure box was quantified by HPLC. The results showed that exposure to HQ did not affect the numbers of circulating leukocytes, but reduced the number of polymorphonuclear leukocytes (PMN) and mononuclear (MN) in BAL, increased the activity of MPO in lung tissue; reduced the expression of L-selectin in PMN stimulated by fMLP in vitro, increased the expression of β2 integrins in PMN in the presence or absence (basal) stimulation by fMLP, increased the expression of β3 integrin and PECAM-1 in basal conditions; increased ROS formation by PMN, did not alter the expression of endothelial adhesion molecules PECAM-1, VCAM- 1, ICAM-1, JAM-C, P and E-selectin and VE-Cadherin; not significantly increased the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-desoxyguanosine e 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine adducts in lung tissue; increased the concentration of plasma malondialdehyde. The concentration of HQ into the exposure box was 10 times lower than those recommended for occupational exposure from regulatory agencies, indicating that even at low exposure concentrations, HQ affect the host response to an infectious agent. The toxic mechanism may be related to activation of circulating cells, dependent on the generation of reactive oxygen species, and toxicity can not be detected in the absence of body response to trauma.

A cavidade peritoneal de camundongos abriga uma variedade de células do sistema imune. Inicialmente, devido as limitações metodológicas, acreditava-se que, aproximadamente, 90% das células peritoneais era representada por macrófagos. Em seguida, graças aos extensos estudos com células peritoneais, observou-se que, além dos macrófagos, o peritônio abrigava muitos linfócitos B, principalmente do subtipo B-1. Utilizando metodologias contemporâneas de FACS - citometria de fluxo, este trabalho mostra que, aproximadamente, 30% das células peritoneais são macrófagos, 55% são linfócitos B-1, dos quais 40% pertencem ao subtipo B-1a e 15% ao subtipo B-1b. Os 15%-20% restantes representam outros subtipos celulares, como linfócitos T, linfócitos B-2, linfócitos NK, eosinófilos, além da presença de outras populações de células que não foram possíveis de ser identificadas com os marcadores de superfície utilizados neste trabalho. Em contraste com a literatura, nossos estudos mostraram que os macrófagos da cavidade peritoneal de camundongos representam uma população heterogênea. Por meio da co-expressão de CD11b e F4/80, foi possível descrever dois subtipos funcionais de macrófagos, denominados aqui de PM-1 (CD11bhigh, F4/80high) e PM-2 (F4/8010W, CD11bint). As células PM-2 encontram-se em menor abundância (-10% do total de macrófagos) no peritônio não estimulado e, diferentemente de células PM-1, espraiam-se de forma alongada (bipolar) quando colocadas em cultura. Curiosamente, PM-2 são os únicos macrófagos peritoneais que expressam MHC-II e, ainda, 30% dessa população expressa CD11c, o marcador típico de células dendríticas. Já as células PM-1 possuem morfologia arredondada, estão em abundância no peritônio e produzem altas doses de NO após estímulo com LPS. Ambas as células são capazes de fagocitar bactérias in vivo, no entanto, as células PM-2 parecem mais eficientes, sendo capazes de internalizar quantidades maiores de bactérias. Após infecção in vivo, o número absoluto e a porcentagem de PM-2 aumenta muito no peritônio, chegando a representar metade dos fagócitos da cavidade peritoneal. Os macrófagos PM-1 e PM-2 parecem não representar monócitos já que não compartilham do fenótipo de monócitos presentes no sangue periférico. Deve-se ressaltar que, além das células PM-1 e PM-2, outras subpopulações do peritônio também expressam CD11b e F4/80. Com base na literatura atual, acredita-se que todas as células B-1 do peritônio expressam CD11b, uma molécula que é co-expressa com CD18 para formar o receptor de complemento e a molécula de adesão Mac-1. Entretanto, os estudos, apresentados neste trabalho, mostram que metade de cada subtipo de B-1 (B-1a e B-1b) não expressa CD11b. As células B-1 CD11b+ são maiores, mais granulosas e expressam quantidades maiores de IgM de superfície. As células CD11b+ possuem uma curiosa tendência de se juntar e formar duplas (doublets) fortemente ligadas entre si que estão presentes em abundância no peritônio de camundongos adultos. Além de ligarem entre si, as células B-1 podem formar duplas com macrófagos PM-1 e PM-2. Durante a ontogenia, as células CD11b- surgem primeiro no peritônio e são as progenitoras das células B-1 CD11b+. Após estímulo inflamatório (LPS í. v.) os linfócitos B-1 CD11b+ migram do peritônio para o baço, onde proliferam e transformam-se em células secretoras de anticorpos (plasmócitos). No peritônio, as células B-1 não são capazes de se diferenciar em plasmócitos (células CD138high). Os resultados apresentados aqui mostraram que, diferentemente dos macrófagos PM-2, os PM-1 são os responsáveis por inibir a formação de células secretoras de anticorpos derivadas de B-1. Em suma, nossos dados sugerem que, mediante estímulo inflamatório, as células B-1 maduras (CD11b+) migram do peritônio para o baço, afastandose de macrófagos PM-1. Já no baço, as células B-1 encontram um micro-ambiente favorável para se proliferarem e diferenciarem-se em plasmócitos, secretando a maioria dos anticorpos naturais vistos logo nas primeiras horas pós-estímulo. / Mouse peritoneal cavity (PerC) represents the source for a variety of cellular subsets of the immune system. In early studies, marred by Iimited methodological tools, it was thought that macrophages comprise roughly 90% of total PerC cells. Shortly thereafter, it was recognized that, beside macrophages, the mouse peritoneal cavity shelters large amount of B-lymphocytes, specially the B-1 subset. In essence, by applying contemporary technology, studies presented here show that, roughly 30% of PerC cells comprise macrophages, 55% comprise B-1 cells, which 40% represents the B-1 a subset and roughly 15% are B-1b cells. The remaining 15%-20% of PerC cells comprise a variety of known immune cells, including B-2, T, NK and eosinophils. In addition, there were some other cellular subsets that could not be identified in these studies, probably due to limited cell surface molecules analyzed. Surprisingly, the data presented here show that peritoneal macrophages represent a highly heterogeneous population. Based on the co-expression of both CD11b and F4/80, we have identified two functionally distinct subsets of peritoneal macrophages, named here as PM-1 (CD11bhigh, F480high) and PM-2 (CD11bint, F4/80low). PM-2 are less abundant (-10% within total macrophages) in the PerC of unstimulated mouse, however, unlike PM-1, these cells are able to spread in spindle (bipolar) morphology upon sorting and in vitro culture. Curiously, PM-2 is the only PerC macrophage that expresses surface MHC-II. In addition, one third of PM-2 population expresses CD11c, a universal marker for dendritic cells. In turn, PM-1 cells are round shaped cells, represent the majority of PerC macrophages (-90%) and secrete high amounts of NO upon LPS stimulation. In vivo phagocytosis assay revealed that both cells could internalize bacteria, however, PM-2 cells showed to be more efficient, in that it was able to phagocyte higher amounts of bacteria when compared to PM-1. After i.p. in vivo stimulation, the absolute number and percentage of PM-2 cells increase drastically in the peritoneum, reaching almost half of the total PerC macrophages. Importantly, PM-1 and PM-2 macrophages seem not to represent PerC monocytes since it does not share any of the phenotype expressed by blood monocytes. Interestingly, in addition to PM-1 and PM-2, some other cellular subsets in the PerC, such as eosinophils, are able to express CD11b and F4/80. PerC B-1 cells have long been known to express CD11b, which is co-expressed with CD18 to form the Mac-1/CR3 complement receptor and adhesion molecule. However, although all PerC B-1 cells are commonly believed to express CD11b, we show here that nearly half of the cells in each of the PerC B-1 subsets (B-1a and B-1b) do not express this surface receptor. The CD11b+ cells in each B-1 subset are larger, more granular and express higher levels of surface IgM than the CD11b- B-1 cells. Surprisingly, the CD11b+ B-1 subset has the curious tendency to initiate the formation of tightly associated doublets that are present at high frequency in adult PerC. In addition to binding to each other, B-1 cells can also form doublets with PM-1 and PM-2. During ontogeny, CD11b- B-1 cells arise earlier in the mouse PerC and are the progenitors of CD11b+ B-1 cells. Upon LPS stimulation, PerC CD11b+ B-1 cells migrate to the spleen where they proliferate and differentiate into antibody-secreting cells (plasma cells). Within the PerC, B-1 cells are not able to differentiate into plasma cells (CD138high cells). The data shown in here reveal that, unlike PM-2, PM-1 macrophages are the cellular subset responsible for inhibiting the formation of B-1-derived antibody-secreting cells. Altogether, our data suggest that, upon inflammatory stimuli, mature CD11b+ B-1 cells migrate from the PerC to the spleen, avoiding the inhibitory effect of PM-1 cells. In the spleen, B-1 cells find an appropriate environment to proliferate and terminally differentiate into antibody-secreting cells, thus, secreting the majority of immunoglobulin seen in few hours after in vivo stimulation.