Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Glutaric acidemia type I (GA-I) is an inborn error of metabolism (EIM), characterized biochemically by major accumulation of glutaric acid (GA) and pathologically by a characteristic striatal degeneration. The clinical manifestations are mainly neurological and develop during childhood (up to 5 years old). Among these changes, there are the seizures and cognitive deficits, which may be precipitated by infectious processes. From this, the first hypothesis to be tested in this study was to investigate whether lipopolysaccharide E. coli 055 B5 serotype (LPS; 2 mg/Kg; i.p.), an inflammatory agent, could facilitate seizures induced by GA in young rats (21 days of life). For this, firstly it was determined the acute dose of intrastriatal GA (1.3 μmol/striatum) that cause behavioral and electroencephalographic (EEG) seizures in young rats. Moreover, it was shown that LPS administration 3 hours before GA intrastriatal injection did not change the seizures, but when LPS was administered 6 hours before the GA, it reduced the latency and increased the duration of behavioral and EEG seizures induced by GA in young rats. It also was observed that LPS injection caused an initial drop in rectal temperature of young rats (up to 2 hours), followed by a rise in temperature that started at 3 hours and remained high until 6 hours after LPS injection. Furthermore, it was shown that LPS injection 3 and 6 hours before intrastriatal injection of GA caused an increase in striatal levels of IL-1β in young rats, and this increase was statistically higher in 6 than in 3 hours. In addition, it was observed that the increase in IL-1β striatal levels, caused by LPS administration, positively correlated with total time of seizures. Finally, it was observed that previous use of IL-1β antibody prevented the latency reduction and the increased duration of seizures caused by LPS administration 6 h before intrastriatal injection of GA in young rats. Thus, these findings suggest that the signaling of IL-1β present in inflammation produced by LPS contributes significantly to neuronal hyperexcitability, and thus to reduce latency and increase the duration of seizures induced by GA. Therefore, pharmacological treatments that block the specific functions or overproduction of IL-1β in GA-I, may represent an unconventional strategy to treat this condition. However, clinical studies should be conducted to evaluate the effectiveness of treatment in glutaricoacidemic patients with convulsions. Since patients with GA-I have other important neurological changes addition to the seizures, as cognitive impairments, the second hypothesis to be tested in this study was to determine whether chronic treatment with GA (5 μmol/g; s.c.; twice per day; from the 5th to the 28th day of life) could cause spatial memory impairment in young rats, and verify whether the inflammation produced by LPS (2 mg/Kg; i.p.; one per day; from the 25th to the 28th day of life) could facilitate the cognitive deficit induced by GA. In addition, it also was evaluated the possible impact of these treatments on functional and structural changes in the hippocampus of these animals. Initially it was shown that chronic treatment with GA, as well as the treatments with LPS and GA-LPS, caused a deficit in spatial learning of young rats. However, it was demonstrated that the treatment with GA-LPS produced a greater impairment in spatial memory compared to other treatments. In addition, it was observed that none of the treatments affected weight or locomotor activity/exploratory of animals. It also was shown that chronic treatment with GA, as well as treatments with LPS and GA-LPS, increased the hippocampal levels of IL-1β and TNF-α in young rats. Furthermore, it was demonstrated that treatments with GA, LPS and GA-LPS caused a reduction in total hippocampal volume of young rats. Finally it was observed that treatments with GA, LPS and GA-LPS caused a reduction of α1 subunit activity of Na+,K+-ATPase enzyme. On the other hand, it was shown that treatments with GA and LPS caused an increase in activity of α2/3 subunits of the enzyme. Thus, only treatment with GA-LPS showed a reduction in total activity of Na+,K+-ATPase in the hippocampus of young rats. These data indicate that the impairment in spatial learning observed in rats treated with GA, LPS and GA-LPS was due to increased levels of inflammatory cytokines, the reduction in hippocampal volume and the inhibition of α1 subunit activity of Na+,K+-ATPase enzyme. However, the worsening in spatial memory observed in rats treated with GA-LPS was due to inhibition of total activity of Na+,K+-ATPase, which was specific α2/3 isoforms, since only this group showed no compensatory response the activity of these subunits. Therefore, this second part of the study showed that chronic treatment with GA caused a deficit in spatial learning in young rats, and that the presence of an inflammatory process increased the impairment in spatial memory induced by GA alone. Thus, understanding the mechanisms involved in seizures and cognitive deficits observed in patients with GA-I in the presence of an inflammatory process is important for the development of new therapies to treat this condition, as well as other diseases associated with the presence of inflammatory mediators. / A acidemia glutárica tipo I (GA-I) é um erro inato do metabolismo (EIM) caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo principal de ácido glutárico (GA) e patologicamente por uma característica degeneração estriatal. As manifestações clínicas são predominantemente neurológicas, e desenvolvem-se principalmente na infância (até os 5 anos de idade). Entre estas alterações, destacam-se as convulsões e os déficits cognitivos, os quais podem ser precipitados por processos infecciosos. A partir disso, a primeira hipótese a ser testada neste estudo foi investigar se o lipopolissacarídeo sorotipo E. coli 055 B5 (LPS; 2 mg/Kg; i.p.), um agente inflamatório, facilitaria as convulsões induzidas pelo GA em ratos jovens. Para isso, primeiramente determinou-se a dose intraestriatal aguda de GA (1.3 μmol/estriado) que causa convulsões comportamentais e eletroencefalográficas (EEG) em ratos jovens (21 dias). Em seguida foi verificado que a administração de LPS 3 horas antes da injeção intraestriatal de GA não alterou as convulsões, mas quando o LPS foi administrado 6 horas antes do GA, ele reduziu a latência e aumentou a duração das convulsões comportamentais e EEG induzidas pelo GA em ratos jovens. Observou-se também que injeção de LPS causou uma queda inicial na temperatura retal dos ratos jovens (até 2 horas), seguida de uma elevação na temperatura que iniciou em 3 horas e permaneceu alta até 6 horas após a injeção de LPS. Além disso, foi verificado que injeção de LPS 3 e 6 horas antes da injeção intraestriatal de GA causou um aumento nos níveis estriatais de IL-1β nos ratos jovens, sendo esse aumento estatisticamente maior em 6 do que em 3 horas. Também foi observado que o aumento nos níveis estriatais de IL-1β, causado pela administração de LPS, correlacionou-se positivamente com o tempo total de convulsões. Por fim, verificou-se que uso prévio do anticorpo da IL-1β preveniu a redução da latência e o aumento da duração das convulsões causadas pela administração de LPS 6 horas antes da injeção intraestriatal de GA nos ratos jovens. Assim, estes achados sugerem que a sinalização da IL-1β presente no processo inflamatório produzido pelo LPS contribui decisivamente para a hiperexcitabilidade neuronal e, consequentemente, para a redução da latência e o aumento da duração das convulsões induzidas pelo GA. Dessa maneira, tratamentos farmacológicos específicos que bloqueiam a superprodução ou as funções da IL-1β na GA-I, podem representar uma estratégia não convencional para o tratamento dessa patologia. Entretanto, estudos clínicos devem ser realizados a fim de avaliar a eficácia desse tratamento nos pacientes glutaricoacidêmicos que apresentam convulsões. Desde que os pacientes com GA-I apresentam outras alterações neurológicas importantes além das convulsões, como prejuízos cognitivos, a segunda hipótese a ser testada neste estudo foi verificar se o tratamento crônico com GA (5 μmol/g; s.c.; duas vezes por dia; do 5° ao 28° dia de vida) causaria déficit de memória espacial em ratos jovens, bem como se a inflamação produzida pelo LPS (2 mg/Kg; i.p.; uma vez por dia; do 25° ao 28° dia de vida) facilitaria o déficit cognitivo induzido pelo GA. Além disso, também foi objetivo avaliar o impacto desses tratamentos sobre possíveis alterações funcionais e estruturais no hipocampo desses animais. Inicialmente verificou-se que o tratamento crônico com GA, assim como os tratamentos com LPS e GA-LPS, causaram um déficit no aprendizado espacial dos ratos jovens. No entanto, foi observado que o tratamento com GA-LPS produziu um maior prejuízo na memória espacial comparado com os outros tratamentos. Em seguida foi observado que nenhum dos tratamentos alterou o peso ou a atividade locomotora/exploratória dos animais. Verificou-se também que o tratamento crônico com GA, assim como os tratamentos com LPS e GA-LPS, aumentaram os níveis hipocampais de IL-1β e TNF-α nos ratos jovens. Além disso, foi observado que tratamentos com GA, LPS e GA-LPS causaram uma redução no volume hipocampal total dos ratos jovens. Finalmente verificou-se que os tratamentos com GA, LPS e GA-LPS causaram uma redução na atividade da subunidade α1 da enzima Na+,K+-ATPase. Por outro lado, foi observado que os tratamentos com GA e LPS causaram um aumento na atividade das subunidades α2/3 da enzima. Assim, somente o tratamento com GA-LPS apresentou uma redução na atividade total da enzima Na+,K+-ATPase no hipocampo dos ratos jovens. Estes dados indicam que o prejuízo no aprendizado espacial observado nos ratos tratados com GA, LPS e GA-LPS parece estar relacionado a um aumento nos níveis de citocinas inflamatórias, a uma redução no volume hipocampal e a uma inibição na atividade da subunidade α1 da enzima Na+,K+-ATPase. No entanto, o maior prejuízo na memória espacial observado nos ratos tratados com GA-LPS ocorreu devido a inibição na atividade total da enzima Na+,K+-ATPase, que foi específica das isoformas α2/3, já que somente este grupo não apresentou resposta compensatória na atividade destas subunidades. Portanto, esta segunda parte do estudo demonstrou que o tratamento crônico com GA causou um déficit no aprendizado espacial de ratos jovens, e que a presença de um processo inflamatório potencializou o prejuízo na memória espacial induzida pelo GA sozinho. Assim, o entendimento dos mecanismos envolvidos nas convulsões e no déficit cognitivo observados nos paciente com GA-I frente a um processo inflamatório é importante para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento dessa patologia, bem como de outras doenças associadas à presença de mediadores inflamatórios.

Achyrocline satureoides (Lam) D.C., popularmente conhecida como \"marcela\", é utilizada popularmente para tratar diversas doenças, como mal estar gástrico e intestinal, inflamações, diabetes e outros. Como os mecanismos de ação do extrato de A. satureoides ainda não são conhecidos, o presente trabalho visou esclarecer os mecanismos antiinflamatórios do extrato bruto hidroalcoólico das inflorescências de A. satureoides, focando na migração e função fagocítica e microbicida de neutrófilos. Para tanto, o extrato hidroalcoólico foi administrado por gavage (50, 100 e 250mg/kg) em ratos Wistar, machos, adultos, e a inflamação foi induzida pela injeção do lipopolisacarídeo de E. coli (LPS; 2mL de solução; 500 µg/mL em PBS) no tecido subcutâneo dorsal (modelo da bolsa de ar). Animais controles receberam volumes equivalentes de veículo do extrato e indometacina (30mg/kg). Foram quantificados o número de neutrófilos (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico) e a concentração de Leucotrieno B4 e CINC-1 (ELISA) no foco de lesão; a interação leucócito-endotélio em vênulas da microcirculação mesentérica após estímulo in situ pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS; 30µg/40µL; por microscopia intravital); a expressão de moléculas de adesão e do toll-like receptor (TLR-4), além da quantificação do burst oxidativo (induzido pelo miristato-acetato de forbol - PMA) e fagocitose em neutrófilos circulantes (citometria de fluxo); análise histológica e quantificação dos marcadores hepáticos (AST, ALT e Gama-GT) e renais (uréia e creatinina) no plasma por espectrofotometria. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com o extrato reduziu o número de neutrófilos e a concentração de LTB4 e CINC-1 na bolsa de ar; reduziu a expressão de TLR4 pelos neutrófilos circulantes e a porcentagem de neutrófilos positivos para L-selectina e β2-integrina; inibiu a adesão e o comportamento rolling de leucócitos ao endotélio microvascular; reduziu o burst induzido por PMA; aumentou o potencial de fagocitose, sem alterar o burst induzido por Staphylococcus aureus, não alterou a morfologia tecidual e a concentração sérica dos marcadores de atividade hepática e renal. Em conjunto, os dados obtidos mostram que dose, aparentemente, não tóxica do extrato de A. satureoides exerce efeito antiinflamatório in vivo frente ao LPS, quantificados pela redução da migração e pelas interferências nas atividades fagocítica e microbicida dos neutrófilos. / Achyrocline satureoides (Lam) D.C., popularly known as \"marcela\", is popularly used to treat several diseases, such as gastric and intestinal disorders, inflammation, diabetes and others. As the mechanisms of the extract of A. satureoides have not been elucidated, this study aimed to investigate the anti-inflammatory mechanisms of the crude hydroalcoholic extract of the flowers of A. satureoides, focusing on migration and phagocytic and microbicidal neutrophils function. The hydroalcoholic extract was administered by gavage (50, 100 and 250mg/kg) into male Wistar rats, adult, and inflammation was induced by injection of lipopolysaccharide E. coli (LPS; 2 mL of solution; 500µg/mL in PBS) into the dorsal subcutaneous tissue (air pouch model). Control animals received equivalent volume of extract vehicle or indomethacin solution (30mg/kg). It was quantified the numbers of neutrophils (Neubauer chamber and stained smears by Panoptic) and concentrations of leukotriene B4 (LTB4) and CINC-1 (ELISA) in the focus of the injury; the leukocyte-endothelium interactions in mesenteric venules of the microcirculation after stimulation by LPS (30µg/40µL; intravital microscopy); the adhesion molecules and toll-like receptor (TLR-4) expressions and quantification of oxidative burst and phagocytosis in circulating neutrophils (flow cytometry); histological analysis and the hepatic markers (AST, ALT and gamma-GT) and kidney (urea and creatinine) concentrations in plasma by spectrophotometry. Data obtained showed that the treatment reduced the numbers of neutrophils and concentrations of LTB4 and CINC-1 in the subcutaneous tissue; reduced the TLR4 expression by circulating neutrophils and the number of β2-integrin- and L-selectin-positive neutrophils; inhibited the leukocyte adhesion and the rolling behavior to vascular endothelium; reduced the burst evoked by PMA; increased the phagocytosis without changing the burst induced by Staphylococcus aureus; and did not alter the tissue morphology and concentration of hepatic and renal enzymes in the serum. Together, these data suggest that dose, apparently non-toxic, of extract of A. satureoides exerts anti-inflammatory effect in vivo, quantified by the reduced migration and by interference in the phagocytic and microbicidal activities of neutrophils.

Diversos neurônios apresentam uma atividade constitutiva de NF-?B, o qual desempenha múltiplas funções fisiológicas, além da modulação de respostas patológicas. A melatonina, hormônio produzido ritmicamente pela glândula pineal na fase de escuro, é também um fator autócrino e parácrino envolvido em múltiplos processos biológicos, sendo que a citoproteção é uma ação de destaque dessa molécula. A melatonina inibe a translocação nuclear do NF-?B e a expressão do seu produto iNOS em modelos de danos celular. No presente trabalho avaliamos se o efeito citoprotetor da melatonina depende do estado de ativação do NF-?B em cultura de células granulares de cerebelo, tendo em vista que essas células apresentam uma atividade basal deste fator de transcrição fundamental para a sobrevivência das células. Além disso, questionamos se essas células em cultura produziriam melatonina e se esta teria algum papel citoprotetor. Testamos a viabilidade da cultura de células granulares de cerebelo de rato (Wistar 7-8 dias de idade) após 24 horas de incubação com melatonina na presença ou ausência de LPS. Em condição basal a melatonina diminuiu a sobrevivência das células e inibiu a morte celular induzida pelo LPS. Este efeito foi compatível com os resultados da ativação do NF-?B e da expressão da iNOS. Na presença do LPS a melatonina bloqueia a indução da translocação nuclear do NF-?B, a expressão da iNOS e a produção de NO. Quando apenas a melatonina foi incubada, observamos uma inibição transiente (15 min.) do NF-?B, seguida por um aumento do conteúdo nuclear do fator de transcrição (60 min.). A expressão da iNOS seguiu o mesmo perfil, ou seja, sofreu uma inibição transiente (30 min.) seguida de um aumento acima do nível basal após 120 minutos de incubação. Portanto, demonstramos que a melatonina afeta de forma diferente a viabilidade de células granulares de cerebelo dependo do contexto em que as células se encontram. Além disso, obtivemos evidências de que essas células expressam a enzima a AA-NAT, e produzem melatonina, que exerce função protetora para a cultura. Desta forma, nossos dados proporcionam uma base mecanicista para a compreensão da influência do contexto celular na resposta à melatonina / Several neurons constitutively express NF-?B, which plays some physiological roles, besides the well-known control of pathological responses. Melatonin, the hormone produced by the pineal gland rhythmically in the dark phase is also an autocrine and paracrine factor of immune competent cells, involved in multiple biological processes and the cytoprotective action is a highlight of this molecule. Melatonin inhibits the nuclear translocation of NF-?B and the expression of iNOS in models of cell damage. The present study evaluated whether the cytoprotective effect of melatonin depends on the state of activation of NF-?B in cultured cerebellar granule cells, given that these cells have a basal activity of this transcription factor essential for cell survival. Moreover, we questioned whether these cells in culture produce melatonin and whether it would have a cytoprotective role. We tested the viability of the rat (7-8 days old Wistar) cerebellar granule cell culture after 24 h incubation with melatonin in the presence or absence of LPS. In basal condition melatonin decreased cell survival while inhibited cell death induced by LPS. These effects were consistent with the results from the activation of NF-?B and the expression of iNOS. In the presence of LPS melatonin blocked the activation of the NF-?B , the expression of iNOS and the production of NO. When only melatonin was incubated, we observed a transient reduction (15 min) of NF-?B nuclear content, followed by an increase of its nuclear content (60 min). The iNOS expression followed the same profile, i.e. undergone a transient inhibition (30 min), followed by an increase above baseline after 120 min of incubation. Therefore, we have demonstrated that melatonin affects differently the viability of cerebellar granule cells depending on the context. Furthermore, we founded evidences that the granule cells in culture express the key enzyme in the synthesis of melatonin, AA-NAT and produce melatonin, which carries protective function for the culture. Our data provide a mechanistic basis for understanding the influence of cell context on the final output response to melatonin

Células apresentadoras de antígeno (APCs) controlam as respostas de linfócitos T por múltiplos mecanismos, que incluem a expressão de moléculas co-estimuladoras, a produção de citocinas e outros mediadores. Estes mecanismos exercem influência não só na proliferação, diferenciação e polarização dos linfócitos T, mas também interferem na sobrevivência destas células. No presente trabalho, foi demonstrado que fator(es) solúvel(eis) produzido(s) por APCs ativadas via receptores do tipo Toll (TLRs) suprimem a morte induzida por ativação (AICD) de linfócitos T. Este efeito foi observado em APCs não estimuladas, porém foi significativamente maior após estimulação das APCs com lipopolissacarídeo (LPS). Através do uso de diferentes camundongos nocautes, foi mostrado que a produção do fator protetor induzida por LPS é dependente da via de TLR4/MyD88 e independente de TLR2 e CD14. Este fator foi identificado como prostaglandina E2 (PGE2) e foi demonstrado que os sobrenadantes derivados de APC e a PGE2 sintética bloqueiam a expressão de CD95L em linfócitos T estimulados via TCR/CD3. A inibição da expressão de CD95L reduz tanto a AICD como a morte de macrófagos, alvos do ataque citotóxico dos linfócitos T ativados. Foi demonstrado também que, ao invés de bloquear a via do CD95, a PGE2 potencializa a morte induzida por anticorpos anti-CD95 agonistas. Os receptores de PGE2, EP2 e EP4, parecem ser os responsáveis por mediar os efeitos supressores da PGE2 na AICD, já que a estimulação farmacológica destes receptores mimetiza o efeito protetor da PGE2 e seus respectivos antagonistas interferem com a proteção conferida pelos sobrenadantes de APCs e pela PGE2 sintética. A ativação do EP2 e do EP4 age sinergicamente na ativação das vias dependentes da PKA e de EPAC, que contribuem para a inibição da AICD. Por fim, a ativação dos principais fatores de transcrição envolvidos com a expressão de CD95L (NFAT, AP-1 e NF-kB) não é bloqueada por PGE2. Por outro lado, PGE2 induziu a expressão de ICER, um repressor transcripcional, através da ativação de CREB. Em conjunto, estes resultados indicam que as APCs podem modular os níveis de expressão de CD95L através da secreção de PGE2 em resposta ao LPS, através de uma via dependente de TLR4 e MyD88, com conseqüências tanto para a morte de linfócitos T quanto para a sua própria sobrevivência. / Antigen-presenting cells (APCs) control T-cell responses by multiple mechanisms, including the expression of co-stimulatory molecules and the production of cytokines and other mediators that control T-cell proliferation, survival and differentiation. In this present work, it was demonstrated that soluble factor(s) produced by Toll-like receptor (TLR)-activated APCs suppress activation-induced cell death (AICD). This effect was observed in non-stimulated APCs, but it was significantly increased after lipopolysaccharide (LPS) treatment. Using different KO mice, it was found that the LPS-induced protective factor is dependent on TLR4/MyD88 and independent of TLR2 and CD14. The protective factor was identified as prostaglandin E2 (PGE2) and it was shown that both APC-derived supernatants and PGE2 prevented CD95L upregulation in T cells in response to TCR/CD3 stimulation, thereby avoiding both AICD and activated T cell killing of target macrophages. It was also demonstrated that instead of blocking CD95 pathway, PGE2 enhanced T cell death induced by agonistic anti-CD95 antibodies. The PGE2 receptors, EP2 and EP4, appear to be involved in AICD suppression since pharmacological stimulation of these receptors mimics the protective effect on T cells and their respective antagonists interfere with the protection induced by either APCs derived or synthetic PGE2. The engagement of EP2 and EP4 synergistically activates protein kinase A (PKA) and exchange protein directly activated by cAMP pathways to prevent AICD. Finally, the activation of the main transcription factors involved in CD95L expression (NFAT, AP-1 and NF-kB) is not avoided by PGE2. On the other hand, PGE2 induces the expression of ICER, a transcriptional repressor of CD95L, through CREB activation. Taken together, these results indicate that APCs can regulate T-cell levels of CD95L by releasing PGE2 in response to LPS through a TLR4/MyD88-dependent pathway, with consequences for both T cell and their own survival.

Linhas de Produtos de Software (LPS) abstraem a semelhança entre produtos e envolvem o conceito de reúso de software para desenvolver software em larga escala com mais rapidez e qualidade. O reúso dos artefatos em uma LPS é planejado e executado desde sua concepção, sendo assim possível armazenar esses artefatos em um repositório (núcleo de ativos reusáveis) para utilização posterior. Porém, ao se construir um repositório para uma certa LPS, este atende apenas às especificações desta arquitetura e não promove o reúso desses ativos em outras LPS, causando uma certa perda no potencial de reusabilidade dos ativos produzidos e armazenados. Além disso, a definição e os dados da execução do processo de desenvolvimento dessas LPS também não são armazenados prevendo o reúso, o que gera retrabalho para definir e instanciar um processo de software sempre que uma nova LPS é criada. Neste contexto, este trabalho tem por objetivo apresentar uma abordagem baseada em um conjunto de serviços para promover o amplo reúso de ativos produzidos e de elementos de processo utilizados, além de facilitar a criação e o desenvolvimento de linha de produtos de software, permitindo o gerenciamento do núcleo de ativos reusáveis. Por possuir uma interface baseada em serviços, esta abordagem poderá ser incorporada também a outros ambientes. Para validar a abordagem, verificar vantagens e sugerir melhorias, foi conduzida uma prova de conceito com sua aplicação. Os resultados dessa prova comprovaram a viabilidade da abordagem em cumprir os objetivos propostos. / Software Product Lines (SPL) extract the similarity among products and use the software reuse concept to produce large-scale software with increased quality and reduction in the development time. Reuse in SPL is planned and executed since the beginning for each artifact resulting from the development process, and then these artifacts are stored in a repository (reusable core assets) for later use. However, when a repository is built for a specific SPL, it supports only the specifications for that architecture and do not promote the reuse of these assets among distinct SPL, which inhibits their reuse potential. In addition, the definition and execution data of the development process applied are not stored properly for reuse, which causes a re-work to define and instantiate a software process when creating a new SPL. In this context, this work aims at present a service-based approach to promote the wide reuse of the produced assets and process elements, also to facilitate the creation and the management of SPL and to allow the management of the reusable core assets. Once this approach has a service-based interface, it can be embedded into other environments. In order to validate this approach, point out advantages and suggest improvements, a concept proof was performed applying it. The results of this proof ensured the approach viability to fulfill the proposed goals.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Glutaric aciduria type I (GA-I) is an inborn error of metabolism (EIM) characterized biochemically by accumulation of glutaric acid (GA). The clinical manifestations are mainly neurological and develop during childhood. Among these changes, there are the seizures and cognitive deficits, which may be precipitated by infectious processes. Although growing evidence supports that inflammation and oxidative damage are both involved in learning impairment, it is not known whether inflammatory and oxidative stress markers facilitate GA-induced memory impairment. From this, the main objective of this study was to investigate the performance of rat pups chronically injected with GA and lipopolysaccharide (LPS) in spatial memory test on Barnes maze. To evaluate antioxidant defenses, cytokines levels, Na+, K+-ATPase activity, and hippocampal volume. Furthermore, we also evaluated wheter N-acetylcysteine (NAC) could improve these behavioral, biochemical or structural changes induced by GA and LPS administration. For this, the rat pups were injected with GA (5umol g of body weight-1, subcutaneously; twice per day; from 5th to 28th day of life), and were supplemented with NAC (150 mg/kg/day; intragastric gavage; for the same period). In order to mimic a severe infection state, LPS (2 mg/kg; E.coli 055 B5) or vehicle (saline 0.9%) was injected intraperitoneally, once per day, from 25th to 28th day of life.Oxidative stress biomarkers, antioxidant activity and hippocampal volume were assessed. In this study, GA caused spatial learning deficit in the Barnes maze, and that LPS potentiated the memory impairment induced by GA in rat pups. In addition, GA and LPS increased proinflammatory cytokine levels (TNF- and IL-1), and the co-administration of these compounds potentiated the increase of IL-1 levels but not TNF- levels in the hippocampus of this animals. Although GA and LPS administration increased TBARS (thiobarbituric acid-reactive substance) content, reduced antioxidant defenses and inhibited Na+,K+-ATPase activity (total and subunit α1), GA and LPS co-administration did not have additive effect on oxidative stress markers and Na+, K+ pump. The hippocampal volume did not change after GA or LPS administration. N-acetylcysteine protected against impairment of spatial learning and increase of cytokines levels induced by GA and LPS. The NAC also protected against deleterious effects induced by GA and LPS, as characterized by inhibition of Na+,K+-ATPase activity (total and subunit α1)and increase of TBARS content, as well as the reduction of antioxidant defenses(non protein thiols and glutathione content, superoxide dismutase and catalase activities).These results suggest that inflammatory and oxidative markers may underlie at least in part of the neuropathology of GA-I in this model. Pharmacological protection with NAC during encephalopatic crises could be considered as an adjuvant therapy to prevent hippocampal dysfunction and the progression of disease in children with GA-I. / A acidemia glutrárica do tipo I (AG-I) é um erro inato do metabolismo (EIM) caracterizada bioquimicamente pelo pelo acúmulo de ácido glutárico (AG). As manifestações clínicas são predominantemente neurológicas, e desenvolvem-se principalmente na infância. Entre essas alterações, as quais são precipitadas por processos infecciosos, pode-se citar o déficit cognitivo. Embora estudos recentes sugerem que a inflamação e o estresse oxidativo estão envolvidos no déficit cognitivo, não se sabe se os marcadores inflamatórios e oxidativos facilitam o prejuízo de memória após a administração de AG. A partir disso, o objetivo desta dissertação foi investigar o desempenho de ratos jovens injetados cronicamente com AG e lipopolissacarídeo (LPS) no teste de memória espacial no labirinto de Barnes. Além disso, foi avaliado os níveis das defesas antioxidantes, níveis de citocinas, atividade da enzima Na+, K+-ATPase e volume hipocampal. Como a N-acetilcisteína (NAC) possui propriedades antioxidantes e antiinflamatórias, foi testado se esse composto poderia melhorar as alterações comportamentais, bioquímicas e estruturais induzidas pela administração de AG e LPS. Para isso, os ratos jovens foram injetados com AG (5 μmol/g do peso corporal-1; subcutaneamente; duas vezes por dia; do 5º ao 28º dia de vida), e foram suplementados com NAC (150 mg/kg/dia; por gavagem; pelo mesmo período). A fim de mimetizar um estado infeccioso, LPS (2 mg/Kg: E. coli 055 B5) ou veículo (salina 0.9%) foi injetado intraperitonealmente uma vez por dia, do 25º ao 28º dia de vida. Nesse estudo, AG causou déficit de aprenizagem espacial no labirinto de Barnes, e o LPS potencializou esse prejuízo de memória induzido pelo AG nos ratos jovens. Em adição, a administração de AG e LPS aumentou os níveis de citocinas pró-inflamatórias (TNF- and IL-1), e a associação desses compostos potencializou o aumento dos níveis de IL-1, mas não de TNF-α no hipocampo dos animais. Embora a associação de AG e LPS tenha causado o aumento o conteúdo TBARS (espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico), a redução das defesas antioxidantes e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase (total e subunidade α1), a associação de AG e LPS não teve efeito aditivo nos marcadores de estresse oxidativo e na atividade da bomba de Na+ e K+. O volume hipocampal não foi alterado após a administração do AG e LPS. A N-acetilcisteína protegeu contra o prejuízo de aprendizagem espacial e aumento de citocinas inflamatórias induzido pelo AG e LPS. A NAC também protegeu contra os efeitos deletérios induzidos pelo AG e LPS, caracterizado pela inibição da atividade da Na+,K+-ATPase (total e subunidade α1) e aumento do conteúdo de TBARS, bem como a redução das defesas antioxidantes (tiós não-proteicos, conteúdo de glutationa, avitidade da superóxido dismutase e catalase). Esses resultados sugerem que marcadores inflamatórios e oxidativos podem estar envolvidos, em parte, na neuropatologia da AG-I neste modelo. Dessa forma, a proteção farmacológica com a NAC durante crises encefalopáticas pode ser considerada como uma terapia adjuvante para prevenir a disfunção hipocampal e a progressão da doença em crianças com AG-I.

L’arsenic inorganique est un contaminant environnemental, cancérogène pour l’homme, mais également un métalloïde étudié, aujourd’hui, dans le traitement de maladies inflammatoires chroniques. Il possède des propriétés immunosuppressives pouvant déréguler les mécanismes physiologiques de défense ou bloquer l’exacerbation de réponses inflammatoires chroniques. L’arsenic inorganique altère principalement les fonctions des lymphocytes T et des macrophages. En revanche, l’impact du métalloïde sur la physiologie des cellules dendritiques (DCs) est peu connu. Pourtant, ces cellules présentatrices d’antigène jouent un rôle fondamental dans les processus d’immunosurveillance et sont très impliquées dans la physiopathologie des maladies inflammatoires chroniques. Dans ce contexte, les objectifs de mon travail de thèse étaient d’étudier les effets de l’arsenic inorganique sur la différenciation et la maturation in vitro de DCs générées à partir de monocytes humains. Nos résultats démontrent principalement que des concentrations de métalloïde, compatibles avec les taux plasmatiques d’arsenic mesurés chez les individus exposés, répriment la capacité des DCs à sécréter différentes cytokines pro-inflammatoires jouant un rôle essentiel dans l’activation et la polarisation des lymphocytes T. En particulier, l’arsenic inhibe l’expression et la sécrétion de l’interleukine-12 par un mécanisme moléculaire impliquant le facteur de transcription Nrf2. Au total, ces travaux de thèse démontrent que l’arsenic inorganique possède des propriétés immunosuppressives sur la physiologie in vitro des DCs humaines. Cette immunotoxicité pourrait contribuer à la toxicité du métalloïde chez l’homme exposé par voie environnementale, et être prise en compte pour déterminer les effets de l’arsenic dans le traitement de certaines maladies inflammatoires chroniques / Inorganic arsenic is an environmental human carcinogen, but is also studied these days because of its potential effectiveness in curing chronic inflammatory disease. Indeed, this metalloid possesses immunosuppressive properties which can dysregulate physiological mechanisms involved in immune defense, or reduce inflammation associated with those inflammatory diseases. Inorganic arsenic is known mainly to alter functions of T cells and macrophages. However, it is unknown whether arsenic targets dendritic cells (DCs). Yet, this antigen presenting cells plays a major role in the immunosurveillance, and is involved in the physiopathology of chronic inflammatory diseases. So, the aim of my thesis work was to study the effects of inorganic arsenic on in vitro differenciation and maturation of dendritic cells from human monocytes. Our results mainly shows that concentrations corresponding to those measured in environmentally exposed people, inhibits DCs secretion of proinflammatory cytokines, which plays a major role in activation and polarization of T cells. Particularly, arsenic strongly impairs expression and secretion of interleukine 12 (IL-12) by an underlying molecular mechanism involving Nrf2. Finally, this work shows that inorganic arsenic has immunosuppressive properties on the physiology in vitro of human dendritic cells. Immunotoxicity may then contribute to the metalloid toxicity in environmentally exposed people. This element could be taken into account when determining arsenic effects in curing some chronic inflammatory diseases.

La prévalence de l’obésité et du diabète de type 2 évolue de façon épidémique. Ces pathologies sont caractérisées par un état inflammatoire à bas bruit dont l’origine moléculaire est inconnue. L’une des pistes qui émerge concerne le microbiote intestinal et plus particulièrement des molécules pro-inflammatoires présentes à la surface des bactéries Gram(-) : les lipopolysaccharides (LPS). Nous avons récemment montré que ces LPS augmentent les taux circulants de glucagon-like peptide 1 (GLP-1), une hormone connue pour stimuler la sécrétion d'insuline. Par ailleurs, un lien existerait entre qualité nutritionnelle de l’alimentation et taux de LPS sanguins. Ainsi, alimentation, LPS et GLP-1 pourraient être liés. Ces travaux de thèse portent sur i) les mécanismes moléculaires reliant LPS et GLP-1 et ii) les conséquences physiopathologiques d’une endotoxémie expérimentale lors d’un régime obésogène. Nous montrons, in vitro, ex vivo et in vivo, que les LPS stimulent la sécrétion de GLP-1 par les cellules entéroendocrines via un mécanisme TLR4-dépendant. Les LPS présents dans l’intestin déclenchent cette sécrétion lors de situations pathologiques de dégradation de la muqueuse, faisant du GLP-1 un potentiel marqueur précoce d’altération de la barrière intestinale. Chez des souris sauvages, une endotoxémie expérimentale n’aggrave pas les conséquences métaboliques généralement observées lors d’un régime obésogène, certains paramètres sont même améliorés. Enfin, des souris présentant un défaut de détoxification des LPS nourries avec un régime obésogène prennent plus de masse corporelle que les souris contrôles. Les origines moléculaires de ces différences sont également recherchées. / Obesity and type 2 diabetes are metabolic diseases which have reached epidemic proportions worldwide. These metabolic disorders are related to a low grade inflammation whose molecular origin is still unknown. Previous studies have highlighted the involvement of the gut microbiota and especially components of the cell wall of Gram(-) bacteria: lipopolysaccharides (LPS). We have recently shown that LPS enhance glucagon-like peptide 1 (GLP-1) plasma levels, a hormone which is known to stimulate insulin secretion. Moreover there would be a link between the nutritional qualities of food and LPS plasma levels. Thus diet, LPS and GLP-1 may be closely related. The present work focuses on i) the molecular mechanisms linking LPS to GLP-1 and ii) the pathophysiological consequences of an experimental endotoxemia under obesogenic diet conditions. In vitro, ex vivo and in vivo experiments highlight LPS as potent secretagogues of GLP-1. They are able to induce GLP-1 secretion from enteroendocrine cells through a direct TLR4-dependent mechanism. Luminal LPS trigger GLP-1 secretion only under pathological conditions leading to intestinal mucosal damages. Therefore GLP-1 could be a promising early biomarker for diagnosing gut barrier injuries. Experimentally-induced endotoxemia in wild-type mice does not worsen the usually observed metabolic consequences of an obesogenic diet but rather seems to improve some of them. In addition, under high-fat diet, genetically-engineered mice with a defective LPS detoxification process gain more weight than control mice. The purpose of this thesis is also to disentangle the molecular explanation behind this difference.

Des études chez le rongeur et l’Homme ont montré que la détection orosensorielle des lipides alimentaires implique une dimension gustative. Deux lipido récepteurs candidats sont présents dans les bourgeons du goût : CD36, dont l’implication dans le « goût du gras » a été démontrée par des études menées au laboratoire chez la souris, et GPR120. Les travaux de cette thèse ont montré que le GPR120 n’intervient pas directement dans cette détection, mais permettrait de moduler la sensibilité aux lipides. Ce système gustatif permet d’adapter les choix alimentaires aux besoins énergétiques tout en satisfaisant au plaisir de la consommation d’aliments palatables. Cependant, les personnes obèses surconsomment les aliments riches en énergie. S’il existe des perturbations centrales des mécanismes de récompense, nos résultats suggèrent que le système de détection périphérique des lipides est aussi altéré chez les souris obèses. Une diminution réversible de la sensibilité gustative pour les lipides est observée chez des souris rendues obèses par un régime riche en acides gras saturés, conséquence d’une dérégulation de la signalisation calcique CD36-dépendante dans les papilles gustatives. Pour déterminer l’origine de ces perturbations, le rôle de l’endotoxémie métabolique (due à une augmentation du LPS plasmatique provenant du microbiote intestinal) observée lors de l’obésité a été testé. Nous avons montré que, pris hors du contexte de l’obésité, l’endotoxémie bas-bruit est insuffisante pour altérer à elle-seule la détection orale des lipides. L’origine de cette altération est donc multifactorielle, impliquant probablement une combinaison de modifications hormonales et inflammatoires. / Dietary lipids are detected by the gustatory system in rodents and humans. Two candidate lipid-receptors are found in taste buds: CD36, which is involved in the fat taste as shown by studies conducted in our laboratory, and GPR120. Our results show that GPR120 is not directly involved in the gustatory detection of lipids in mice, but could rather be involved in the modulation of the sensitivity for fat. When this gustatory system works properly, food choices can meet the organism’s energy needs. Besides, the pleasure brought by the consumption of palatable foods is satisfied. However, obese people often overconsume energy-dense food. In the central nervous system, perturbations of the reward mechanisms have been observed, but our data show that the peripheral detection system is also altered in obese mice. A reversible decrease in the gustatory sensitivity for lipids has been found in diet-induced obese mice (diet rich in saturated fatty acids). This phenomenon is the consequence of a deficiency in the regulation of the CD36-dependant calcium signaling in gustatory papillae. To determine the origin of these perturbations, the role of obese-associated metabolic endotoxemia (characterized by an increase in plasma LPS coming from the intestinal microbiota) was investigated. We showed that low-grade endotoxemia, when studied outside of the context of obesity, is insufficient to trigger an alteration of the oral lipid detection. The origin of this alteration is therefore multifactorial, probably involving a combination of hormonal and inflammatory modifications.

O habitat natural da Neisseria meningitis é a nasofaringe humana e a transmissão da bactéria é por contato direto ou por inalação de partículas durante a fase de transmissão N. meningitis é uma bactéria Gram-negativa responsável por uma significante mortalidade em todo o mundo. Embora existam vacinas polissacárides contras os sorogrupos A, C, W135 e Y , não há uma vacina adequada para crianças menores de 4 anos para o sorogrupo B. Estudos estão sendo direcionadas para pesquisa de antígenos vacinais que são derivados da proteínas de membrana externa(NOMV). Entretanto vacinas baseadas em NOMV são consideradas pouco imunogênicas , fazendo com que o uso de adjuvantes seja necessário. Este estudo investiga a imunogenicidade da NOMV de N. meningitidis administrada pela via intranasal/intramuscular em camundongos neonatos BALC/c, usando proteína de membrana externa (NOMC) obtido de uma cepa epidêmica de N. meningitidis B:4:P1:15. As cepas usadas para imunização dos camundongos foram selecionadas por colony-blot, usando anticorpo monoclonal anti L3,7,9 para maior expressão do LPS contra o imunotipo L3,7,9 presente na cepa (B:4:P1:15 3,7,9). Como adjuvantes de mucosa foram utilizados Bordetella pertussis (células íntegras) ou sobrenadante de cultura com 48 horas ou hidróxido de alumínio [Al(OH)3]. O soro dos camundongos imunizados foram analisados pelo método de ELISA à fim de se comparar os diferentes adjuvantes utilisados. O índice de avidez também foi determinado. IgG e IgM foram detectados nos soros dos camundongos após imunização, com índices de intermediária e alta avidez. Todos os adjuvantes foram capazes de aumentar a resposta imune contra NOMV de N.meningitidis. A via intranasal foi adequada para sensibilizar as células do sistema imune que foram rapidamente estimuladas pela via intramuscular usando os adjuvantes utilizados na presente investigação. Dados sugerem que o estudo da NOMV é importante na indução da imunidade de mucosa para N. meningitidis B, e que a qualidade e magnitude da resposta imune gerada pelas vacinas de mucosa são influenciadas tanto pelo adjuvante como pelo antígeno. Concluímos que NOMV juntamente com adjuvantes de mucosa tem considerável potencial no desenvolvimento de vacinas contra o meningococo do sorogrupo B. / The natural habitat of Neisseria meningitidis is the human nasopharynx, and the bacterium is transmitted by direct mouth-to-mouth contact or by the inhalation of released mucous particles during close contact. N meningitidis is a Gram-negative bacterium responsible for significant mortality worldwide. While effective polysaccharide-based vaccines exist against serogroups A, C, W135, and Y, no similar vaccine is suitable for children under 4 years against disease caused by serogroup B strains. Current studies are searching for vaccinal antigens that are derived from the native outer membrane (NOMV). However, vaccines based on NOMV are considered weak, making the use of adjuvants necessary. This study investigated the immunogenicity of NOMV of N. meningitidis administered intranasal/intramuscular in neonate BALB/c mice, using the native outer membrane complex (NOMC) obtained from an epidemic strain of N. meningitidis B:4:P1.15. The strains used for immunization of mice were selected by colony-blot, using anti L3,7,9 monoclonal antibodies, for the highest expression of LPS among the immunotypes (B:4:P1:15 L9á). As mucosal adjuvants, we used Bordetella pertussis (whole cells) or the supernatant of 48 h culture of this bacterium, followed by an intramuscular dose of the same protein adsorbed onto , B. pertussis (whole cells) or 48-h B. pertussis culture supernatant or aluminum hydroxide [Al(OH)3]. Sera of immunized mice were evaluated by ELISA in order to compare the different adjuvants used. We also determined their avidity index. IgG and IgM were detected in the serum of mice after immunization, with avidity indices that ranged from intermediate to high. All adjuvants were capable of increasing the immune response against NOMV of N. meningitidis in the homologous prime/boost schedule used. The intranasal route was suitable for sensitizing the cells of the immune system which were quickly stimulated by the intramuscular route using the adjuvants analysed in the present invertigation. Data suggest that the NOMV studied is important in the induction of mucosal immunity to N. meningitidis B, and that the quality and magnitude of the immune responses generated by mucosal vaccines are influenced by the adjuvant as well as the antigen. In conclusion, nasal delivery of NoMV with mucosal adjuvants has considerable potential in the development of a mucosal vaccine against serogroup B meningococci.