Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1567_1.pdf: 1348580 bytes, checksum: 596beeadff53078cd246b5fb8e27f25f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A infecção por hepatite A é encontrada em todas as partes do mundo, e a alta prevalência está associada com pobres condições socioeconômicas a diversos padrões epidemiológicos. O mapeamento de epítopos do virus da hepatite A (HAV) pode contribuir com o desenvolvimento de uma vacina potencialmente segura contra o HAV e a identificação de moléculas que se ligam ao HLA é importante para compreensão da função molecular do sistema imune e para o desenvolvimento de vacinas. O objetivo do presente trabalho foi identificar epítopos de células T nas proteínas estruturais VP1 e VP4 do vírus da hepatite A utilizando amostras de voluntários do grupo de vacinado ou do grupo de infectados naturalmente pelo HAV. Para mapear os epítopos imunodominantes, setenta peptídeos (15 aminoácidos cada, sobreposição de 11) foram sintetizados, cobrindo os 345 aminoácidos (aa) da proteína VP1 e os 23 aa da proteína VP4, da cepa HM-175. Esses peptídeos foram testados por ELISPOT com PBMCs de voluntários dos dois grupos. Nossos resultados revelaram que 18 peptídeos de VP1 foram reativos nos dois grupos, entretanto, no grupo vacinado os peptídeos mais imunogênicos foram distribuídos nas posições de aminoácidos 33-47, 45-59, 49-63, 73-87 e 153-167, enquanto no grupo infectado, os peptídeos mais imunogênicos foram 1-15, 49-63, 69-83 e 149-163. Os três peptídeos que formam a proteína VP4 inteira também foram imunoreativos, porém com baixa frequência na população de estudo. Nos resultados do HLA, nós encontramos alelos que mostram alta frequência nos grupos estudados: HLA A2, HLA B40, HLA Cw7, HLA DR11 and HLA DQ6. Nossos resultados foram comparados com os da coorte do LaViTE e mostraram correlação nos alelos HLA A2 e Cw7, e ainda poucas semelhanças nos HLA DR11 e DQ6. Assim, nosso estudo identificou vários epítopos de célula T reativos nas proteínas VP1 e VP4 do HAV. Estas informações podem ser significativamente relevantes para o desenvolvimento de uma vacina potencial baseada em epítopos reconhecidos por células T e restritos a alelos HLA humanos

O vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV-1) foi o primeiro retrovírus descrito e está etiologicamente ligado a duas principais doenças: a leucemia/linfoma de célula T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Apenas 0,3 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem essas doenças associadas, enquanto a maioria permanece assintomática. A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central e o mecanismo pelo qual o HTLV-1 induz o surgimento de HAM/TSP ainda não está totalmente esclarecido. Atualmente, uma abordagem promissora no entendimento de mecanismos, bem como na fisiopatogênese das infecções virais tem sido a avaliação da função de microRNAs (miRNAs). Há poucos dados na literatura envolvendo estas moléculas na infecção pelo HTLV-1 em linfócitos T CD4+ bem como no estabelecimento da doença HAM/TSP. No presente estudo, foi avaliada a expressão de miRNAs dos linfócitos T CD4+ isolados de portadores sem HAM/TSP (HAC), pacientes HAM/TSP e indivíduos sadios (CT) por meio de PCR em tempo real. A análise do perfil de expressão dos miRNAs nessas células revelou que 56 e 10 miRNAs apresentavamse mais 1,5 vezes aumentados no grupo HAM/TSP e HAC, respectivamente. O miR- 125b-1-1 apresentou expressão significamente maior no grupo HAC e o miR-146a, no grupo HAM/TSP. A análise in silico de predição de alvo demonstrou que o gene IFNG era potencialmente alvo do miR-125b-1-1 e os genes IRAK1 e TRAF6 do miR- 146a. Foi demonstrado que a expressão do IFNG no grupo HAC era 1,3 vezes mais elevado que o grupo CT e 1,8 vezes mais elevado no grupo HAM que no grupo CT. Houve um aumento na expressão de TRAF6 de 15,7 e 1,5 vezes nos grupos HAM/TSP e HAC, respectivamente. Não foi observada diferença na expressão de IRAK1 entre os três grupos. O ensaios de superexpressão do miR-125b-1-1 alterou a expressão do IFNG e do miR-146a alterou a expressão do gene IRAK1 e sua proteína. Os resultados evidenciados neste trabalho ressaltam a importância dos miRNAs na modulação de genes e proteínas importantes durante a infeção pelo HTLV-1. A correlação entre o miR-125b-1-1 e gene IFNG sugere que este miRNA esteja envolvido nos mecanismos de desenvolvimento de HAM/TSP. Além disso, a interação entre o miR-146a e os genes IRAK1 e TRAF6 sugerem que este miRNA esteja relacionado a mecanismos de persistência viral da infecção pelo HTLV-1 em linfócitos T CD4+. / Human T-cell lymphotropic vírus type 1 (HTLV-1) was the first human retrovirus discovered and it is related with two major diseases: adult T cell lymphoma/leukaemia (ATLL) and HTLV-1 -associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TS). About 0.3 to 5% of infected individuals will develop HTLV-1 related diseases, while the majority will remain life-long asymptomatic carriers of the virus. HAM/TSP is an inflammatory manifestation of central nervous system and the mechanism involved in HAM/TSP development is noy well elucidated. Currently, a promising approach on understanding the mechanisms as well as physiopathogenesis of viral infections has been the evaluation of the role of microRNAs (miRNAs) roles. There are few data involving CD4+ T cells miRNA expression in HTLV-1 infection as well as HAM/TSP establishment. To identify miRNAs differentially expressed in CD4+ T cells among non-infected individuals (CT), asymptomatic (HAC) and HAM/TSP patients we applied quantitative real time PCR. The analysis of miRNA expression profile in these cells showed 56 and 10 miRNAs upregulated 1.5 times in HAM/TSP and HAC groups, respectively. miR- 125b-1-1 was upregulated in HAC group and miR-146a in HAM/TSP. In silico analysis of target prediction showed that IFNG was a potentially miR-125b-1-1 target and IRAK1 and TRAF6 were miR-146a targets. IFNG expression was 1.3 higher in HAC than CT group and 1.8 higher in HAM/TSP than CT group. It was observed that TRAF6 expression was 15.7 and 1.5 times higher in HAM/TSP and HAC groups, respectively. There was no difference of IRAK1 expression among the three groups. Overexpression assays of miR-125b-1-1 altered IFNG expression and overexpression of miR-146a altered IRAK1 gene and protein expression. The results revealed that miRNAs modulate genes and proteins during HTLV-1 infection. miR- 125b-1-1 and IFNG gene correlation suggests that miR-125b-1-1 seems to contribute to HAM/TSP development. Besides, miR-146a and IRAK1 and TRAF6 interaction suggests that miT-146a seems to contribute to HTLV-1 establishment in CD4+ T cells.

O vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV-1) foi o primeiro retrovírus descrito e está etiologicamente ligado a duas principais doenças: a leucemia/linfoma de célula T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Apenas 0,3 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem essas doenças associadas, enquanto a maioria permanece assintomática. A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central e o mecanismo pelo qual o HTLV-1 induz o surgimento de HAM/TSP ainda não está totalmente esclarecido. Atualmente, uma abordagem promissora no entendimento de mecanismos, bem como na fisiopatogênese das infecções virais tem sido a avaliação da função de microRNAs (miRNAs). Há poucos dados na literatura envolvendo estas moléculas na infecção pelo HTLV-1 em linfócitos T CD4+ bem como no estabelecimento da doença HAM/TSP. No presente estudo, foi avaliada a expressão de miRNAs dos linfócitos T CD4+ isolados de portadores sem HAM/TSP (HAC), pacientes HAM/TSP e indivíduos sadios (CT) por meio de PCR em tempo real. A análise do perfil de expressão dos miRNAs nessas células revelou que 56 e 10 miRNAs apresentavamse mais 1,5 vezes aumentados no grupo HAM/TSP e HAC, respectivamente. O miR- 125b-1-1 apresentou expressão significamente maior no grupo HAC e o miR-146a, no grupo HAM/TSP. A análise in silico de predição de alvo demonstrou que o gene IFNG era potencialmente alvo do miR-125b-1-1 e os genes IRAK1 e TRAF6 do miR- 146a. Foi demonstrado que a expressão do IFNG no grupo HAC era 1,3 vezes mais elevado que o grupo CT e 1,8 vezes mais elevado no grupo HAM que no grupo CT. Houve um aumento na expressão de TRAF6 de 15,7 e 1,5 vezes nos grupos HAM/TSP e HAC, respectivamente. Não foi observada diferença na expressão de IRAK1 entre os três grupos. O ensaios de superexpressão do miR-125b-1-1 alterou a expressão do IFNG e do miR-146a alterou a expressão do gene IRAK1 e sua proteína. Os resultados evidenciados neste trabalho ressaltam a importância dos miRNAs na modulação de genes e proteínas importantes durante a infeção pelo HTLV-1. A correlação entre o miR-125b-1-1 e gene IFNG sugere que este miRNA esteja envolvido nos mecanismos de desenvolvimento de HAM/TSP. Além disso, a interação entre o miR-146a e os genes IRAK1 e TRAF6 sugerem que este miRNA esteja relacionado a mecanismos de persistência viral da infecção pelo HTLV-1 em linfócitos T CD4+. / Human T-cell lymphotropic vírus type 1 (HTLV-1) was the first human retrovirus discovered and it is related with two major diseases: adult T cell lymphoma/leukaemia (ATLL) and HTLV-1 -associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TS). About 0.3 to 5% of infected individuals will develop HTLV-1 related diseases, while the majority will remain life-long asymptomatic carriers of the virus. HAM/TSP is an inflammatory manifestation of central nervous system and the mechanism involved in HAM/TSP development is noy well elucidated. Currently, a promising approach on understanding the mechanisms as well as physiopathogenesis of viral infections has been the evaluation of the role of microRNAs (miRNAs) roles. There are few data involving CD4+ T cells miRNA expression in HTLV-1 infection as well as HAM/TSP establishment. To identify miRNAs differentially expressed in CD4+ T cells among non-infected individuals (CT), asymptomatic (HAC) and HAM/TSP patients we applied quantitative real time PCR. The analysis of miRNA expression profile in these cells showed 56 and 10 miRNAs upregulated 1.5 times in HAM/TSP and HAC groups, respectively. miR- 125b-1-1 was upregulated in HAC group and miR-146a in HAM/TSP. In silico analysis of target prediction showed that IFNG was a potentially miR-125b-1-1 target and IRAK1 and TRAF6 were miR-146a targets. IFNG expression was 1.3 higher in HAC than CT group and 1.8 higher in HAM/TSP than CT group. It was observed that TRAF6 expression was 15.7 and 1.5 times higher in HAM/TSP and HAC groups, respectively. There was no difference of IRAK1 expression among the three groups. Overexpression assays of miR-125b-1-1 altered IFNG expression and overexpression of miR-146a altered IRAK1 gene and protein expression. The results revealed that miRNAs modulate genes and proteins during HTLV-1 infection. miR- 125b-1-1 and IFNG gene correlation suggests that miR-125b-1-1 seems to contribute to HAM/TSP development. Besides, miR-146a and IRAK1 and TRAF6 interaction suggests that miT-146a seems to contribute to HTLV-1 establishment in CD4+ T cells.

Os linfócitos T têm um papel central no controle da infecção pelo HIV-1. As respostas mediadas por esses linfócitos contra epitopos do HIV-1 restritos a moléculas HLA de classe I podem estar associadas à proteção natural em indivíduos LTNP. Relatos sugerem que determinados alelos HLA apresentamse mais representados entre os LTNP. Para avaliar esses aspectos na coorte francesa ALT, coletamos células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de 24 indivíduos LTNP e verificamos a freqüência de respostas específicas para o HIV-1. Para isso, utilizamos pools de peptídeos sobrepostos de Gag e regiões imunodominantes da RT e Nef, e identificamos epitopos do HIV-1 restritos a moléculas HLA de classe I, associados ou não à proteção, através do ensaio de ELISPOT IFN-?. Todos os indivíduos apresentaram respostas específicas aos pools testados, com uma mediana de 5 (2-12). Todas as proteínas do HIV-1 foram reconhecidas, sendo que Gag-p24 e Nef foram as mais freqüentemente reconhecidas pelas CMSP dos indivíduos avaliados. A intensidade total de resposta de linfócitos T específicos aos pools de Gag, RT e Nef do HIV-1 em cada indivíduo variou de 160 a 12307 SFC/106 CMSP (mediana: 2025). Observamos o reconhecimento de 22 epitopos já descritos na literatura, contidos nas proteínas Gag-p17, Gag-p24 e Nef do HIV-1, restritos a moléculas HLA de classe I, a maioria descrita como protetoras da progressão para a doença. Quatro novos epitopos ainda não descritos na literatura também foram observados. Concluímos que: respostas específicas mediadas por linfócitos T, eficazes e dirigidas contra um amplo painel de epitopos do HIV-1, estão presentes nos indivíduos LTNP; a presença de moléculas HLA de classe I associadas à proteção favorece o reconhecimento preferencial de epitopos do HIV-1 restritos por elas na maioria dos indivíduos LTNP; esses aspectos devem ser levados em conta na perspectiva do desenvolvimento de uma vacina candidata contra o HIV-1. / T lymphocytes (T-L) have a paramount role in the control of HIV-1 infection. The responses mediated by these cells against HLA class I epitopes may be associated to the natural protection in long-term non-progressors (LTNP). The literature suggests that some HLA alleles relate to the protection against the immune dysfunction. The aim of this research is to study the recognition of HIV-1 Gag, Nef and RT epitopes by T-L through an ELISPOT IFN-? assay in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of 24 LTNP selected from French ALT study group. We evaluated the frequency of anti-HIV-1 responses and identified HLA class I epitopes. All individuals presented specific responses to the pools of peptides tested with a median of 5 (2-12). Gag-p24 and Nef were the most frequently recognized proteins. The magnitude of the responses varied from 160 to 12307 SFC/106 PBMC (median=2025). We observed the recognition of 22 epitopes already described in HIV-1 Gag-p17, Gag-p24 and Nef, restricted to HLA class I molecules reported as protective. We have also observed four new epitopes not already described in the literature. Our results suggest that: HIV-1 responses by T-L are present in LTNP; the presence of HLA class I molecules associated with protection in the majority of LTNP are related to the recognition of MHC restricted HIV-1 epitopes; these aspects must be taken into account in the development of a candidate vaccine against HIV-1.

Os linfócitos T têm um papel central no controle da infecção pelo HIV-1. As respostas mediadas por esses linfócitos contra epitopos do HIV-1 restritos a moléculas HLA de classe I podem estar associadas à proteção natural em indivíduos LTNP. Relatos sugerem que determinados alelos HLA apresentamse mais representados entre os LTNP. Para avaliar esses aspectos na coorte francesa ALT, coletamos células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de 24 indivíduos LTNP e verificamos a freqüência de respostas específicas para o HIV-1. Para isso, utilizamos pools de peptídeos sobrepostos de Gag e regiões imunodominantes da RT e Nef, e identificamos epitopos do HIV-1 restritos a moléculas HLA de classe I, associados ou não à proteção, através do ensaio de ELISPOT IFN-?. Todos os indivíduos apresentaram respostas específicas aos pools testados, com uma mediana de 5 (2-12). Todas as proteínas do HIV-1 foram reconhecidas, sendo que Gag-p24 e Nef foram as mais freqüentemente reconhecidas pelas CMSP dos indivíduos avaliados. A intensidade total de resposta de linfócitos T específicos aos pools de Gag, RT e Nef do HIV-1 em cada indivíduo variou de 160 a 12307 SFC/106 CMSP (mediana: 2025). Observamos o reconhecimento de 22 epitopos já descritos na literatura, contidos nas proteínas Gag-p17, Gag-p24 e Nef do HIV-1, restritos a moléculas HLA de classe I, a maioria descrita como protetoras da progressão para a doença. Quatro novos epitopos ainda não descritos na literatura também foram observados. Concluímos que: respostas específicas mediadas por linfócitos T, eficazes e dirigidas contra um amplo painel de epitopos do HIV-1, estão presentes nos indivíduos LTNP; a presença de moléculas HLA de classe I associadas à proteção favorece o reconhecimento preferencial de epitopos do HIV-1 restritos por elas na maioria dos indivíduos LTNP; esses aspectos devem ser levados em conta na perspectiva do desenvolvimento de uma vacina candidata contra o HIV-1. / T lymphocytes (T-L) have a paramount role in the control of HIV-1 infection. The responses mediated by these cells against HLA class I epitopes may be associated to the natural protection in long-term non-progressors (LTNP). The literature suggests that some HLA alleles relate to the protection against the immune dysfunction. The aim of this research is to study the recognition of HIV-1 Gag, Nef and RT epitopes by T-L through an ELISPOT IFN-? assay in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of 24 LTNP selected from French ALT study group. We evaluated the frequency of anti-HIV-1 responses and identified HLA class I epitopes. All individuals presented specific responses to the pools of peptides tested with a median of 5 (2-12). Gag-p24 and Nef were the most frequently recognized proteins. The magnitude of the responses varied from 160 to 12307 SFC/106 PBMC (median=2025). We observed the recognition of 22 epitopes already described in HIV-1 Gag-p17, Gag-p24 and Nef, restricted to HLA class I molecules reported as protective. We have also observed four new epitopes not already described in the literature. Our results suggest that: HIV-1 responses by T-L are present in LTNP; the presence of HLA class I molecules associated with protection in the majority of LTNP are related to the recognition of MHC restricted HIV-1 epitopes; these aspects must be taken into account in the development of a candidate vaccine against HIV-1.

A persistência de células T de memória funcionais é importante para garantir uma imunidade protetora na infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). As células T de memória têm sido subdivididas em memória central (TCM), memória efetora (TEM) e memória efetora altamente diferenciada (TEMRA) com base na expressão de moléculas de superfície como CCR7 e CD45RA, e na capacidade de produzir citocinas e proliferar. Recentemente, identificamos 18 peptídeos derivados de seqüências do consenso B do HIV-1, ligadores de múltiplas moléculas HLA-DR e amplamente reconhecidos por linfócitos T de sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV. Diante disso e considerando a importância das células T de memória na manutenção da resposta imune específica, nosso objetivo foi caracterizar fenotípica e funcionalmente as subpopulações de células T de memória de indivíduos infectados pelo HIV envolvidas no reconhecimento in vitro desses epitopos. Foram incluídos 14 indivíduos controles sadios e 61 pacientes HIV+ com contagem de linfócitos T CD4+ maior que 250 células/mm3. Os pacientes HIV+ foram divididos em seis diferentes grupos clínicos de acordo com o estágio da infecção, carga viral (CV) plasmática e uso de terapia anti-retroviral (ART): não progressores por longo tempo (LTNP), avirêmicos em uso de ART (AV-ART), virêmicos em uso de ART (VI-ART), virêmicos sem uso de ART (VI sem ART), virêmicos recéminfectados sem uso de ART (VI-RI) e controladores. Células mononucleares do sangue periférico dos indivíduos do estudo foram estimuladas com o conjunto de peptídeos do HIV-1 e com um conjunto de peptídeos do Citomegalovírus (CMV). A freqüência de células de memória produtoras de IFN- e IL-2 e a proliferação celular antígeno-específica foram detectadas por citometria de fluxo de multiparâmetros. Nossos resultados mostraram que o conjunto de peptídeos do HIV-1 foi capaz de ativar subpopulações funcionais de memória TCM, TEM e TEMRA secretoras de IFN- e IL-2 em 100% dos pacientes HIV+ dos diferentes grupos clínicos. O conjunto de peptídeos do HIV-1 também induziu proliferação das subpopulações de linfócitos T de memória. As freqüências de TEMRA CD4+IFN-+, TEMRA CD4+IFN-+ total, TCM CD8+IFN-+, TCM CD8+IFN-+ total, TEM CD8+IFN-+, TEM CD8+IFN-+ total e TEMRA CD8+IFN-+ correlacionaram-se negativamente com a carga viral do HIV em pacientes virêmicos. Esses dados sugerem que essas subpopulações de memória funcionais são importantes no controle da viremia. Comparando as respostas HIV e CMVespecíficas observamos freqüências mais elevadas de células T de memória produtoras de IL-2, IFN-/IL-2 e IFN- em respostas ao pool de peptídeos do HIV. Esses dados sugerem que esse conjunto de peptídeos derivados de seqüências do HIV-1 ativa respostas polifuncionais de subpopulações de linfócitos T de memória. Nossos resultados mostraram que o conjunto de peptídeos do HIV-1 foi capaz de estimular diferentes subpopulações distintas de linfócitos T de memória produtores de IFN-, IFN-,/IL-2 e IL-2 de indivíduos em diferentes estágios da infecção pelo HIV e sugerem o envolvimento de subpopulações de memória funcionais no controle da viremia. Estes achados fortalecem a possibilidade de uso desses peptídeos em uma formulação vacinal bem-sucedida em humanos / The persistence of functional memory T cell is important to ensure a protective immunity to Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection. Memory T cells have been subdivided into central memory (TCM), effector memory (TEM) and highly differentiated effector memory (TEMRA) based on the expression of surface molecules such as CCR7 and CD45RA, and the ability to produce cytokines and proliferate. Recently, we identified 18 peptides derived from B consensus sequences of HIV-1 that bind to multiple HLA-DR molecules and are widely recognized by peripheral blood T lymphocytes from HIV-infected patients. Given this and considering the importance of memory T cells in the maintenance of specific immune response, our objective was to characterize phenotypic and functionally memory T cell subsets from HIV-infected individuals involved in the recognition of these epitopes in vitro. The study included 14 healthy control subjects and 61 HIV+ patients with CD4+ lymphocytes counts higher than 250 cells/mm3. The HIV+ patients were divided into six different clinical groups according to the stage of infection, plasma viral load (VL) and antiretroviral therapy use (ART): long-term non-progressors (LTNP), aviremic under ART (AV-ART), viremic under ART (VI-ART), viremic without using ART (VI without ART), recently infected viremic without using ART (VI-RI) and controllers. Peripheral blood mononuclear cells from study subjects were stimulated with HIV-1 peptide pool and with a cytomegalovirus (CMV) peptide pool. The frequencies of IFN- and IL-2 producing memory cells and antigenspecific cell proliferation were detected by multiparametric flow cytometry. Our results showed that the HIV-1 set of peptides was able to activate TCM, TEM and TEMRA functional memory subsets that secrete IFN- and IL-2 in 100% of the HIV patients from the different clinical groups. The HIV-1 set of peptides also induced memory T lymphocyte subsets proliferation. TEMRA CD4+IFN-+, total TEMRA CD4+IFN-+, TCM CD8+IFN-+, total TCM CD8+IFN-+, total TEM CD8+IFN-+, TEM CD8+IFN-+ and TEMRA CD8+IFN- + frequencies negatively correlated with HIV viral load in viremic patients. These data suggest that these functional memory subsets are important to control the viremia. When comparing the HIV and CMV-specific responses we observed higher frequencies of IL-2, IFN-/IL-2 and IFN- producing memory T cells in response to HIV peptide pool. These data suggest that this set of HIV sequence derived peptides activates polyfunctional response of memory T lymphocyte subsets. Our results showed that the HIV-1 peptide set was able to stimulate different IFN-, IFN-/IL-2 e IL-2 producing memory T lymphocytes from individuals in different stages of HIV infection and suggest the involvement of functional memory subsets in the control of viremia. These findings strengthen the possibility of using these peptides in a successful vaccine formulation in humans

Em 1993, a Organização Mundial da Saúde declarou a tuberculose (TB) como uma emergência global devido à sua relevância epidemiológica e a necessidade de seu controle. Atualmente, a TB ainda é considerada um problema de saúde pública e requer o desenvolvimento de vacinas e terapias que sejam mais eficazes na sua prevenção e tratamento. Nesse sentido, o Laboratório de Vacinas Gênicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto estuda há mais de dez anos a eficácia da vacina gênica DNAhsp65 na profilaxia e terapia da TB. Com o intuito de complementar o conhecimento existente sobre os mecanismos imunes desencadeados pela vacina DNAhsp65, assim como sua associação às drogas convencionais utilizadas no tratamento da TB, objetivou-se neste trabalho a caracterização de células natural killer (NK), T natural killer (NKT), e T ?? na imunoterapia da tuberculose experimental com a vacina DNAhsp65, no tratamento com as drogas rifampicina (RIF) e isoniazida (INH), e na associação DNAhsp65-drogas. Inicialmente, camundongos BALB/c foram infectados com Mycobacterium tuberculosis (Mtb) cepa H37Rv no dia 0 e nos dias 1, 7, 15, 30 e 70 após a infecção, foi promovida a eutanásia dos animais infectados ou não (controle) para análise das células T não convencionais no pulmão por citometria de fluxo. No dia 30 após a infecção, os animais infectados receberam os diferentes tratamentos: vacina DNAhsp65, vetor pVAX1, drogas RIF e INH, ou as drogas em associação à vacina. Dez dias após o fim dos tratamentos, foi promovida a eutanásia dos animais para análise das populações celulares no pulmão e linfonodo por citometria de fluxo, imunohistoquímica e PCR em tempo real. Os animais somente infectados com Mtb apresentaram aumento significativo no número das células NK (CD3-CD49b+), NKT (CD3+CD49b+) e T ?? (CD3+??+) logo na primeira semana após a infecção, e esta diferença em relação aos animais controle permaneceu em até 70 dias após a infecção. Entre as células NK presentes no pulmão, observou-se predominância da subpopulação CD11bhighCD27low em todos os animais. Nos animais infectados, verificou-se aumento significativo das subpopulações de NK: CD11bhighCD27high e CD11blowCD27high, nos dias 7 e 15 e somente no dia 15 após a infecção, respectivamente. Entre a população de células T ?? presentes no pulmão, houve predomínio do fenótipo CD27- em animais controles e infectados nos diferentes tempos experimentais. Quanto aos animais infectados com Mtb e tratados com DNAhsp65, verificou-se aumento significativo de células T ?? produtoras de IFN-? e IL-17 no pulmão, e apesar de não ter sido observada diferença na freqüência de células NK e NKT neste grupo, as células NK apresentavam maior expressão da molécula FasL relacionada à morte celular induzida por apoptose. Nos grupos drogas e DNAhsp65-drogas observou-se aumento da freqüência de células T ?? no pulmão, assim como aumento de células NK produtoras de IL-10 e que expressavam o marcador de ativação CD69. Os resultados deste trabalho mostram mais uma vez a eficácia da vacina DNAhsp65 e da associação DNAhsp65- drogas no tratamento de animais infectados com Mtb e sugerem que células T não convencionais como as células NK, NKT e T ?? podem participar na modulação da resposta immune na TB. Estes achados devem ser levados em consideração no desenho de novas estratégias terapêuticas e também profiláticas para a TB. / In 1993, the World Health Organization declared tuberculosis (TB) as a global emergence due to its epidemical relevance and the need to improve its control. Nowadays, TB still remains a public health problem and requires the development of more effective vaccines and therapies. In this sense, the Laboratory of Genetic Vaccines from the School of Medicine of Ribeirão Preto studies, for more than ten years, the efficiency of the genetic vaccine DNAhsp65 in TB prophylaxis and therapy. In order to complement the knowledge about the immune mechanisms triggered by DNAhsp65 vaccine and by its association with conventional drugs used in TB, our aim in this work was to characterize natural killer (NK), natural killer T (NKT) and gamma-delta (??) T cells in the immunotherapy of experimental tuberculosis with the DNAhsp65 vaccine, in the treatment with rifampicin and isoniazid drugs and in the association DNAhsp65-drugs. Initially, BALB/c mice were infected with Mtb strain H37Rv on day 0, and on days 1, 7, 15, 30 and 70 after infection, infected animals or not (control) were euthanized for lung cell analysis by flow cytometry. On day 30 after infection, infected animals received the following treatment: DNAhsp65 vaccine, pVAX1 vector, rifampicin and isoniazid drugs, or drugs in association with DNAhsp65. Ten days after the end of treatment, animals were euthanized for lung and lymph node cell analysis by flow cytometry, immunohistochemistry and real time PCR. Infected animals showed a significant increase of NK (CD3-CD49b+), NKT (CD3+CD49b+) and ?? (CD3+??+) T cells in the first week of infection and this difference compared to control animals remained until 70 days after infection. Within the lung NK cell population, we observed a predominance of CD11bhighCD27low phenotype in all animals. In infected animals, we verified a significant increase of the following NK cell subpopulations: CD11bhighCD27high and CD11blowCD27high on days 7 and 15, and only on day 15 after infection, respectively. Within the lung ?? T cell population, there was a predominance of CD27- ?? T cell in control and infected animals in the different experimental times. In infected animals and subsequently vaccinated with DNAhsp65, we verified a significant increase in ?? T cells producing IFN-? and IL-17 in the lungs. Although we have not seen any differences in NK and NKT cells in this group, NK cells showed higher expression of FasL molecule related to induced cell death by apoptosis. In DNAhsp65-drugs and drugs groups, we observed an increase in lung ?? T cells frequency, as well as increase in NK cells producing IL-10 and expressing CD69, an activation marker. Our results confirm the effectiveness of DNAhsp65 vaccine and its association with drugs in Mtb infected animals and suggest a modulation in the immune response through unconventional T cells such as NK, NKT and ?? T cells. These findings should be taken into consideration in the design of new therapeutic and prophylactic strategies for TB.

A erliquiose monocitotrópica canina é caracterizada como uma infecção persistente, podendo evoluir para doença fatal. Mecanismos imunopatogênicos estão implicados no desenvolvimento da doença, porém não é completamente compreendido o papel da resposta imune celular nas infecções causadas por Ehrlichia canis transmitida pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus. A infecção do vetor ocorre somente durante o repasto em cães riquetsêmicos, porém não é reconhecido o nível de riquetsemia infectante durante o curso da infecção nos cães. O objetivo desse estudo foi verificar os níveis de riquetsemia relativa capazes de infectar o vetor (R. sanguineus) durante o curso da erliquiose canina; e avaliar a resposta imune celular induzida por exposição de cães a carrapatos infectados com Ehrlichia canis. Um cão foi utilizado para produção do inoculo e infecção de ninfas de R. sanguineus. Subseqüentemente, os carrapatos adultos infectados, oriundos das ninfas que se alimentaram nos cães infectados, foram utilizados para infecção dos cães dos grupos I (n=3) e II (n=3). Cães do grupo III (n=3) foram inoculados com sangue infectado com E. canis, por via intravenosa. Os grupos IV (n=3) e V (n=3) foram compostos por cães não infectados. Os grupos II e IV foram reinfestados periodicamente com ninfas não infectadas de R. sanguineus. Foram observadas, alterações clínicas como febre, apatia e disorexia nos cães infectados, durante a fase aguda da infecção, porém de forma mais intensa e precoce nos cães infectados por inoculação intravenosa (grupo III). As alterações hematológicas mais evidentes foram redução do número de plaquetas, leve redução na série vermelha e branca. Todos os animais infectados soroconverteram aos 14 dias após inoculação ou infestação com carrapatos infectados (dpi), mantendo títulos entre 10240 e 81920. Os níveis de riquetsemia foram variáveis durante o curso da infecção, persistindo até 364 dpi, porém mais constante na fase aguda da doença. Um pequeno número de carrapatos alimentados nos cães infectados apresentou amplificação de DNA de E. canis, porém foram demonstrados até 308 dpi. Foi observada uma redução na relação CD4:CD8 nos animais infectados, no 28° dpi, mantendo-se de forma mais branda até 252 dpi. Uma maior proporção de linfócitos T CD4+ produtores de IFN-γ e IL-4 foi observada no tempo zero de cães que não adquiriram infecção após infestação com carrapatos infectados. Os níveis séricos de citocinas mostraram de forma mais evidente a elevação de IL-10 e TNF-α em um cão que desenvolveu doença fatal, podendo indicar a participação de mecanismos imunes na apresentação clínica e na persistência do agente no organismo hospedeiro. / The canine monocytic ehrlichiosis is characterized as a persistent infection, which can develop fatal disease. Immunopathogenic mechanisms are implicated in the development of the disease, however it is not completely understood the role of cellular immune in the infection caused by Ehrlichia canis transmitted by the tick Rhipicephalus sanguineus. The vector becomes infected only while feeding on rickettsemic dogs, however the level of rickettsemia is not recognized during the course of the infection in the dogs. The objective of this study was to verify the level of relative rickettsemia capable to infect the vector (R. sanguineus) during the course of the canine ehrlichiosis; and to evaluate the cellular immune induced in dogs exposed to Ehrlichia canis-infected ticks. A dog was used for production of the inoculum and infection of nymphs of R. sanguineus. Infected adult ticks that had fed as nymphs on the infected dog were used to feed on and transmit the infection to dogs of groups I (n=3) and II (n=3). Group III dogs (n=3) were intravenously inoculated with E. canis-infected dogs. Group IV (n=3) and V (n=3) dogs were the control groups, never exposed to E. canis. Dogs of groups II and IV were reinfested periodically with uninfected R. sanguineus nymphs. Clinical alterations such as fever, apathy and dysorexia were observed in the infected dogs during the acute phase of the infection, however in a more intense and precocious form in the dogs infected by intravenous inoculation (group III). The more evident hematological alterations were reduction of the number of platelets, mild reduction in the red and white cells series. All infected animals soroconverted by 14 days after inoculation or infestation by infected ticks (dpi), showing titers between 10240 and 81920 during the study. The rickettsemia levels were variable during the course of the infection, persisting up to 364 dpi, however more constant in the acute phase of the disease. A small number of ticks that fed on infected dogs presented amplification of E. canis DNA, however they were demonstrated up to 308 dpi. A reduction in the relationship CD4:CD8 in the infected animals was observed in 28th dpi, keeping in a mild form up to 252 dpi. A larger proportion of lymphocytes T CD4+ producing IFN-γ and IL-4 it was observed in the zero time of dogs that did not acquire infection after infestation with infected ticks. The cytokine seric levels showed the elevation in a more evident form of IL-10 and TNF-α in a dog that developed fatal disease, what could indicate the participation of immune mechanisms in the clinical presentation and in the persistence of the agent in the organism host.

Em 1993, a Organização Mundial da Saúde declarou a tuberculose (TB) como uma emergência global devido à sua relevância epidemiológica e a necessidade de seu controle. Atualmente, a TB ainda é considerada um problema de saúde pública e requer o desenvolvimento de vacinas e terapias que sejam mais eficazes na sua prevenção e tratamento. Nesse sentido, o Laboratório de Vacinas Gênicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto estuda há mais de dez anos a eficácia da vacina gênica DNAhsp65 na profilaxia e terapia da TB. Com o intuito de complementar o conhecimento existente sobre os mecanismos imunes desencadeados pela vacina DNAhsp65, assim como sua associação às drogas convencionais utilizadas no tratamento da TB, objetivou-se neste trabalho a caracterização de células natural killer (NK), T natural killer (NKT), e T ?? na imunoterapia da tuberculose experimental com a vacina DNAhsp65, no tratamento com as drogas rifampicina (RIF) e isoniazida (INH), e na associação DNAhsp65-drogas. Inicialmente, camundongos BALB/c foram infectados com Mycobacterium tuberculosis (Mtb) cepa H37Rv no dia 0 e nos dias 1, 7, 15, 30 e 70 após a infecção, foi promovida a eutanásia dos animais infectados ou não (controle) para análise das células T não convencionais no pulmão por citometria de fluxo. No dia 30 após a infecção, os animais infectados receberam os diferentes tratamentos: vacina DNAhsp65, vetor pVAX1, drogas RIF e INH, ou as drogas em associação à vacina. Dez dias após o fim dos tratamentos, foi promovida a eutanásia dos animais para análise das populações celulares no pulmão e linfonodo por citometria de fluxo, imunohistoquímica e PCR em tempo real. Os animais somente infectados com Mtb apresentaram aumento significativo no número das células NK (CD3-CD49b+), NKT (CD3+CD49b+) e T ?? (CD3+??+) logo na primeira semana após a infecção, e esta diferença em relação aos animais controle permaneceu em até 70 dias após a infecção. Entre as células NK presentes no pulmão, observou-se predominância da subpopulação CD11bhighCD27low em todos os animais. Nos animais infectados, verificou-se aumento significativo das subpopulações de NK: CD11bhighCD27high e CD11blowCD27high, nos dias 7 e 15 e somente no dia 15 após a infecção, respectivamente. Entre a população de células T ?? presentes no pulmão, houve predomínio do fenótipo CD27- em animais controles e infectados nos diferentes tempos experimentais. Quanto aos animais infectados com Mtb e tratados com DNAhsp65, verificou-se aumento significativo de células T ?? produtoras de IFN-? e IL-17 no pulmão, e apesar de não ter sido observada diferença na freqüência de células NK e NKT neste grupo, as células NK apresentavam maior expressão da molécula FasL relacionada à morte celular induzida por apoptose. Nos grupos drogas e DNAhsp65-drogas observou-se aumento da freqüência de células T ?? no pulmão, assim como aumento de células NK produtoras de IL-10 e que expressavam o marcador de ativação CD69. Os resultados deste trabalho mostram mais uma vez a eficácia da vacina DNAhsp65 e da associação DNAhsp65- drogas no tratamento de animais infectados com Mtb e sugerem que células T não convencionais como as células NK, NKT e T ?? podem participar na modulação da resposta immune na TB. Estes achados devem ser levados em consideração no desenho de novas estratégias terapêuticas e também profiláticas para a TB. / In 1993, the World Health Organization declared tuberculosis (TB) as a global emergence due to its epidemical relevance and the need to improve its control. Nowadays, TB still remains a public health problem and requires the development of more effective vaccines and therapies. In this sense, the Laboratory of Genetic Vaccines from the School of Medicine of Ribeirão Preto studies, for more than ten years, the efficiency of the genetic vaccine DNAhsp65 in TB prophylaxis and therapy. In order to complement the knowledge about the immune mechanisms triggered by DNAhsp65 vaccine and by its association with conventional drugs used in TB, our aim in this work was to characterize natural killer (NK), natural killer T (NKT) and gamma-delta (??) T cells in the immunotherapy of experimental tuberculosis with the DNAhsp65 vaccine, in the treatment with rifampicin and isoniazid drugs and in the association DNAhsp65-drugs. Initially, BALB/c mice were infected with Mtb strain H37Rv on day 0, and on days 1, 7, 15, 30 and 70 after infection, infected animals or not (control) were euthanized for lung cell analysis by flow cytometry. On day 30 after infection, infected animals received the following treatment: DNAhsp65 vaccine, pVAX1 vector, rifampicin and isoniazid drugs, or drugs in association with DNAhsp65. Ten days after the end of treatment, animals were euthanized for lung and lymph node cell analysis by flow cytometry, immunohistochemistry and real time PCR. Infected animals showed a significant increase of NK (CD3-CD49b+), NKT (CD3+CD49b+) and ?? (CD3+??+) T cells in the first week of infection and this difference compared to control animals remained until 70 days after infection. Within the lung NK cell population, we observed a predominance of CD11bhighCD27low phenotype in all animals. In infected animals, we verified a significant increase of the following NK cell subpopulations: CD11bhighCD27high and CD11blowCD27high on days 7 and 15, and only on day 15 after infection, respectively. Within the lung ?? T cell population, there was a predominance of CD27- ?? T cell in control and infected animals in the different experimental times. In infected animals and subsequently vaccinated with DNAhsp65, we verified a significant increase in ?? T cells producing IFN-? and IL-17 in the lungs. Although we have not seen any differences in NK and NKT cells in this group, NK cells showed higher expression of FasL molecule related to induced cell death by apoptosis. In DNAhsp65-drugs and drugs groups, we observed an increase in lung ?? T cells frequency, as well as increase in NK cells producing IL-10 and expressing CD69, an activation marker. Our results confirm the effectiveness of DNAhsp65 vaccine and its association with drugs in Mtb infected animals and suggest a modulation in the immune response through unconventional T cells such as NK, NKT and ?? T cells. These findings should be taken into consideration in the design of new therapeutic and prophylactic strategies for TB.

Introduction: Sickle cell anemia (SCA) is one of the most common genetic disorders in the world. However, until recently, only the direct consequences of the deoxyHbS polymerization was used to explain the pathophysiology of the disease. Currently, it is known that the clinical repercussions of FA involve complex interactions between the erythrocyte, endothelium and leukocytes: cytokines secreted by inflammatory cells are involved in SCA crisis and in the maintenance of a systemic inflammatory status, suggesting that T cells (Helpers and Cytotoxics) and NK have a fundalmental role in the clinical phenomena of SCA. This study aims to evaluate the profile of T and NK lymphocytes in patients with AF and compare them with the profile of individuals with sickle cell trait and individuals without hemoglobinopathies. Materials and methods: Peripheral blood was collected from 13 individuals; 7 with SS hemoglobinopathy (SS group), 5 with sickle cell trait (AS group) and 5 normal (AA group). The lymphocytes isolation for analysis was performed using Ficoll-Hypaque solution. Immunophenotyping for the determination of lymphocyte subtypes was performed by flow cytometry, using eight-color cytometer and eight BD Biosciences antibodies. Data were analyzed using Flowjo software and tabulated in SPSS IBM 22.0. The results referring to the numerical variables were expressed through measures of central tendency. Results: A lower frequency of T lymphocytes and a greater frequency of NK cells were observed in sickle cell patients.The variation of TCD4 + found between the SCA and the AA group was significant (p = 0.04). Lower frequency tendency in patients of the SS group remained for B lymphocytes. A higher frequency of NK cells was observed in patients with sickle cell anemia (mean: group AA = 15.63%, group AS = 14.82% and group SS = 23.34%) with statistically significant variation. Conclusion: SCA patients present a lower frequency of CD4 + CD8 + T cells and TNK cells when compared with HbAS individuals and individuals without hemoglobinopathies. An increasing and progressive frequency of NK cells is observed between groups AA, AS and SS. We believe that further studies are needed to understand the role of these cells in the genesis of systemic inflammation of SCA. This understanding may contribute to the development of new therapeutic strategies. / INTRODUÇÃO: A anemia falciforme (AF) é uma das desordens genéticas mais comuns do mundo. Entretanto, até pouco tempo atrás, apenas as consequências diretas da polimerização da desoxiHbS explicava a fisiopatogenia da doença. Atualmente, sabe-se que as repercussões clíncas da AF envolvem interações complexas entre o eritrócito, endotélio e leucócitos: citocinas secretadas por células inflamatórias estão envolvidas nas crises e na manutenção de um status inflamatório sistêmico, o que sugere que as células T (auxiliares e citotóxicas) e NK têm papel fundalmental nos fenômenos clínicos da AF. Este estudo visa avaliar o perfil de linfócitos T e NK em portadores de AF e comparar com o perfil de indivíduos com traço falciforme e indivíduos sem hemoglobinopatias. MATERIAIS E MÉTODOS: Foi coletado sangue periférico de 17 indivíduos; 7 com hemoglobinopatia SS (grupo SS), 5 com traço falciforme (grupo AS) e 5 normais (grupo AA). Todos confirmados por eletroforese de hemoglobina. Amostras de pacientes hemotransfundidos 30 dias antes ou em uso de antiinflamatórios 2 dias antes da coleta foram excluídas. O isolamento dos linfócitos para análise foi realizado utilizando solução de Ficoll-Hypaque. A imunofenotipagem para determinação dos subtipos linfocitários foi realizada por citometria de fluxo, utilizando citômetro de oito cores e oito anticorpos da BD Biosciences. Os dados foram analisados com auxílio do software Flowjo e tabulados no SPSS IBM 22.0. Os resultados referentes às variáveis numéricas foram expressos através de medidas de tendência central: média e valores mínimos e máximos. RESULTADOS: Globalmente foi observada menor frequência de linfócitos T e maior frequência de células NK nos pacientes falcêmicos, com média de 31,2% de TCD4+ contra 43,47% do grupo AS e 45,37% do grupo AA. Para os linfócitos TCD8+, o grupo SS obteve média de 12,64% contra 17,1% do AS e 16,42% do AA. A variação de TCD4+ encontrada entre os pacientes AF e o grupo AA foi significativa (p=0,04). Tendência de menor frequência em pacientes do grupo SS se manteve para os linfócitos B. Foi observada maior frequência de células NK em pacientes portadores de anemia falciforme (média do grupo AA=8,83%; AS=11,2% e grupo SS=19,6%), respectivamente, com diferença significativa entre o grupo AA e o grupo SS (p=0,040). CONCLUSÃO: Portadores de AF apresentam tendência de menor frequência de linfócitos T, com diferença significativamente menor comparado ao portador de traço e o paciente portador de AF, para linfócitos T CD4+ verificou-se redução significativa deste subtipo celular entre grupo SS e AA. Neste estudo também foi evidenciado uma frequência crescente e progressiva de células NK entre os grupos AA, AS e SS. Acreditamos que mais estudos são necessários visando compreender o papel destas células na gênese da inflamação sistêmica da AF. Este entendimento possivelmente contribuirá para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. / Aracaju, SE