In der vorliegenden Studie haben wir mit Hilfe von SHARP-Screening, einer 16S-rRNA-basierten Heterogenitäts- und phylogenetischen Analyse, die mikrobielle Diversität in entzündlichen Lymphadenitiden ohne vorherige Kenntnis der jeweiligen Erreger an einer Serie von 15 Lymphknoten untersucht. Die Methode wurde erstmals auf diese Fragestellung angewandt. Sie konnte für die Verwendung von paraffineingebettetem Gewebe adaptiert werden, so dass auch Gewebeproben analysiert werden konnten, von denen kein Gefriermaterial zur Verfügung stand und die in Routineverfahren eingebettet und nach Standardmethoden gefärbt wurden. SHARP-Screening beinhaltet zwei komplementäre Schritte: Zuerst erfolgte die Erstellung einer Genbank aller bakteriellen Gene aus der gesamten extrahierten DNA des analysierten Gewebes durch gezielte Amplifikation des 16S-rRNA-Gens mittels universeller eubakterieller Primer. Als zweiter Schritt wurde nach der Transformation mittels Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus die Selektion der jeweiligen unterschiedlichen Phylotypen der enthaltenen 16S-rRNA-Gene durchgeführt (insgesamt 400). Nach der Sequenzierung wurden die 16S-rRNA-Gene durch den Vergleich mit bekannten bakteriellen Sequenzen mit Hilfe des „Basic-Local-Alignment-Search-Tool“ (BLAST) identifiziert. SHARP-Screening hat sich als geeignete Methode zur Analyse der gesamten, in einer Gewebeprobe enthaltenen bakteriellen Flora erwiesen. Dabei wurden zum Teil andere Erreger gefunden, als aus dem histologischen Bild vermutet wurden. So konnte zum Beispiel mit dem Nachweis von Gluconacetobacter sacchari, als potentieller Erreger einer septischen Granulomatose, eine alternative Differentialdiagnose zur histologisch vermuteten Katzenkratzkrankheit aufgezeigt werden. Darüber hinaus konnten auch gleichartige histologische Bilder bei dem gleichen identifizierten Erreger beobachtet werden. Zum Beispiel konnten im Zusammenhang mit dem Auftreten von Ödemen, Nekrosen, granulomatös eitrigen Veränderungen und einer ausgeprägten Sinus-histiozytose im Lymphknotengewebe immer wieder Comamonadaceae bzw. Janthinobacterium nachgewiesen werden. Oft zeigte sich nicht ein einzelner Erreger der Lymphadenitis, sondern ein ganzes Spektrum, wobei aus dem Vorhandensein der 16S-rRNA nicht auf das Vorhandensein vitaler Erreger geschlossen werden kann. Dennoch erlaubt die Häufigkeit der entsprechenden Klone eine semiquantitative Abschätzung der Bedeutung des jeweiligen Erregers. So wies SHARP-Screening auch Homologien zu Paracoccus yeeii nach. Eine Spezies, die mit klassischen Methoden häufig übersehen wird, die in Lymphknoten jedoch eine pathogene Rolle spielen kann. Im Zusammenhang mit dem histologischen Verdacht auf ein Malignom wurden in einigen Fällen Streptomyces, Roseomonas gilardii rosea und Stenotrophomonas maltophila nachgewiesen, die auch in der Literatur häufig bei immunsupprimierten Patienten vorkommen. Bei dem Verdacht auf ein Lymphgranuloma venerum wurde eine Cyanobacterium-Spezies detektiert, die es nach Literaturangaben Chlamydia trachomatis erst möglich macht, den eigenen Aminosäurestoffwechsel zu betreiben. Insgesamt dürften vom SHARP-Screening noch weitere tiefgreifende Erkenntnisse der bakteriellen Diversität und kausaler Erregerassoziationen in Erkrankungen des lymphatischen Systems zu erwarten sein. / The focus of this study was laid on the analysis of the microbial diversity in inflammatory lymphadenitis of 15 different lymph nodes without prior knowledge of the respective causative organism with help of the SHARP-Screening, a 16S-rRNA-based heterogeneity and phylogenetic analysis. This represents the first study to analyse this problem with the above mentioned SHARP-Screening adapting the method for the utilization of paraffin embedded tissue which consequently allowed the analysis of tissue specimen of which no freezing material was available and which were embedded in routine procedures as well as coloured according to a standard approach. The SHARP-Screening compromises two complementary steps: The first step is the creation of a gene pool of all bacterial genes of the entire DNA extracted from the analysed tissue by the systematic amplification of the 16S-rRNA-gene by means of universal eubacterial primers. The next step after the transformation was the selection of the different phylotypes of the incorporated 16S-rRNA-genes (altogether 400) by analysing the restriction fragment length polymorphism (RFLP). After the sequencing, the 16S-rRNA-genes were identified by comparing them with the known bacterial sequences with help of the “Basic-Local-Alignment-Search-Tool” (BLAST). The SHARP-Screening has proved itself as an adequate method to analyse the entire bacterial flora contained in the tissue sample. In some cases different causative organisms were found in contrast to the expectations which arose from the histological pictures. In this way evidence of gluconacetobacter sacchari could be provided as potential causative agents of a septic granulomatosis, an alternative differential diagnosis to the histologically assumed cat scratch disease. Furthermore, histological pictures of a similar type could be observed with regard to the same identified causative organism. For example, in conjunction with the appearance of edema, necrosis, granulomatosic purulent alterations and a very pronounced sinushistiozytosis in the lymph node tissue, comamonadaceae and accordingly janthinobacteria could consistently be demonstrated. A lot of times not just a single causative organism but a whole spectrum of the lymphadenitis could be identified. Here, however, the existence of the 16S-rRNA cannot be attributed to the existence of vital causative agents. Nevertheless, the frequency of the respective clones allows a semi quantitative assessment of the importance of the corresponding causative agents. Thus the SHARP-Screening proved evidence of homologies to paracoccus yeeii. A species which is often missed with classic methods however can play a pathogenic role. In several cases streptomyces, roseomonas gilardii rosea and stenotrophomonas maltophila, which are often mentioned in literature with regard to immunosuppressed patients, could be demonstrated in connection with the histological suspicion of a malignant tumour. While suspecting a lymphgranuloma venerum, a cyanobacterium species was discovered which according to literature sources enables chlamydia trachomatis to operate the body’s amino acid metabolism. Altogether, the SHARP-Screening is expected to lead to even more profound findings of bacterial diversity and causal causative organism associations with regard to diseases of the lymphatic system.

INTRODUÇÃO: A presença de metástase cervical é um dos principais fatores prognósticos em pacientes com carcinoma epidermoide de laringe. A análise rotineira dos linfonodos não inclui a avaliação da reatividade linfonodal, nem pesquisa de micrometástases, podendo ser desprezada informações prognóstica relevantes neste grupo de pacientes. OBJETIVOS: Relacionar a reatividade linfonodal com a recidiva e mortalidade de pacientes com carcinoma epidermoide de laringe estadiados como pT3 e pT4, pN0, identificar através de marcadores imuno-histoquímicos (AE1/AE3, citoqueratina 7 e citoqueratina 5/6) a incidência de micrometástases e relacionar com o prognóstico dos pacientes. MÉTODO: Entre 2002 e 2005, foram selecionados 105 pacientes estadiados como pN0 com carcinoma epidermoide de laringe submetidos à laringectomia total e esvaziamento cervical seletivo dos níveis II, III e IV bilateralmente, com a maioria dos pacientes (69) submetidos à radioterapia adjuvante. Todos os linfonodos foram analisados conforme os padrões de reatividade: hiperplasia folicular (associada à resposta imune humoral), hiperplasia paracortical (associada à resposta imune celular), histiocitose sinusal, linfonodo normal e depleção linfonodal. Apenas os dois primeiros padrões são considerados como linfonodos estimulados e os demais como não estimulados. O padrão linfonodal mais frequente de cada caso foi considerado na análise da recidiva da doença e mortalidade. Todos os linfonodos foram submetidos à análise imuno-histoquímica com o clone de citoqueratinas AE1/AE3, e nos casos de positividade utilizou-se as citoqueratinas 5/6 e 7 para a diferenciação entre micrometástases e inclusões epiteliais benignas. RESULTADOS: Foram analisados um total de 3.648 linfonodos, com uma média de 34,7 linfonodos por paciente. O padrão de reatividade mais frequente foi a histiocitose sinusal (50 casos) seguido da hiperplasia paracortical (35 casos) e hiperplasia folicular (20 casos), não havendo relação entre esta análise e a recidiva (p = 0,98) ou mortalidade (p = 0,49). A resposta imune humoral esteve relacionada com maior mortalidade (p = 0,05), com sobrevida global em 5 anos de 76%, comparado a 60% de sobrevida no grupo com imunidade celular estimulada (log-rank = 0,05). A pesquisa imuno-histoquímica utilizando o clone de citoqueratinas AE1/AE3 foi positiva em 17 pacientes (16,2%) tendo esta análise relação com a recidiva da doença (p = 0,03) e com a mortalidade (p = 0,04). No grupo com AE1/AE3 positivo, a radioterapia associou-se a uma tendência de proteção à recidiva regional (p = 0,06). A citoqueratina 5/6 confirmou a presença de micrometástases em 4 (3,81%) casos e estas não apresentaram relação prognóstica com a recidiva (p = 0,66) e mortalidade (p = 0,66). A citoqueratina 7 diagnosticou inclusões epiteliais benignas em 11 (10,47%) casos. CONCLUSÕES: Pacientes com imunidade celular estimulada (hiperplasia paracortical) apresentaram menor mortalidade comparados aos pacientes com resposta imune humoral (hiperplasia folicular) (p = 0,05). A positividade na pesquisa com o clone de citoqueratinas AE1/AE3 apresentou relação com significância com a recidiva (p = 0,03) e com a mortalidade (p = 0,04). A incidência de micrometástases na pesquisa com citoqueratina 5/6 foi de 3,86% (4 casos de 105) e de inclusões epiteliais benignas foi de 10,47% (11 casos de 105). / INTRODUCTION: The presence of neck metastasis is one of the most important prognostic factors in patients with squamous cell carcinoma of the larynx. Immunohistochemical analysis for lymph node reactivity, micrometastasis and presence of benign epithelial inclusions are not included in routine anatomopathological exam, leading to potential missing of important prognostic information in this group of patients. OBJECTIVES: 1- To analyze if lymph node reactivity is associated with recurrence and mortality in patients with pT3/pT4, pNo SCCa of the larynx. 2- To identify, with the aid of hystochemical markers AE1/AE3, cytokeratin 7 and cytokeratin 5/6), the incidence of micrometastasis and benign intraepithelial inclusions and to evaluate the relationship of these findings with the patient`s prognosis. METHODS: One hundred and five patients with SCCa of the larynx underwent total laryngectomy and bilateral selective neck dissection of the levels II, III, and IV between 2002 and 2005. Sixty-nine patients also received postoperative radiotherapy. All 105 patients were N0 at the time of diagnosis. The lymph nodes were analyzed according to their reactivity pattern: Follicular hyperplasia (associated to humoral immune response), paracortical hyperplasia (associated to cellular immune response), sinusoidal histiocytosis, normal lymph node, lymphoid depletion. Only the he first two patterns are associated with stimulated lymph nodes. The predominant pattern on each case was recorded and the relationship between these patterns and tumor recurrence and mortality was assessed. All the lymph nodes were tested for cytokeratin AE1/AE3, and the positive cases were than tested for cytokeratin 5/6 and 7 to further differentiate micrometastasis from benign epithelial inclusions. RESULTS: A total of 3648 lymph nodes were analyzed (average of 34.7 lymph nodes/patient). The most common reactivity pattern was paracortical hyperplasia (49 cases), followed by sinusoidal histiocytosis (36 cases) and follicular hyperplasia (20 cases). There was no association between these different patterns and recurrence (p=0.98) or mortality (p=0.49). The humoral immune response was associated with increased mortality (p=0.005). The 5-year overall survival was 76%, compared to 60% on the stimulated cellular response group (LogRank=0.05). Seventeen patients (16.2%) were positive for cytokeratin AE1/AE3, and this was associated with tumor recurrence (p=0.03%) and mortality (p=0.004). In the positive cytokeratin group, the use of radiation therapy showed a tendency to protect against regional recurrence (p=0.06). The use of cytokeratin 5/6 confirmed the presence of micrometastasis in 4 cases (3.81%), but this finding was not associated with local recurrence (p=0.66) or mortality (p=0.66). Cytokeratin 7 has diagnosed benign epithelial inclusions in 11 cases (10.47%). CONCLUSION: Patients with stimulated cellular immunity experienced decreased mortality when compared to humoral immune response (p=0.05). AE1/AE3 positivity was significantly related to recurrence (p=0.03) and mortality (p=0.04). The incidence of micrometastasis was 3.86% (4 cases in 105 patients), and of benign ephitelia inclusions was 10.47% (11 cases in 105 patients).

Haja vista a existência de quatro famílias de M. avium molecularmente distintas circulando na população de suínos do Sul do Brasil, a diferença de virulência constatada entre essas quatro famílias, a influência da virulência nos mecanismos de transmissão, as dúvidas existentes a respeito da existência e da importância da transmissão horizontal de M. avium em suínos e do significado desse conhecimento para o estabelecimento de métodos de controle eficientes, o presente projeto tem por objetivos: 1) Padronizar método de isolamento de micobactérias a partir de fezes suínas; 2) Caracterizar a eliminação de M.avium pelas fezes em suínos experimentalmente infectados pela via oral; 3) Verificar se existe transmissão horizontal entre suínos durante a fase de eliminação ativa, através de experimentos envolvendo infecção oral e exposição de animais contactantes; 4) Estudar, através de modelagem matemática, a dinâmica da infecção por M.avium em uma população suína. Como resultados, para cada um dos itens obteve-se: 1) Houve diferença significativa entre os protocolos de recuperação de micobactérias a partir de fezes de suínos (p< 0,05) e o método ácido com ressuspensão em solução de anfotericina B e semeadura em meio de Lowenstein-Jensen com antibióticos apresentou o maior percentual de recuperação (87%); 2) Foram constados dois períodos de eliminação fecal de MAC em suínos: um inicial, relativo à eliminação residual do inóculo, do 1º ao 4º, e um segundo, com início no 18º e término no 62º dias pós-inoculação, este último é resultado de suposta lesão aberta para a luz do intestino; 3) Cinco, dos sete animais contactantes, infectaram-se com o M.avium, estirpe PIG B e 4) A simulação matemática da doença, considerando a transmissão horizontal como mecanismo principal da ocorrência de condenações em matadouro por linfadenite granulomatosa é inconsistente com o que se observa na população. Portanto, o componente ambiental tem papel preponderante na dinâmica das infecções micobacterianas dos suínos produzidos no Brasil. / Considering four genetic distinct M. avium families within the swine population of the Southern Brazil, the virulence difference detected among them, the virulence influence on the transmission mechanisms, the current doubts concerning M. avium horizontal transmission existence and importance in swine and about its knowledge meaning in order to stablish efficient control programs, the objectives of the present study were: 1) to set in a standard mycobacterial isolation method from swine feces; 2) to characterize M. avium excretion through feces in swine infected orally; 3) to verify the existence of horizontal transmission among swine during the active elimination phase, by experiments involving oral infection and exposure of contacting animals; 4) to study, through mathematical modelling, M. avium infection dynamics in a swine population. These are the attained results for each of the items: 1) there was a significant difference (p<0.05) between the mycobacterial recovery protocols from swine feces and the acid method with suspension in amphotericin solution and inoculation in Lowenstein-Jensen media with antibiotics presented the greatest recovery percentage (87%); 2) two fecal elimination periods of M. avium in swine feces were observed: an initial one, relative to the residual elimination of the inoculum, within days 1 and 4, and a second one, starting at day 18 and ending at day 62 post inoculation - the last one results from a supposed lesion opened to the intestinal lumen. 3) Five out of seven contacting animals were infected with M. avium; 4) The mathematical simulation of the disease, considering the horizontal transmission as the major mechanism of occurrence of condemnation at slaughterhouses due to granulomatous lymphadenitis is not consistent with what is observed in the population. Therefore, the environmental component plays a preponderant role in the mycobacterial infections dynamics of swine raised in Brazil.

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Entretanto, diversos fatores na criação desses animais ainda necessitam melhorar, principalmente na área sanitária, na qual muitas doenças acometem o rebanho, dentre elas, a Linfadenite Caseosa, doença causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, uma bactéria que apresenta sua toxicidade através de genes de virulência, assim como pela produção de biofilme, que protege a bactéria de ambientes hostis. Dessa forma, estudos sobre esse patógeno são necessários, a exemplo do sequenciamento genômico, na busca de conhecer genes para análises de biomoléculas e com isso compreender melhor a sua antigenicidade e imunogenicidade com o objetivo de melhorar a especificidade e sensibilidade de testes sorológicos, utilizados como prevenção da doença no rebanho. Além disso, é essencial entender o mecanismo de patogenicidade desta bactéria no hospedeiro e suas formas de defesa no sistema imunológico do animal. Assim, no presente estudo, foram caracterizados os genomas de quatro cepas de C. pseudotuberculosis, comparando as cepas produtoras (OVI2C, CAPJ4) e não produtoras (OVI03, CAP3W) de biofilme. As cepas foram extraídas para produção de antígenos somáticos e de superfícies. A partir de estudos prévios com immunoblotting, foram escolhidas as cepas de origem caprina (CAPJ4 e CAP3W) para o estudo in vivo com dezoito caprinos da raça Canindé, divididos em três grupos experimentais, um grupo controle e dois grupos infectados com cepas de C. pseudotuberculosis, para avaliar a patogenia clinicamente, realizando hemograma, além de outras análises sorológicas através do ensaio de ELISA e Western Blotting. Também foi realizada a cultura de células sanguíneas para o estudo da imunidade celular com IFN- e cultivo de células mononucleares do sangue periférico para observar a modulação da expressão de proteínas do sistema GTPases, Rab 5 e Rab 7. Após esses estudos, observou-se que os genes contidos no genoma das cepas de C. pseudotuberculosis possuem similaridade, mostrando que eles são altamente conservados. A extração das bactérias resultou em antígenos de superfície F3, que apresentaram reatividade no immunoblotting frente aos soros de ovinos experimentalmente infectados. De todos os antígenos, os de origem caprina, apresentaram melhor antigenicidade. No experimento in vivo, após a infecção dos animais, foram realizadas outras colheitas de sangue e foi possível observar que a cepa produtora de biofilme é mais resistente, causando danos maiores aos animais. Para as condições de infecção experimental, os valores do hemograma estão dentro dos parâmetros. Na análise sorológica os caprinos infectados experimentalmente responderam à exposição primária, o que contribui para o aumento da imunoglobulina IgG. A produção de IFN-  também foi observada. Foi verificado que as cepas de C. pseudotuberculosis produtora e não produtora de biofilme podem alterar a expressão de proteínas Rab 5 e Rab 7 em macrófagos derivados de células mononucleares do sangue periférico cultivados in vitro. Esses resultados forneceram informações importantes para a produção de testes diagnósticos, com maior acurácia. / The consumption of sheep and goat products is frequent and increases the values of world economy, so it is necessary to produce large scale and quality to meet the demand of population. However, several factors in the breeding of these animals still have to improve, especially in sanitary area, where many diseases affect the cattle, among them, Caseous Lymphadenitis, caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, a bacterium that presents its toxicity through virulence genes, also by production of biofilm that protects the bacteria from hostile environments. Thus, studies of this pathogen are necessary, such as genomic sequencing, in search to know antigenic genes for biomolecule analysis and with this to understand better its antigenicity and immunogenicity, to be possible improve the specificity and sensitivity of serological tests, that are used as prevention of disease in the herd. Besides, it is essential to understand the mechanism of pathogenicity of this bacterium in host and its forms of defense against the animals immune system. At the present study, the genomes of four strains of C. pseudotuberculosis were characterized, comparing the biofilm producing (OVI2C, CAPJ4) and non-producing (OVI03, CAP3W) strains. These strains were extracted for production of somatic and surfaces antigens. From previous studies with immunoblottingting, strains of goat origin (CAPJ4 and CAP3W) were chosen for in vivo study with 18 Canindé goats, divided into three experimental groups, one control group and two groups infected with strains of C. pseudotuberculosis, to evaluate clinically the pathogenesis and through hemogram, in addition to other serological tests as ELISA assay and Western Blotting. Also was performed blood cell culture for the study of cellular immunity with IFN-, as culture of peripheral blood mononuclear cells to observe the modulation of expression of GTPases, Rab 5 and Rab 7 system proteins. After these studies, it was observed that the genes contained in the genome of the strains of C. pseudotuberculosis are genetically homogeneous, showing that they are highly conserved. The extraction of bacteria resulted in F3 surface antigens, that showed reactivity in immunoblottingting against sera from experimentally infected sheep. Of all antigens, those of goat origin had better antigenicity. At the in vivo experiment, after the infection of animals, other blood samples were collected and it was possible to observe that the biofilm producing strain is more resistant, causing greater damages to animals. For the conditions of experimental infection, blood count values are between normal limits. In the serological analysis, the experimentally infected goats responded to primary exposure, which contributes to increase of immunoglobulin IgG. The production of IFN- was also observed. In conclusion, it was observed that strains of C. pseudotuberculosis producing and not producing biofilm can modify the expression of Rab proteins in macrophages derived from mononuclear cells of peripheral blood cultivated in vitro. These results provided important information for production of diagnostic tests, with greater accuracy.

As infecções por Mycobacterium sp. têm grande importância na suinocultura devido às perdas econômicas decorrentes da alteração do destino de carcaças, tais como condenação total, aproveitamento condicional, ou mercado interno. As principais causadoras de linfadenite granulomatosa (LG), encontradas em matadouros frigoríficos, são as micobactérias pertencentes ao complexo Mycobacterium avium-intracellulare. Na inspeção post mortem não há como determinar a espécie de micobactéria envolvida na linfadenite granulomatosa. Por esse motivo, as carcaças e vísceras dos suínos com lesões granulomatosas em linfonodos seguem a destinação prevista para casos de tuberculose. Em 2009, verificou-se aumento nas condenações por LG em um frigorífico de suínos, sob inspeção federal, na região do Vale do Taquari, RS. Na tentativa de identificar as causas e, possivelmente, adequar os critérios para tais condenações, o presente estudo teve como objetivo determinar a prevalência de LG no período de 2008 a 2011, através da inspeção visual e através de exames histopatológicos e microbiológicos em 47 linfonodos das regiões mesentérica, traqueobrônquica e submandibular, amostrados na linha de abate que foram processados pelos métodos de rotina histológica e corados pela técnica de Ziehl-Neelsen. Em vinte e uma amostras, realizou-se, também, a técnica de PCR quantitativo para circovirus suíno tipo 2 (PCV2) e em 26 amostras exame bacteriológico de rotina. Em vinte (42,6%), dos 47 linfonodos analisados, a lesão foi classificada, visualmente, como cisto sendo 90% destes confirmados pela histologia. Entre os 27 linfonodos classificados como LG na inspeção visual, 19 (70,4%) foram confirmados na histologia. As principais diferenciações da lesão cística para LG, ao exame visual, incluíram a fácil remoção do conteúdo sob leve pressão e a ausência de granuloma ao corte. Na análise histopatológica, observaram-se áreas císticas com conteúdo proteináceo, algumas amostras com infiltrado linfocítico. PCV2 não foi detectado nas amostras testadas e identificou-se Corynebacterium (1/26), Staphylococcus coagulase negativa (4/26) e Staphylococcus hyicus (2/26). A adoção de novos critérios na diferenciação entre lesões tuberculoides e císticas, à inspeção post mortem de linfonodos mesentéricos, determinou a redução da prevalência das condenações por LG de 5,81% em 2009 para 1,47%, em 2011. Não foram detectados agentes infecciosos associados à lesão cística de linfonodos mesentéricos. No entanto, a etiologia dessas lesões císticas não foi determinada. / Infection by Mycobacterium sp. has a great economic impact on the swine industry due to the economic looses associated with condemnation or altered destination of the carcass in slaughterhouse. The main causes of granulomatous lymphadenitis (GL) in pigs are bacterium belonging to the Mycobacterium avium-intracellularis group. Since visual differentiation among Mycobacterium species involved in GL is not possible, carcass and viscera from GL-affected pigs follow the same destination from that of tuberculosis. An increased number of condemnations due to GL in a swine slaughterhouse under federal inspection in the region of Taquari Valley were recorded. In an attempting to identify the causes and to adapt the inspection criteria for such condemnations, this study aimed to determine the prevalence of GL from 2008 to 2011 through visual inspection, histopathological and microbiological examinations in lymph nodes. Forty seven lymph nodes were collected and processed by the routine histological methods and stained by Ziehl-Neelsen. In 21 samples, quantitative PCR for PCV2 was performed. The other 26 samples were analyzed by standard bacteriology. From 47 lymph nodes analyzed, 20 (42.6 %) were classified as cysts by visual inspection, 90% of which were confirmed by histology. A total of 19 (70.4%) of the 27 lymph nodes visually classified as GL were confirmed by histology. The main visual differences between cysts and GL were the easy content removal under light pressure and absence of granuloma at the cut surface. At histopathological examination, cysts showed areas with proteinaceous contents, some of them with histiocytic infiltrate. PCV2 was not detected in the tested samples. Bacteriological analysis identified Corynebacterium (1/26), Staphylococcus coagulase negative (4/26) and Staphylococcus hyicus (2/26). Adoption of a new criteria for differentiating cystic from tuberculous lesions, at the post mortem inspection of mesenteric lymph nodes, decreased the prevalence of 5.81% recorded in 2009 to 1.47% in 2011, in the condemnation due to GL. It is suggested that most lesions previously classified as GL were truly cysts. No infectious agents were associated with such lesions. However, the etiology of these lymph nodal cystic lesions could not be determined.

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-15. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:10Z : No. of bitstreams: 1 000870617.pdf: 699760 bytes, checksum: d53af1d75b85732b5ff9277249a531f1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Recent years have seen a growing interest in sheep for meat production, mainly in São Paulo Northwest. In order to achieve greater productivity, greater food security and decreased expenditures and stemmed losses of diseases it is essential to recognize these problems, so that we can trace combat strategies of these, in addition to establishing preventive measures, so that you can reduce economic losses, maximize profits and provide a safe food. Through detailed analysis of questionnaires, direct observation in properties and sampling was done to characterize the sheep flock of micro-Araçatuba-SP, which is composed of seven municipalities. The animals were submitted to clinical and general examination by history, inspection and palpation, appropriate notes being made for the conditions of health, reproductive and nutritional management of these animals in their properties. During the visits to the properties they were made fecal collection of the rectum for monitoring by counting eggs per gram. Also punctures were performed nodules, when detected palpation for microbial culture. RESULTS: A lymphadenitis 50% history of properties, but was found in only 8.3% of these. Got an association between lymphadenitis history and mortality (p = 0.0693). It was found a history of foot problems in 91.6% of the properties was observed in 50% of them. It was found that foot problems and conducting foot baths are related (p = 0.0455). A mastitis history was obtained in 41.6% of properties, which was observed in 25% of them. About contagious ecthyma, it was reported by 25% of the properties, however, was not observed during the physical examination. The properties in its entirety declared conduct immunization against clostridial diseases. 25% had other types of vaccines. In 91.6% of the properties animals were observed with symptoms of worms. The Fisher exact test showed association between mortality...(complete abstract, electronic access below) / FAPESP: 2013/144336

Resumo:Nos últimos anos houve um crescente interesse na criação de ovinos para a produção de carne, principalmente na região Noroeste do Estado de São Paulo. A fim de se obter maior produtividade, maior segurança alimentar e diminuição de gastos e perdas provindos de enfermidades torna-se imprescindível o reconhecimento de tais problemas, para que se possa traçar estratégias de combate e prevenção destes. Por meio de análise detalhada de questionários, observação direta em doze propriedades e coleta de amostras de 633 animais, foi feita a caracterização do rebanho ovino da microrregião de Araçatuba-SP, que é composta por sete municípios. Os animais foram submetidos ao exame clínico-geral, por meio da anamnese, inspeção e palpação, sendo feitas as devidas anotações quanto às condições de manejo sanitário, reprodutivo e nutricional desses animais em suas respectivas propriedades. Durante as visitas às propriedades foram feitas as coletas de fezes da ampola retal para acompanhamento por contagem de ovos por grama. Também foram realizadas punções de nódulos, quando detectados a palpação, para cultura microbiana. Constatou-se um histórico de linfadenite em 50% das propriedades, porém houve identificação da doença em apenas 8,3% destas. Constatou-se um histórico de afecções podais em 91,6% das propriedades, observou-se em 50% delas. Um histórico de mastite foi obtido em 41,6% das propriedades, a qual foi observada em 25% delas. Sobre ectima contagioso, foi relatado por 25% das propriedades, porém, não foi observado durante os exames físicos. As propriedades em sua totalidade declararam realizar vacinação contra clostridioses. 25% realizavam outros tipos de vacinas. Em 91,6% das propriedades foram observados animais com sintomatologia de verminose. Práticas de higienização das instalações e ambientes e técnicas de manejo sanitário eram adotadas em...(resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:Recent years have seen a growing interest in sheep for meat production, mainly in São Paulo Northwest. In order to achieve greater productivity, greater food security and decreased expenditures and stemmed losses of diseases it is essential to recognize these problems, so that we can trace combat strategies of these, in addition to establishing preventive measures, so that you can reduce economic losses, maximize profits and provide a safe food. Through detailed analysis of questionnaires, direct observation in properties and sampling was done to characterize the sheep flock of micro-Araçatuba-SP, which is composed of seven municipalities. The animals were submitted to clinical and general examination by history, inspection and palpation, appropriate notes being made for the conditions of health, reproductive and nutritional management of these animals in their properties. During the visits to the properties they were made fecal collection of the rectum for monitoring by counting eggs per gram. Also punctures were performed nodules, when detected palpation for microbial culture. RESULTS: A lymphadenitis 50% history of properties, but was found in only 8.3% of these. Got an association between lymphadenitis history and mortality (p = 0.0693). It was found a history of foot problems in 91.6% of the properties was observed in 50% of them. It was found that foot problems and conducting foot baths are related (p = 0.0455). A mastitis history was obtained in 41.6% of properties, which was observed in 25% of them. About contagious ecthyma, it was reported by 25% of the properties, however, was not observed during the physical examination. The properties in its entirety declared conduct immunization against clostridial diseases. 25% had other types of vaccines. In 91.6% of the properties animals were observed with symptoms of worms. The Fisher exact test showed association between mortality...(complete abstract, electronic access below) / Orientador:Luiz Cláudio Nogueira Mendes / Banca:Vera Cláudia Lorenzetti Magalhães Curci / Banca:Luzia Helena Queiroz / Mestre

As infecções por Mycobacterium sp. têm grande importância na suinocultura devido às perdas econômicas decorrentes da alteração do destino de carcaças, tais como condenação total, aproveitamento condicional, ou mercado interno. As principais causadoras de linfadenite granulomatosa (LG), encontradas em matadouros frigoríficos, são as micobactérias pertencentes ao complexo Mycobacterium avium-intracellulare. Na inspeção post mortem não há como determinar a espécie de micobactéria envolvida na linfadenite granulomatosa. Por esse motivo, as carcaças e vísceras dos suínos com lesões granulomatosas em linfonodos seguem a destinação prevista para casos de tuberculose. Em 2009, verificou-se aumento nas condenações por LG em um frigorífico de suínos, sob inspeção federal, na região do Vale do Taquari, RS. Na tentativa de identificar as causas e, possivelmente, adequar os critérios para tais condenações, o presente estudo teve como objetivo determinar a prevalência de LG no período de 2008 a 2011, através da inspeção visual e através de exames histopatológicos e microbiológicos em 47 linfonodos das regiões mesentérica, traqueobrônquica e submandibular, amostrados na linha de abate que foram processados pelos métodos de rotina histológica e corados pela técnica de Ziehl-Neelsen. Em vinte e uma amostras, realizou-se, também, a técnica de PCR quantitativo para circovirus suíno tipo 2 (PCV2) e em 26 amostras exame bacteriológico de rotina. Em vinte (42,6%), dos 47 linfonodos analisados, a lesão foi classificada, visualmente, como cisto sendo 90% destes confirmados pela histologia. Entre os 27 linfonodos classificados como LG na inspeção visual, 19 (70,4%) foram confirmados na histologia. As principais diferenciações da lesão cística para LG, ao exame visual, incluíram a fácil remoção do conteúdo sob leve pressão e a ausência de granuloma ao corte. Na análise histopatológica, observaram-se áreas císticas com conteúdo proteináceo, algumas amostras com infiltrado linfocítico. PCV2 não foi detectado nas amostras testadas e identificou-se Corynebacterium (1/26), Staphylococcus coagulase negativa (4/26) e Staphylococcus hyicus (2/26). A adoção de novos critérios na diferenciação entre lesões tuberculoides e císticas, à inspeção post mortem de linfonodos mesentéricos, determinou a redução da prevalência das condenações por LG de 5,81% em 2009 para 1,47%, em 2011. Não foram detectados agentes infecciosos associados à lesão cística de linfonodos mesentéricos. No entanto, a etiologia dessas lesões císticas não foi determinada. / Infection by Mycobacterium sp. has a great economic impact on the swine industry due to the economic looses associated with condemnation or altered destination of the carcass in slaughterhouse. The main causes of granulomatous lymphadenitis (GL) in pigs are bacterium belonging to the Mycobacterium avium-intracellularis group. Since visual differentiation among Mycobacterium species involved in GL is not possible, carcass and viscera from GL-affected pigs follow the same destination from that of tuberculosis. An increased number of condemnations due to GL in a swine slaughterhouse under federal inspection in the region of Taquari Valley were recorded. In an attempting to identify the causes and to adapt the inspection criteria for such condemnations, this study aimed to determine the prevalence of GL from 2008 to 2011 through visual inspection, histopathological and microbiological examinations in lymph nodes. Forty seven lymph nodes were collected and processed by the routine histological methods and stained by Ziehl-Neelsen. In 21 samples, quantitative PCR for PCV2 was performed. The other 26 samples were analyzed by standard bacteriology. From 47 lymph nodes analyzed, 20 (42.6 %) were classified as cysts by visual inspection, 90% of which were confirmed by histology. A total of 19 (70.4%) of the 27 lymph nodes visually classified as GL were confirmed by histology. The main visual differences between cysts and GL were the easy content removal under light pressure and absence of granuloma at the cut surface. At histopathological examination, cysts showed areas with proteinaceous contents, some of them with histiocytic infiltrate. PCV2 was not detected in the tested samples. Bacteriological analysis identified Corynebacterium (1/26), Staphylococcus coagulase negative (4/26) and Staphylococcus hyicus (2/26). Adoption of a new criteria for differentiating cystic from tuberculous lesions, at the post mortem inspection of mesenteric lymph nodes, decreased the prevalence of 5.81% recorded in 2009 to 1.47% in 2011, in the condemnation due to GL. It is suggested that most lesions previously classified as GL were truly cysts. No infectious agents were associated with such lesions. However, the etiology of these lymph nodal cystic lesions could not be determined.

INTRODUÇÃO: A presença de metástase cervical é um dos principais fatores prognósticos em pacientes com carcinoma epidermoide de laringe. A análise rotineira dos linfonodos não inclui a avaliação da reatividade linfonodal, nem pesquisa de micrometástases, podendo ser desprezada informações prognóstica relevantes neste grupo de pacientes. OBJETIVOS: Relacionar a reatividade linfonodal com a recidiva e mortalidade de pacientes com carcinoma epidermoide de laringe estadiados como pT3 e pT4, pN0, identificar através de marcadores imuno-histoquímicos (AE1/AE3, citoqueratina 7 e citoqueratina 5/6) a incidência de micrometástases e relacionar com o prognóstico dos pacientes. MÉTODO: Entre 2002 e 2005, foram selecionados 105 pacientes estadiados como pN0 com carcinoma epidermoide de laringe submetidos à laringectomia total e esvaziamento cervical seletivo dos níveis II, III e IV bilateralmente, com a maioria dos pacientes (69) submetidos à radioterapia adjuvante. Todos os linfonodos foram analisados conforme os padrões de reatividade: hiperplasia folicular (associada à resposta imune humoral), hiperplasia paracortical (associada à resposta imune celular), histiocitose sinusal, linfonodo normal e depleção linfonodal. Apenas os dois primeiros padrões são considerados como linfonodos estimulados e os demais como não estimulados. O padrão linfonodal mais frequente de cada caso foi considerado na análise da recidiva da doença e mortalidade. Todos os linfonodos foram submetidos à análise imuno-histoquímica com o clone de citoqueratinas AE1/AE3, e nos casos de positividade utilizou-se as citoqueratinas 5/6 e 7 para a diferenciação entre micrometástases e inclusões epiteliais benignas. RESULTADOS: Foram analisados um total de 3.648 linfonodos, com uma média de 34,7 linfonodos por paciente. O padrão de reatividade mais frequente foi a histiocitose sinusal (50 casos) seguido da hiperplasia paracortical (35 casos) e hiperplasia folicular (20 casos), não havendo relação entre esta análise e a recidiva (p = 0,98) ou mortalidade (p = 0,49). A resposta imune humoral esteve relacionada com maior mortalidade (p = 0,05), com sobrevida global em 5 anos de 76%, comparado a 60% de sobrevida no grupo com imunidade celular estimulada (log-rank = 0,05). A pesquisa imuno-histoquímica utilizando o clone de citoqueratinas AE1/AE3 foi positiva em 17 pacientes (16,2%) tendo esta análise relação com a recidiva da doença (p = 0,03) e com a mortalidade (p = 0,04). No grupo com AE1/AE3 positivo, a radioterapia associou-se a uma tendência de proteção à recidiva regional (p = 0,06). A citoqueratina 5/6 confirmou a presença de micrometástases em 4 (3,81%) casos e estas não apresentaram relação prognóstica com a recidiva (p = 0,66) e mortalidade (p = 0,66). A citoqueratina 7 diagnosticou inclusões epiteliais benignas em 11 (10,47%) casos. CONCLUSÕES: Pacientes com imunidade celular estimulada (hiperplasia paracortical) apresentaram menor mortalidade comparados aos pacientes com resposta imune humoral (hiperplasia folicular) (p = 0,05). A positividade na pesquisa com o clone de citoqueratinas AE1/AE3 apresentou relação com significância com a recidiva (p = 0,03) e com a mortalidade (p = 0,04). A incidência de micrometástases na pesquisa com citoqueratina 5/6 foi de 3,86% (4 casos de 105) e de inclusões epiteliais benignas foi de 10,47% (11 casos de 105). / INTRODUCTION: The presence of neck metastasis is one of the most important prognostic factors in patients with squamous cell carcinoma of the larynx. Immunohistochemical analysis for lymph node reactivity, micrometastasis and presence of benign epithelial inclusions are not included in routine anatomopathological exam, leading to potential missing of important prognostic information in this group of patients. OBJECTIVES: 1- To analyze if lymph node reactivity is associated with recurrence and mortality in patients with pT3/pT4, pNo SCCa of the larynx. 2- To identify, with the aid of hystochemical markers AE1/AE3, cytokeratin 7 and cytokeratin 5/6), the incidence of micrometastasis and benign intraepithelial inclusions and to evaluate the relationship of these findings with the patient`s prognosis. METHODS: One hundred and five patients with SCCa of the larynx underwent total laryngectomy and bilateral selective neck dissection of the levels II, III, and IV between 2002 and 2005. Sixty-nine patients also received postoperative radiotherapy. All 105 patients were N0 at the time of diagnosis. The lymph nodes were analyzed according to their reactivity pattern: Follicular hyperplasia (associated to humoral immune response), paracortical hyperplasia (associated to cellular immune response), sinusoidal histiocytosis, normal lymph node, lymphoid depletion. Only the he first two patterns are associated with stimulated lymph nodes. The predominant pattern on each case was recorded and the relationship between these patterns and tumor recurrence and mortality was assessed. All the lymph nodes were tested for cytokeratin AE1/AE3, and the positive cases were than tested for cytokeratin 5/6 and 7 to further differentiate micrometastasis from benign epithelial inclusions. RESULTS: A total of 3648 lymph nodes were analyzed (average of 34.7 lymph nodes/patient). The most common reactivity pattern was paracortical hyperplasia (49 cases), followed by sinusoidal histiocytosis (36 cases) and follicular hyperplasia (20 cases). There was no association between these different patterns and recurrence (p=0.98) or mortality (p=0.49). The humoral immune response was associated with increased mortality (p=0.005). The 5-year overall survival was 76%, compared to 60% on the stimulated cellular response group (LogRank=0.05). Seventeen patients (16.2%) were positive for cytokeratin AE1/AE3, and this was associated with tumor recurrence (p=0.03%) and mortality (p=0.004). In the positive cytokeratin group, the use of radiation therapy showed a tendency to protect against regional recurrence (p=0.06). The use of cytokeratin 5/6 confirmed the presence of micrometastasis in 4 cases (3.81%), but this finding was not associated with local recurrence (p=0.66) or mortality (p=0.66). Cytokeratin 7 has diagnosed benign epithelial inclusions in 11 cases (10.47%). CONCLUSION: Patients with stimulated cellular immunity experienced decreased mortality when compared to humoral immune response (p=0.05). AE1/AE3 positivity was significantly related to recurrence (p=0.03) and mortality (p=0.04). The incidence of micrometastasis was 3.86% (4 cases in 105 patients), and of benign ephitelia inclusions was 10.47% (11 cases in 105 patients).

Haja vista a existência de quatro famílias de M. avium molecularmente distintas circulando na população de suínos do Sul do Brasil, a diferença de virulência constatada entre essas quatro famílias, a influência da virulência nos mecanismos de transmissão, as dúvidas existentes a respeito da existência e da importância da transmissão horizontal de M. avium em suínos e do significado desse conhecimento para o estabelecimento de métodos de controle eficientes, o presente projeto tem por objetivos: 1) Padronizar método de isolamento de micobactérias a partir de fezes suínas; 2) Caracterizar a eliminação de M.avium pelas fezes em suínos experimentalmente infectados pela via oral; 3) Verificar se existe transmissão horizontal entre suínos durante a fase de eliminação ativa, através de experimentos envolvendo infecção oral e exposição de animais contactantes; 4) Estudar, através de modelagem matemática, a dinâmica da infecção por M.avium em uma população suína. Como resultados, para cada um dos itens obteve-se: 1) Houve diferença significativa entre os protocolos de recuperação de micobactérias a partir de fezes de suínos (p< 0,05) e o método ácido com ressuspensão em solução de anfotericina B e semeadura em meio de Lowenstein-Jensen com antibióticos apresentou o maior percentual de recuperação (87%); 2) Foram constados dois períodos de eliminação fecal de MAC em suínos: um inicial, relativo à eliminação residual do inóculo, do 1º ao 4º, e um segundo, com início no 18º e término no 62º dias pós-inoculação, este último é resultado de suposta lesão aberta para a luz do intestino; 3) Cinco, dos sete animais contactantes, infectaram-se com o M.avium, estirpe PIG B e 4) A simulação matemática da doença, considerando a transmissão horizontal como mecanismo principal da ocorrência de condenações em matadouro por linfadenite granulomatosa é inconsistente com o que se observa na população. Portanto, o componente ambiental tem papel preponderante na dinâmica das infecções micobacterianas dos suínos produzidos no Brasil. / Considering four genetic distinct M. avium families within the swine population of the Southern Brazil, the virulence difference detected among them, the virulence influence on the transmission mechanisms, the current doubts concerning M. avium horizontal transmission existence and importance in swine and about its knowledge meaning in order to stablish efficient control programs, the objectives of the present study were: 1) to set in a standard mycobacterial isolation method from swine feces; 2) to characterize M. avium excretion through feces in swine infected orally; 3) to verify the existence of horizontal transmission among swine during the active elimination phase, by experiments involving oral infection and exposure of contacting animals; 4) to study, through mathematical modelling, M. avium infection dynamics in a swine population. These are the attained results for each of the items: 1) there was a significant difference (p<0.05) between the mycobacterial recovery protocols from swine feces and the acid method with suspension in amphotericin solution and inoculation in Lowenstein-Jensen media with antibiotics presented the greatest recovery percentage (87%); 2) two fecal elimination periods of M. avium in swine feces were observed: an initial one, relative to the residual elimination of the inoculum, within days 1 and 4, and a second one, starting at day 18 and ending at day 62 post inoculation - the last one results from a supposed lesion opened to the intestinal lumen. 3) Five out of seven contacting animals were infected with M. avium; 4) The mathematical simulation of the disease, considering the horizontal transmission as the major mechanism of occurrence of condemnation at slaughterhouses due to granulomatous lymphadenitis is not consistent with what is observed in the population. Therefore, the environmental component plays a preponderant role in the mycobacterial infections dynamics of swine raised in Brazil.