La nécrolyse épidermique toxique (NET) est une réaction cutanée médicamenteuse (CADR - Cutaneous Adverse Drug Reaction) rare et sévère qui se caractérise par une nécrose brutale de l’épiderme, entraînant un décollement cutané plus ou moins étendu. Il s’agit d’une urgence vitale avec jusqu’à 30% de décès à la phase aiguë. L’importance de la surface décollée définit deux entités cliniques : le syndrome de Stevens-Johnson quand le décollement est inférieur à 10% et le syndrome de Lyell quand il est supérieur à 30%. A distance, le risque de complications, notamment sous forme de synéchies des muqueuses, est particulièrement élevé et doit être prévenu systématiquement. Le mécanisme physiopathologique repose essentiellement sur une réaction d’hypersensibilité médicamenteuse retardée dans laquelle les lymphocytes cytotoxiques jouent un rôle majeur. Le terrain génétique intervient également avec des associations HLA-médicament maintenant bien décrites, notamment dans les populations asiatiques. La question du traitement reste encore très débattue : il repose essentiellement sur la corticothérapie systémique, la ciclosporine ou encore les immunoglobulines IV. Quelques études suggèrent également un intérêt des anti-TNF-alpha. Le but de ce travail est de comprendre les mécanismes à l’origine des CADRs les plus sévères, à travers la caractérisation de patients atteints de NET à la phase aiguë et en les comparant à une CADR bénigne comme l’EMP. Nous avons dans un premier temps déterminé quelles étaient les principales populations CD45+ présentes à la phase aiguë des NET et de patients ayant présenté un exanthème maculo-papuleux (EMP) bénin, à la fois dans la peau et dans le sang. Nous avons cherché à déterminer la présence de populations cellulaires spécifiques de ces pathologies, notamment au sein des lymphocytes T CD8+ qui étaient la population majoritaire dans ces deux CADRs. Nous avons notamment montré qu’il existait une expansion majeure de lymphocytes T CD8+ effecteurs mémoires et polycytotoxiques au cours de la NET comparativement à l’EMP. Puis, nous nous sommes intéressés à la clonalité de ces populations lymphocytaires T CD8+ au travers de l’analyse de leurs séquences V-béta puis au moyen d’un séquençage ADN haut débit : nous avons notamment montré que ces expansions lymphocytaires T CD8+ étaient clonotypiques dans la peau. Nous avons également étudié l’expansion de ces clones cutanés dans le sang des patients atteints de NET et avons montré que leur expansion sanguine était directement corrélé à la sévérité clinique. Enfin, nous avons pu démontré in vitro chez deux patients que ces clones étaient spécifiques du médicament inducteur. / Toxic epidermal necrolysis (TEN) is a rare and severe cutaneous adverse drug reaction (CADR). The histologic hallmark of this reaction is necrosis with detachment of the epidermis resulting in skin blistering. This is a vital emergency with up to 30% deaths at the acute phase. The percentage of blistering skin determines two clinical entities: Stevens-Johnson syndrome when detachment represents less than 10% and Lyell's syndrome when it is greater than 30%. The development of late complications, notably mucous synechiae, is frequent and must be systematically prevented. Pathophysiologic mechanism consists in a delayed drug hypersensitivity reaction in which cytotoxic T lymphocytes play a major role. Genetic background is also very important with HLA-drug associations which have been reported, notably in asian ppopulations. Treatment remains very debated : systemic steroids, ciclosporin or intravenous immunoglobulins are commonly used. Some studies also suggest that TNF-alpha inhibitors are of interest in treating this disease. The aim of this work is to understand the mechanisms underlying the most severe CADRs, through the characterization of TEN patients. We first determined the main CD45+ populations present in the acute phase of both TEN and patients who devloped a benign maculo-papular exanthema (MPE). We sought to determine the presence of cell populations specific to these pathologies, particularly within CD8+ T lymphocytes, which were the majority population in these two CADRs. In particular, we have shown that there is a major expansion of CD8+ T lymphocytes in memory and polycytotoxic effectors during TEN compared to MPE. Then, we focused on the clonality of these CD8+ T lymphocyte populations through the analysis of their V-beta sequences and then by means of high throughput DNA sequencing: in particular, we showed that these CD8+ T lymphocyte expansions were clonotypic in the skin. We also studied the expansion of these skin clones in the blood of TEN patients and showed that their blood expansion was directly correlated with clinical severity. Finally, we were able to demonstrate in vitro in two patients that these clones were specific to the suspected drug

Les chimiokines sont des petites protéines qui régulent la migration et le "homing" des cellules leucocytaires. Elles jouent également un rôle clef dans le développement de certains cancers en régulant les phénomènes de prolifération, d'angiogenèse ou encore de migration des cellules métastatiques. À ce jour, environs 40 chimiokines et plus de 19 récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été répertoriés. De nombreuses études ont montré que les récepteurs liant les chimiokines pouvaient s'associer sous forme de complexes homo et hétéromériques. Les conséquences fonctionnelles associées à l'hétéromérisation sont diverses et fonction de la nature des récepteurs étudiés, du type de cellules sur lesquelles ces récepteurs sont exprimés et de l'expression relative des récepteurs. Cependant, le rôle physiologique exact de l’hétéromérisation des récepteurs aux chimiokines, et des RCPGs de manière générale, resteencore peu connu. Nous avons tenté de répondre à cette question dans ce travail de doctorat en étudiant plus particulièrement l’hétéromérisation de CXCR4 et CCR7 au cours du développement des lymphocytes B. Nous avons montré que le récepteur CXCR4 est exprimé à la surface des lymphocytes B à tous les stades de leur développement et qu’une diminution de l’expression de CXCR4s’opère lors de la transition du stade Pré-B vers les stades B immatures et matures. Cette transition s’accompagne d’une «uprégulation » du récepteur CCR7 qui est le plus fortement exprimé à la surface des lymphocytes B matures. Nous avons par ailleurs montré que la transition du stade Pré-B vers les stades B immatures et matures s’accompagne d’une forte inhibition de CXCR4, les cellules B matures étant totalement réfractaires à la migration dans un gradient de CXCL12. Cette perte totale de fonctionnalité ne pouvant pas s’expliquer par la diminution partielle de l’expression de CXCR4, nous avons testé si l’expression du récepteur CCR7 pouvait contribuer à la perte de fonction de CXCR4 observée. Dans un premier temps, nous avons comparé la capacité de CXCR4 à induire la chimiotaxie des lymphocytes B matures provenant de souris sauvages ou de souris CCR7KO déficientes pour l’expression de CCR7. Nous avons montré que l’absence de CCR7 permet de récupérer une migration significative des lymphocytes B matures dans un gradient de CXCL12. De manière intéressante, l’absence de CCR7 affecte spécifiquement la fonction de CXCR4 mais pas celle des récepteurs CXCR5 et CCR6 également exprimés à la surface des lymphocytes B matures. De plus, l’inhibition de CCR7 des lymphocytes B matures sauvages par des anticorps bloquant ne permet pas de reproduire l’effet de l’absence de CCR7. Ce résultat suggère que la signalisation du récepteur CCR7 ne serait pas impliquée. Nous avons également montré que l’absence de CCR7 s’accompagne d’un nombre plus important de lymphocytes B matures dans la moelle osseuse des souris CCR7KO, en parfait accord avec le rôle connu de CXCR4 dans la rétention des progéniteurs hématopoïétiques au sein de la moelle osseuse. Nous avonségalement montré que l’expression du récepteur humain CCR7 dans la lignée lymphocytaire Pré-B humaine Nalm-6 ou dans des cellules CHO-K1 exprimant le récepteur CXCR4 suffit à induire une perte de fonctionnalité de CXCR4. Tout comme pour les lymphocytes B maturesmurins, cette inhibition s’exerce en absence de toute stimulation de CCR7. Nous avons aussi montré que l’expression de récepteurs CCR7 mutants incapables de lier les chimiokines CCL19 et CCL21 (mutant CCR7NT) ou d’induire une signalisation (mutants CCR7D(R/A)Y et CCR7(N/A)PXXY) sont toujours capables d’induire l’inhibition de CXCR4, ce qui confirme qu’une signalisation CCR7 n’est pas nécessaire pour induire le phénomène de la régulation de CXCR4. Ce résultat montre aussi que les fonctions de signalisation et de régulation de CCR7peuvent être découplées.Nous avons également tenté d’identifier le mécanisme moléculaire associé à l’inhibition de CXCR4 par CCR7. Grâce à l’utilisation de biosenseurs BRET mesurant l’activation des protéines G, nous avons montré que l’expression de CCR7 inhibe fortement l’activation de la protéine Gαi2 connue pour jouer un rôle important dans la migration des lymphocytes. Ce résultat permet donc d’expliquer la perte de migration détectée dans les lymphocytes B coexprimant CXCR4 et CCR7. Cependant, nous avons aussi montré que l’expression de CCR7 n’empêche pas l’interaction physique de la protéine Gαi2 avec le récepteur CXCR4. Nous avons alors émis l’hypothèse que CCR7 exercerait son effetinhibiteur sur CXCR4 en interagissant physiquement avec lui et en altérant sa capacité à activer la protéine Gαi2. Nous avons montré par différentes techniques que le récepteur CCR7 interagit avec CXCR4 et que la conformation du complexe formé par CXCR4 et la protéineGαi2 est différente suivant que cette interaction a lieu au sein d’un homomère CXCR4/CXCR4 ou d’un hétéromère CXCR4/CCR7. L’ensemble de ces données suggère donc que l’hétéromérisation de CXCR4 avec CCR7 change la conformation du complexe CXCR4/Gαi2 et la capacité de CXCR4 à activer la protéine Gαi2. De manière intéressante, l’hétéromérisation de CXCR4 avec CCR7 inhibe également l’activation de la protéine Gαi1 mais pas celle de la protéine Gαi3. Ce résultat très intéressant suggère que l’hétéromérisation CXCR4/CCR7 ne serait pas simplement associée à une inhibition de la fonction de CXCR4 mais plutôt à une modulation de son profil d’activation. Cette hypothèse suggère donc que le récepteur CCR7 jouerait le rôle de modulateur allostérique endogène de CXCR4 capable de moduler l’activation de certaines voies de signalisation tout en en laissant d'autres fonctionnelles. Cependant, le manque de temps ne nous a pas permis de confirmer le maintiend’un signal dépendant de Gαi3 dans les cellules coexprimant CXCR4 et CCR7.L’ensemble de ces résultats suggèrent que le récepteur aux chimiokines CCR7 exercerait le rôle de modulateur allostérique de CXCR4 au cours du développement des lymphocytes B et que cette fonction nécessiterait l’interaction physique de CXCR4 et CCR7.À notre connaissance, ces résultats constituent la première indication que l’hétéromérisation de récepteurs aux chimiokines peut jouer un rôle dans un processus physiologique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Efficient delivery of genetic material to T-lymphocytes is key in gene therapy using T-lymphocytes with chimeric antigen receptors. Current procedures require the use of potentially dangerous viral vectors or large amount of input material. The diploma thesis therefore focuses on exploring new approaches for gene transfer into T-lymphocytes: use of safe virus-like particles (VLPs) derived from mouse polyomavirus in combination with the amphipathic cationic peptide LAH4. LAH4 has the potential to increase the efficiency of DNA and viral vector transport into cells. The system which combines VLPs and the LAH4 peptide was optimized for the delivery of reporter gene (encoding GFP and luciferase) to the model T-cell line Jurkat. It has been found that Jurkat cells cannot be efficiently transduced by DNA packed into VLPs. When cells were transfected only with DNA and LAH4, consistent results were not obtained, and the transfection efficiency ranged from 0.5 to 19%. The diploma thesis also analysed the effect of phosphorylation of viral structures on gene transfer. The impact of treatment of virus particles by alkaline phosphatase on the infectivity of the virus was studied and it was necessary to analyse the effect of the reaction components. Sublytic concentration of Triton-X100 in the reaction buffer...

Marathon runners (N = 22) who had completed at least seven marathons (X ± SEM = 23.6 ± 5.7) and had been training for marathon race events for at least 4 yr (12.3 ± 1.3) were compared with sedentary controls (N = 18). Although the two groups were of similar age (38.7 ± 1.5 and 43.9 ± 2.2 yr, respectively) and height, the marathon runners were significantly leaner and possessed a VO2max 60% higher than that of the controls. Neutrophil counts tended to be lower in the group of marathoners, while other leukocyte and lymphocyte subsets were similar to controls. Mitogen-induced lymphocyte proliferation did not differ between groups. Natural killer cell cyto-toxic activity (NKCA) was significantly higher in the marathoners versus controls (373 ± 38 vs 237 ± 41 total lytic units, respectively, a 57% difference, P = 0.02). For all subjects combined (N = 40) and within the group of marathon runners (N — 22), percent body fat was negatively correlated with NKCA (r = -0.48, P = 0.002; r = -0.49, P = 0.019, respectively), and age was negatively correlated with Con A-induccd lymphocyte proliferation (r = -0.41, P = 0.009; r = -0.53, P = 0.011, respectively). These data indicate that NKCA but not mitogen-induced lymphocyte proliferation is higher in marathon runners relative to sedentary controls.

Our previous report showed that the brain peptide Tyr-MIF-1 (Tyr-Pro-Leu-Gly-NH2) blocks the inhibitory effect of morphine sulfate on E-rosette formation by human peripheral blood lymphocytes (PBL). In this study, additional in vitro effects of Tyr-MIF-1 on human PBL were studied. The percentages of positive cells for CD 2, a sheep erythrocyte receptor, CD 4 and CD 8 were unchanged after incubation of PBL with morphine or morphine plus Tyr-MIF-1. Tyr-MIF-1 was not mitogenic by itself. The addition of Tyr-MIF-1 did not increase the proliferative response of PBL to Con A, although morphine did. Tyr-MIF-1 did not activate PBL to produce IL 2 nor did it affect the production of IL 2 by Con A-stimulated PBL. The results suggest that Tyr-MIF-1 does not directly modulate CD 2, CD 4 and CD 8 expression, does not alter the proliferative response of PBL, and does not affect the production of IL 2.

Hepatitis C virus (HCV) is remarkable for its ability to establish persistent infection. Studies suggest that HCV core protein modulates immune responses to viral infection and can bind Fas receptor in vitro. To further examine the role of HCV core protein in Fas signaling, full-length (aa 1-192) and truncated (aa 1-152) HCV core proteins were expressed in Jurkat lymphocytes and cells were assayed for apoptotic response, caspase activation, and Fas activation. Jurkat expressing full-length but not truncated core protein exhibited ligand-independent apoptosis. Cytoplasmic targeting of truncated core protein recapitulated its ability to induce apoptosis. Activation of caspases 8 and 3 was necessary and sufficient for full-length core to induce apoptosis. Jurkat cells expressing full-length but not truncated core protein induced Fas receptor aggregation. HCV core activates apoptotic pathways in Jurkat via Fas and requires cytoplasmic localization of core. Infection of host lymphocytes by HCV may alter apoptotic signaling and skew host responses to acute infection.

The aim of the present study was to develop a dendritic cell (DC) vaccine encoding hepatitis C virus (HCV) multiple cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitopes that can stimulate T cell responses in vitro, and can be used for immunization in vivo. DCs were infected with recombinant replication-defective adenoviruses (Ads) expressing 2 HCV sequences fused with green fluorescent protein (GFP) and FLAG tags. One sequence (sequence 1) contained the HCV CTL epitopes, NS4B 1793-1801 and P7 774-782, as well as the HCV Th epitope, NS3 1248-1261. A second sequence (sequence 2) was the positive epitope control which contained HCV core 35-44, core 132-140 and NS3 1248-1261. The efficiency of infection was detected by flow cytometry and the expression of HCV epitopes in the DCs was confirmed by RT-PCR and western blot analysis. Ad infection significantly enhanced DC maturation and interleukin (IL)-12p70 production, resulting in T cell proliferation and increased interferon-γ secretion. The CTLs stimulated by Ad-infected DCs specifically killed Huh7.5 human hepatoma cells. The recombinant Ad-expressing multiple CTL HCV epitopes effectively infected the DCs in vitro and promoted T cell antiviral immune responses, thereby laying the foundation for the development of anti-HCV DC vaccines.

The aim of the present study was to develop a dendritic cell (DC) vaccine encoding hepatitis C virus (HCV) multiple cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitopes that can stimulate T cell responses in vitro, and can be used for immunization in vivo. DCs were infected with recombinant replication-defective adenoviruses (Ads) expressing 2 HCV sequences fused with green fluorescent protein (GFP) and FLAG tags. One sequence (sequence 1) contained the HCV CTL epitopes, NS4B 1793-1801 and P7 774-782, as well as the HCV Th epitope, NS3 1248-1261. A second sequence (sequence 2) was the positive epitope control which contained HCV core 35-44, core 132-140 and NS3 1248-1261. The efficiency of infection was detected by flow cytometry and the expression of HCV epitopes in the DCs was confirmed by RT-PCR and western blot analysis. Ad infection significantly enhanced DC maturation and interleukin (IL)-12p70 production, resulting in T cell proliferation and increased interferon-γ secretion. The CTLs stimulated by Ad-infected DCs specifically killed Huh7.5 human hepatoma cells. The recombinant Ad-expressing multiple CTL HCV epitopes effectively infected the DCs in vitro and promoted T cell antiviral immune responses, thereby laying the foundation for the development of anti-HCV DC vaccines.

The mechanisms by which opioids affect progression of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection are not well-defined. HIV-1 gp120 is important in the apoptotic death of uninfected, bystander T cells. In this study, we show that co-treatment of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with HIV-1 gp120/morphine synergistically induces apoptosis in PBMC. Co-treatment of murine splenocytes from μ opiate receptor knockout mice with gp120/morphine resulted in decreased apoptosis when compared to splenocytes from wild type mice. Co-treatment of human PBMC or murine splenocytes with gp120/morphine led to decreased expression of β-arrestin 2, a protein required for opioid-mediated signaling. The role of β-arrestin 2 was confirmed in Jurkat lymphocytes, in which 1) over-expression of β-arrestin 2 inhibited gp120/morphine-induced apoptosis and 2) RNA interference of β-arrestin 2 expression enhanced gp120/morphine-induced apoptosis. These data suggest a novel mechanism by which HIV-1 gp120 and opioids induce lymphocyte cell death.

Restraint stress, either physical or psychological, can modulate immune function. However, the mechanisms associated with stress-induced lymphocyte reduction remains to be elucidated. We have previously shown that chronic stress induces Fas-mediated lymphocyte reduction. Here, we investigated the mechanisms by which restraint stress modulates lymphocyte reduction. Our data have shown that inhibition of p53 by the p53 inhibitor PFT-α attenuates stress-induced reduction in lymphocyte numbers. These results were verified using p53 knockout mice, suggesting a pivotal role of p53 in this process. In addition our data have indicated that PI3K/nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling pathway plays an important role in the stress-induced lymphocyte reduction. Our study thus demonstrates that restraint stress promotes lymphocyte reduction through p53 and PI3K/NF-κB pathways.