Les récepteurs du Fc des Immunoglobulines G (FcγR) sont impliqués dans de nombreuses réactions immunitaires. Deux groupes de faible affinité existent : les FcγRIIa/b/c et les FcγRIIIa/b, FcγRIIb étant le seul inhibiteur. Plusieurs polymorphismes, modifiant l’affinité au ligand et la réponse du récepteur, sont favorisés par une pression de sélection infectieuse et associés aux Maladies Auto-Immunes (MAI). Nous avons étudié l’association des polymorphismes FcγRIIa-R131H, FcγRIIb-I232T, FcγRIIIa-F158V, FcγRIIIb-Na1/Na2 aux Lupus érythémateux systémique (LES), la neuromyélite optique (NMO) et la sclérose en plaque (SEP) en Martinique. Nos résultats montrent une forte fréquence des allèles T232, V158 et des génotypes 232TT et 158VV dans la population générale, une augmentation de la fréquence de l’homozygote Na1, des allèles Na1 et 158F dans le LES, une augmentation du génotype 131RR ainsi que des allèles 131R et 158V dans le LES avec atteinte rénale, une augmentation du génotype 131RR et une diminution du NA2/NA2 dans la SEP ainsi qu’une augmentation de l’allèle 232T dans les NMO. L’étude de l’influence du FcγRIIb-I232T sur l’activation du récepteur à l’antigène des lymphocytes B (BCR) chez des lupiques et des témoins sains porteurs des formes IT, TT ou II montre que la régulation du BCR est effective même en présence de la forme TT. Ces résultats démontrent pour la première fois que la population martiniquaise possède un terrain génétique particulier qui faciliterait l’apparition de MAI avec pronostic plus sévère. / Receptors of Fc of Immunoglobulin G (FcγR) are involved in many immune responses. Two low affinity groups exist: FcγRIIa/b/c, and FcγRIIIa/b, FcγRIIb is the only inhibitor. Several polymorphisms, altering the affinity ligand and receptor response, are selected by an infectious pressure and associated with autoimmune diseases (AID). We studied the association of polymorphisms FcγRIIa-R131H, FcγRIIb-I232T, FcγRIIIa-F158V, FcγRIIIb-Na1/Na2 to systemic lupus erythematosis (SLE), neuromyelitis optica (NMO) and multiple scelrosis (MS) in Martinique. Our results show a high frequency of alleles T232, V158 and 232TT and 158VV genotypes in Martinican, an increase in the frequency of the homozygous Na1, Na1 and 158F alleles in SLE, an increase of 131RR genotype, the 131R and 158V alleles in SLE with kidney disease, an increase of 131RR genotype and a decrease of NA2 / NA2 in MS but an increase in the 232T allele in NMO. Study of the influence of FcγRIIb-I232T on the activation of the B cells receptor (BCR) in lupus and healthy controls controls exibiting IT, TT or II forms, shows that the regulation of BCR is effective even in the presence TT form. These results show for the first time Martinican population has a particular genetic background which would facilitate the appearance of MAI particularly serious.

Lors de la reconnaissance de leur antigène spécifique, les lymphocytes B vont s’activer et interagir avec les autres cellules des organes lymphoïdes secondaires (cellules folliculaires dendritiques, lymphocytes T, …) pour former un centre germinatif où le locus IgH va être remanié afin d’accroitre l’affinité des immunoglobulines pour l’antigène (grâce à l’hypermutation somatique des régions variables (SHM) et de décliner l’activité effectrice des anticorps selon plusieurs types de fonction grâce à la commutation de classe des régions constantes ou « switch u CSR», afin d’éliminer selon diverses stratégies l’antigène . Ces deux mécanismes sont initiés par l’Activation Induced Deaminase (AID) qui cible l’ADN au niveau des cytosines pour les changer en uracile, aboutissant à des cassures simple brin ou double brin lorsque que les mésappariements sont proches les uns des autres.Il a été montré qu’AID est capable de cibler la région régulatrice en 3’ du locus IgH au niveau de régions LS, action qui aboutit à la délétion complète des gènes C du locus, à la perte de l’expression du BCR et à la mort cellulaire lors de la recombinaison suicide du locus (LSR). Dans notre étude, nous avons réalisé un modèle knock-in du gène Cμ humain en aval de la dernière région LS dans le but de sauver les cellules B réalisant la LSR sur les dernières régions LS par l’expression d’un BCR humanisé (modèle LSR-μKI). Notre modèle indique que l’insertion du gène Cμ humain en aval de l’élément hs4 de la 3’RRpermet en effet de remplacer certaines recombinaisons LSR par un switch vers l’expression d’IgM humanisée », et module en outre qualitativement certains aspects de la réponse immunitaire humorale. Notre modèle « rapporteur » de la LSR suggère aussi que l’évènement de LSR est un phénomène régulé qui augmente avec l’activation B. L’étude ex vivo de cellules B issues du modèle suggère que la LSR est possible lors d’une réponse T indépendante comme T dépendante. Elle se montre aussi inductible par les ligands TLR4 mais non TLR9. L’étude du répertoire des IgM humaines indique une utilisation biaisée des familles de VH, avec notamment sur utilisation de la famille VH5murine, suggérant donc que l’incidence de la LSR varie avec la structure des régions variables du BCR et pourrait donc être dépendante de l’affinité contre des antigènes/ligands qui restent à caractériser. / After antigen recognition, B cells are activated and interact with other cells within secondarylymphoid organs (dendritic cells, T lymphocytes …) to form a germinal center. In the GC, the IgH locusis reorganized in order to increase the affinity of immunoglobulins for antigen through somatichypermutation (SHM) of V(D)J regions and to configure them into several forms harboring diversifiedmodes of action after “class switc recombination” (CSR). Both mechanisms are initiated by ActivationInduced Deaminase (AID) which targets DNA cytosines to convert them into uracil, then causing singleor double strand breaks in DNA when the mismatchs are located close to each other. It has been shownthat AID can target the IgH locus 3’ regulatory region on specific regions called LS, then leading to thetotal deletion of IgH locus C genes, loss of BCR expression and cell death by locus suicide recombination(LSR). In our study, we created a human Cμ knock-in model distal to the hs4 element of the 3’RR, in anattempt to rescue cells after the LSR event. Our model showed that this insertion indeed succeededinto replacing LSR by “class switching to humanized IgM” and also qualitatively modulated someaspects of the humoral response. This new LSR reporter model additionally supports the hypothesisthat LSR is regulated and increases with B cell activation. Studies of ex vivo B cells from the modelsuggest that LSR can occur in T dependent and independent manners, but is induced by triggering TLR4but not TLR9. Studies of the human IgM repertoire showed a biased use of VH families, and notably themouse VH5 family was used more frequently than in the control group. The BCR repertoire bias stronglysuggests that LSR is at least in part a matter of affinity of the BCR variable regions for antigens andligands that remain to be characterized.

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Lors d’une réponse immune, les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) interagissent entre elles. La synapse immunologique (SI), interface de contact entre les deux cellules, est le site où une cascade de signalisation se met en place. Les lymphocytes T subissent alors un profond réarrangement au niveau de la membrane plasmique et du cytoplasme : les protéines impliquées dans cette signalisation sont alors recrutées à la synapse immunologique. Nous nous intéressons à une nouvelle structure appelée “l’antisynapse” qui se localise au pôle opposé à celui de la synapse immunologique. L’objectif de notre étude est de déterminer la composition de cette nouvelle structure et sa cinétique d’apparition et de disparition. Afin d’étudier cette structure, nous faisons des conjugués in vitro entre des CPA et des lymphocytes T et nous observons la formation de ces contacts sur cellules vivantes ou cellules fixés. L’antisynapse est composée de molécules de signalisations que l’on retrouve classiquement à la synapse immunologique, tels que LAT, CD3, lck ou la PI3K. Grâce à la sonde fluorescente ROZA récemment développée au laboratoire1, nous avons montré que la kinase ZAP-70 est activée à l’antisynapse. Ces observations sont cohérentes avec le fait que nous avons déjà observé la présence de protéines avec des tyrosines phosphorylées à ce pôle. Cette structure précoce et transitoire s’observe fréquemment et apparaît très souvent avant que la synapse ne puisse être détectée. Son apparition est indépendante de la signalisation en aval du TCR et peut être déclenchée par un signal d’adhésion. D’autre part, le cytosquelette de microtubules semble jouer un rôle majeur dans sa disparition. Le rôle de l’antisynapse est toujours en cours d’étude mais nous avons déjà pu montrer qu’elle constituait un point de stockage pour les protéines destinées à former la synapse immunologique au moment de sa formation. Grâce à cette structure nous essayons de mieux comprendre comment le signalosome s’assemble dans la cellule T. Nous voulons également comprendre comment une telle structure peut apparaître aussi rapidement et quelles sont les voies de signalisation mises en jeu dans sa formation. / During the immune response, T lymphocytes and antigen presenting cells (APC) are known to develop strong interactions. The immunological synapse (IS), structure established at the interface between the two cells, is the site where a cascade of signaling events is initiated and may lead to a physiological response. T lymphocyte undergoes a profound rearrangement in the plasma membrane and in the cytoplasm: proteins which are involved in the signaling are recruited to the immunological synapse. We have recently described a new structure that we have called antisynapse (ASI), located at the cell pole opposite to the synapse1. The purpose of this work is to characterize the components of this new structure and their kinetic of appearance and disappearance. To study this structure, we made in vitro contact between APC and T lymphocytes and we observed these conjugates either in live or fixed conditions. Surprisingly, the antisynapse contains most of the signaling molecules classically reported as components of the immunological synapse such as LAT, CD3, Lck or PI3K. By using the fluorescent probe ROZA that we recently developed1, we have shown that ZAP-70 is activated at the antisynapse. This observation is consistent with the fact that we have also observed the presence of tyrosine-phosphorylated proteins at the ASI. Interestingly, we have observed that LFA-1, a protein involved in the adherence, is also found at the ASI. Our results indicate that this transient structure develops frequently and appears rapidly after the contact between the T cell (around one minute) and the APC. Surprisingly, antisynapse formation is independent on TCR signaling but is triggered by adhesion. Furthermore, it disappears using the microtubule network. The role of the antisynapse is currently under investigation but we have shown that it constitutes a stock of proteins ready to go to the forming immune synapse. We currently try to take advantage of this structure to better understand how the T cell signalosome may assemble and to find out if, functionally, the T cell takes advantage of this structure. We also try to understand how this paradoxical structure can appear so rapidly and what are the signaling pathways involved in its establishment.

Modulation de la réponse lymphocytaire T par IL4I1 - RESUME : L’enzyme Interleukin-four Induced Gene 1 (IL4I1), qui dégrade la phénylalanine, est exprimée par des cellules présentatrices d’antigène (CPA) en réponse à des stimuli pro-inflammatoires. Elle affecte la prolifération et les fonctions lymphocytaires T et pourrait donc participer au rétrocontrôle des réponses immunitaires. Cependant, les mécanismes d’action d’IL4I1 restent encore mal connus. Mon projet de thèse a comporté deux axes. Dans un premier axe, j’ai participé à la caractérisation du rôle d’IL4I1 dans la différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs et T auxiliaires effecteurs. Dans mon deuxième axe, qui représente la majeure partie de mon travail, j’ai analysé l’action d’IL4I1 sur les évènements précoces de l’activation T. J’ai observé qu’IL4I1 inhibe la phosphorylation de ZAP70 dès les premières minutes d’activation. Ce défaut se propage aux trois voies de signalisation principales : la voie calcique, la voie des MAP kinases et la voie NFκB. Elle retentit secondairement sur la capacité à former des synapses avec les CPA, ainsi que sur l’expression de différents marqueurs membranaires d’activation. L’activité enzymatique d'IL4I1 n’est pas responsable du défaut d’activation observé. L’étude des synapses CPA-T a montré une polarisation des vésicules de sécrétion contenant IL4I1 en direction de la cellule T ainsi qu’occasionnellement leur présence au contact du lymphocyte T. Des expériences complémentaires confirment la fixation d’IL4I1 sur les lymphocytes T. Ces données suggèrent un nouveau mécanisme d’action d’IL4I1 dépendant de sa liaison à un récepteur membranaire de la cellule T. - Mots clefs : Interleukin-4 induced gene 1 (IL4I1), enzyme immunosuppressive, signalisation du lymphocyte T / Modulation of the T cell response by IL4I1 - SUMMARY: The enzyme Interleukin-four Induced Gene 1 (IL41I), which degrades phenylalanine, is expressed by antigen presenting cells (APC) in response to pro-inflammatory stimuli. IL4I1 modifies the proliferation and function of T lymphocytes, and may participate in the negative feedback of the immune response. Its mechanism of action remains poorly understood.My thesis project included two tasks. In the first task, I participated in the characterisation of the role of IL4I1 in naive CD4+ T cell differentiation into regulatory and helper T lymphocytes. In the second task, and the main part of my thesis, I have studied the effect of IL4I1 on early T cell activation. I observed that ZAP70 phosphorylation was rapidly decreased after TCR stimulation. This alteration was transmitted to the three main downstream signalling pathways: calcium fluxes, the MAP kinase pathway, and the NFκB pathway. The enzymatic activity of IL4I1 was not responsible for the observed decreased activation. Analysis of the APC-T cell synapse showed the polarised secretion of IL4I1 toward the T cell. Labelling of IL4I1 was sometimes detected directly on T lymphocytes. Complementary experiments indicate that IL4I1 binds to T lymphocytes. These data suggest a new mechanism of action of IL4I1 dependent on its ability to bind a membrane receptor on T lymphocytes. - Key-words: Interleukin-4 induced gene 1 (IL4I1), Immunosuppressive Enzyme, T lymphocyte signalling.

La protéine D393-CD20, codée par un transcrit alternatif du gène cd20 découvert au laboratoire en 2010, est expriméedans les lymphocytes B (LB) tumoraux et surexprimée lors de résistance et rechute aux traitements par Rituximab(Henry et al, Blood 2010).Lors de nos travaux, cinq variants alternatifs de cd20, homologues à la séquence sauvage mais délétés d'une portioninterne, ont été identifiés par séquençage à partir de LB tumoraux. En plus de D393-CD20, 4 nouveaux variantsexistent : D657-, D618-, D480- et D177-CD20.Les variants D657- et D618-CD20 sont faiblement exprimés dans les LB de donneurs sains et surexprimés lors de lasurvenue de pathologies impliquant les LB, alors que D393-CD20 n'est exprimé que dans les LB tumoraux.L'étude par PCR quantitative du profil d'épissage de patients atteints de pathologies B ainsi que chez des donneurssains, a révélé une dérégulation de l'épissage de cd20 lors de la survenue de pathologies impliquant le LB.L'expression spécifique aux LB tumoraux de D393-CD20 suggère une dérégulation spécifique de l'épissage lors de lasurvenue de cancers, particulièrement au niveau des centres germinatifs.Si nos modèles in vitro de résistance démontrent que la présence de D393-CD20 n'est pas directement associée à larésistance aux AcMo, nous avons montré que ces derniers peuvent moduler l'épissage de cd20 par l'intermédiaire devoies de signalisation intra cellulaires.Ces résultats ouvrent donc la voie à une étude plus approfondie du potentiel biomarqueur et du rôle pronostique de la dérégulation de l'épissage du gène codant CD20, cible prépondérante des stratégies thérapeutiques des pathologies impliquant le lymphocyte B. / D393-CD20 is a protein encoded by an alternatively spliced transcript of human cd20 gene, expressed only on tumoralB lymphocyte (Henry et al, Blood2010).Based on this results, we decided to study the cd20 splicing in pathologies involving B cells.During this work, we identified 5 cd20 alternative transcripts, among them the D393-CD20 variant. The 4 others werenamed according to their size: D657-, D618-, D480- and D177-CD20.D657- and D618-CD20 are weakly expressed in healthy donor and overexpressed in pathologies involving Blymphocytes, whereas D393-CD20 is only expressed in B malignancies.Splicing pattern of patients suffering from pathologies involving B lymphocyte (cancers, auto-immune diseases, EBVinfection) were performed by quantitative PCR, and these patterns revealed a splicing deregulation in these pathologieswith a higher proportion of alternative variants compared with healthy dormors.The observation of a specifie expression of D393-CD20 in tumoral cells suggests a splicing deregulation associatedwith oncogenesis, particularly in lymphoma derived from germinal center.If in our in vitro models, no direct correlation between D393-CD20 expression and resistances to anti-CD20 antibodiestreatments hâve been observed, when shown that these antibodies induced cd20 splicing modulation.These results open the way to a deeper study to determine the interest ofcd20 splicing deregulation as a biomarker, andthe impact of theses deregulations on CD20 protein expression since these protein is a preponderant target of therapeuticstrategies used in pathologies involving B cells.

Senior horses (≥20 years) exhibit inflamm-aging, or chronic, low-grade inflammation that occurs systemically with aging, similarly to humans. Inflamm-aging has previously been characterized in the horse in circulation as well as specifically being mediated by lymphocytes and monocytes. In humans, inflamm-aging has been associated with increased morbidity and mortality. However, in the horse, relatively little about inflamm-aging is known regarding clinical effects or factors influencing severity. The contribution of lymphocytes to inflamm-aging of senior horses was examined, specifically through determining the relationships of inflamm-aging with various other health parameters, effects of seasonality, and the extent to which inflamm-aging can be modulated by anti-inflammatory phytonutrient curcumin. The overall hypothesis of this research is that lymphocyte-mediated inflamm-aging of the senior horse is associated with various factors including season, endocrine function, body composition, and nutritional status, and may be modulated by polyphenol curcumin. The effect of season on lymphocyte-mediated inflamm-aging was examined, and senior horses exhibited elevated inflammation compared to adult horse as expected, while also exhibiting changes in inflammatory cytokine production and gene expression throughout the year. In addition to season, pituitary pars intermedia dysfunction (PPID), a common endocrinopathy in senior horses that is associated with immunosuppression, was examined in a group of senior horses to determine any effects on degree of inflamm-aging. Results indicated no significant differences between age-matched PPID and non-PPID horses for lymphocyte-mediated inflammatory cytokine production or gene expression. The immunosuppressive aspect of PPID does not appear to be associated with the degree of lymphocyte-mediated inflammation of the aged horse. Additionally, an expansive correlative study was undertaken to determine relationships between inflamm-aging and basal nutritional status, body composition, age, and PPID within a similarly-managed senior horse population. Results showed various relationships between inflammatory markers and nutritional status, particularly yielding positive associations with serum folate and with serum fatty acids C22:2n6c and C22:5n3c. Inflammation was also associated with age itself but was not associated with body composition parameters and showed mild association with PPID (and serum inflammatory C-reactive protein). As a whole, this study demonstrates that nutritional status can be associated with inflammatory markers. Similarly, many phytonutrients have exhibited anti-inflammatory properties, which may be beneficial to the senior horse exhibiting inflamm-aging. Specifically, the effects of polyphenols including curcuminoids, resveratrol, quercetin, pterostilbene, and hydroxypterostilbene on lymphocyte production of inflammatory cytokines by senior horses were examined in vitro and found to significantly reduce inflammation similarly to common non-steroidal anti-inflammatory drugs. This study led to the in vivo investigation of the effectiveness of curcumin in modulating chronic inflammation of the senior horse. No significant differences were seen between groups receiving curcumin and placebo for the various inflammatory parameters, which may be due to the dose or low bioavailability of curcumin. As a whole, this research provides further understanding of factors associated with inflamm-aging of the senior horse.

Les LT CD4 folliculaires (TFH) forment un lignage distinct de LT contrôlant spécifiquement les lymphocytes B (LB) et la mise en place de la mémoire B. Alors que ces cellules étaient considérées comme des cellules effectrices uniquement, récemment il a été identifié, chez l'Homme et la souris, l'existence de TFH mémoires. Les TFH mémoires en tant que LT CD4 mémoires sont nécessaires, en cas de nouvelle rencontre avec l'antigène (Ag), à la mise en place d'une réponse Anticorps (Ac) rapide, efficace et de forte affinité. En effet, leur présence est corrélée à la génération et le maintien à long terme d'Ac de forte affinité lors d'infections virales. De plus, des études récentes montrent que l'analyse des TFH mémoires dans le sang périphérique peut fournir des indices pour comprendre le mode d'action des vaccins ainsi que la pathogenèse de maladies auto-immunes. Par ailleurs, dans le contexte de nombreuses maladies, de récents travaux suggèrent que l'évaluation de la fréquence et du phénotype des TFH mémoires dans le sang périphérique pourrait servir de bio-marqueur à l'établissement de diagnostique. Tout comme les cellules B mémoires qui sont subdivisées en différentes sous-populations en fonction de leur localisation et de la nature de leur Ac, différentes populations de TFH mémoires ont été récemment identifiées. Certaines se situent dans les organes lymphoïdes secondaires (OLS) drainants le site d'immunisation, de vaccination ou d'infection, ou circulantes dans les OLS non-drainants ou à proximité des plasmocytes à longue durée de vie dans la MO. Ces observations soulèvent donc la question majeure de leurs phénotypes, différences fonctionnelles et interactions face aux différentes populations de cellules B mémoires. L'objectif de mes travaux de Thèse a consisté à étudier l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle présente entre ces différentes populations de TFH mémoires aux localisations diverses. De plus au vu de l'hétérogénéité existante au sein des LB mémoires (nœuds lymphatiques ou rate) et plasmocytes à longue durée de vie (MO), nous avons aussi évalué l'interaction cellulaire et fonctionnelle qui a lieu entre ces populations mémoires. Dans ce contexte, nous avons développé un modèle expérimental unique de vaccination protéique chez la souris sauvage non modifiée. / T Helper Follicular (TFH) cells form a distinct lineage of helper T cells and they specifically control B cells and memory B cell generation. While these cells were considered as effector cells, recently it was identified in Human and in mouse, the existence of memory TFH cells. Memory TFH cells, as CD4 memory T cells, are necessary in case of antigen (Ag) rechallenge to establish a fast, efficient and high affinity Antibody (Ab) response. Indeed, their presence is correlated with the generation and the long-term maintenance of high affinity Ac during viral infections. Moreover, recent studies have shown that analysis of memory TFH cells in the blood may provide clues to understanding the mode of action of vaccines and the pathogenesis of autoimmune diseases. In addition, in the context of many diseases, recent works have also suggested that the frequency and phenotype of memory TFH cells in the blood could serve as a biomarker for diagnosis. Likewise to memory B cells that are subdivided into different cell populations based on their location and the nature of their Ab, different populations of memory TFH cells have recently been identified. Some are in secondary lymphoid organs (SLO) draining the site of immunization, vaccination or infection, or circulating in the non-draining SLO or near the long-lived plasma cells (PC) in bone marrow (BM). These observations raise the question of their phenotypes, functional differences and interactions with the different subsets of memory B cells. The aim of my thesis was to study the phenotypic and functional heterogeneity between the different subsets of memory TFH cells. Due to the heterogeneity of memory B cells (draining lymph nodes or non-draining spleen) and long-lived PCs (BM), we also evaluated the cellular and functional interaction that occurs between these different memories populations. In this context, we have developed a unique experimental model of protein vaccination in unmodified wild-type mice. Specifically, after immunization, we evaluated the development of memory TFH cells and memory B cells specific for the same Ag in the draining SLO and circulating in the spleen and BM. We demonstrated that local memory TFH cells (that reside in the draining SLO) exhibit a more polarized phenotype than their circulating counterparts (present in non-draining SLO).

Au cours du développement des lymphocytes B, le locus des chaînes lourdes des immunoglobulines (IgH) subit deux types de réarrangements intra-géniques : 1) La recombinaison V(D)J qui se produit aux stades précoces du développement lymphocytaire et qui cible les régions variables du locus, et 2) la commutation de classe initiée à un stade plus tardif du développement et qui permet aux cellules B d'acquérir de nouvelles fonctions effectrices suite au changement des domaines constants des Ig. Ces deux processus contribuent à la grande diversité du répertoire des anticorps, à la spécificité et à la vigueur de la réponse immunitaire. Durant ces deux processus, la transcription des gènes des Ig, appelée transcription germinale, a un rôle essentiel. Elle est une des clés de l'accessibilité de la chromatine aux enzymes nécessaires à l'initiation des recombinaisons. La transcription germinale est régulée par des éléments cis-régulateurs qui effectuent leur fonction à de longues distances au sein du locus IgH. Parmi ces éléments, la région de contrôle du locus appelée 3'RR (3' regulatory region) est un élément majeur de contrôle de l'expression du locus IgH aux stades tardifs du développement B. Cependant, son rôle aux stades précoces du développement était inconnu. Mon travail de thèse a visé à mieux comprendre la fonction de la 3'RR tout au long du développement des lymphocytes B avec une attention particulière aux stades précoces. Dans une première étude, nous avons analysé le rôle de la 3'RR dans la transcription germinale associée à la recombinaison V(D)J en utilisant une lignée murine dépourvue de la 3'RR. Nous avons d'abord mis au point une technique de PCR quantitative en temps réel afin de quantifier les réarrangements V(D)J. Nous avons ensuite montré que la 3'RR avait en fait une activité répressive sur la transcription sens et anti-sens du domaine variable du locus IgH, et que la transition d'un effet silencer à un effet activateur corrélait avec l'achèvement des réarrangements V(D)J. Dans une deuxième étude, nous nous sommes intéressés à l'effet de la 3'RR sur les promoteurs des gènes constants en utilisant deux modèles murins portant des mutations à des sites stratégiques du locus IgH. L'analyse phénotypique et moléculaire des deux modèles nous a permis de montrer que la 3'RR établissait un domaine transcriptionnellement actif dès les stades précoces du développement. Cependant, l'effet activateur de la 3'RR sur ses promoteurs cibles était bloqué à ces stades par un site de fixation du facteur architectural CTCF. La délétion de ce site ou l'insertion d'un promoteur dans le domaine transcriptionnel de la 3'RR délimité par le site CTCF, aboutissent à une activation prématurée et différentielle des promoteurs cibles. Mes travaux de thèse ont permis de définir, pour la première fois, la fonction de la 3'RR aux stades précoces du développement B, indépendants de l'activation antigénique, et de révéler des mécanismes développementaux plus complexes que la simple induction de la 3'RR initiée par la rencontre de la cellule B avec l'antigène. / During B cell development, the immunoglobulin heavy chain (IgH) locus undergoes two types of intragenic rearrangements: 1) V(D)J recombination at early stages of B cell development which targets the variable region of the locus, and 2) class switch recombination at the mature B cell stage which enables B cells to acquire novel effector functions upon a change of the constant domain of Ig molecules. Both processes contribute to the wide diversity of antibody repertoire, and to the specificity and robustness of an immune response. Transcription of recombining genes is associated with V(D)J recombination and classswitching. This transcription, called germline transcription, plays a key role in the accessibility of the chromatin of target sequences to the enzymes required for the initiation of recombination. Germline transcription is regulated by cis-acting elements that often act at long distances within the locus. Among these long-range elements, a locus control region called the 3' regulatory region (3'RR) is known to play a major role in IgH locus expression at late stages of B cell development. However, its role at early stages is unknown.The main objective of my PhD work was to contribute to a better understanding of the function of the 3'RR throughout B cell development, with a special focus on early stages. In a first study, we analyzed the role of the 3'RR in the regulation of germline transcription associated with V(D)J recombination by using a mouse line devoid of the 3'RR. We first set up a sensitive real-time PCR to quantify V(D)J recombination. We then went on to show that in fact, the 3'RR mediated a transcriptional silencing activity on both sense and antisense transcription along the variable region of the IgH locus, and that the switch off of this silencing activity correlated with the completion of V(D)J recombination, after which the 3'RR became a transcriptional enhancer. In a second study, we investigated the effect of the 3'RR on germline promoters of the constant genes by using two murine models bearing specific mutations at strategic sites of the IgH locus. Phenotypic and molecular analyses of the two models enabled us to show that the 3'RR establishes a transcriptionally active domain at early stages of B cell development, upon completion of V(D)J recombination. Nonetheless, the activating effect of the 3'RR on constant genes at early stages is insulated by the architectural factor CTCF. Deletion of this CTCFbinding site or insertion of a germline promoter within the 3'RR-mediated transcriptionally active domain, led to specific and premature activation of target germline promoters. My PhD work enabled us to elucidate for the first time the developmentally regulated function of the 3'RR at early stages of B cell development, prior to antigen challenge. It also revealed a more complex picture of the 3'RR function than the hitherto simple induction of the 3'RR upon encounter with antigen.

A l’instar des lymphocytes T régulateurs, l’étude de populations lymphocytaires B au potentiel immunosuppresseur a émergé ces dernières années. La capacité immunosuppressive des lymphocytes B régulateurs CD24hi CD38hi passant notamment par leur capacité à exprimer l’IL-10 a été mise en évidence dans plusieurs pathologies notamment chez les patients atteints de maladies auto-immunes. En transplantation rénale, le rôle de ces cellules dans la tolérance du greffon a également été suggéré. Néanmoins, la caractérisation de ces cellules semble très controversée et complexe. En effet à ce jour, il n’a été mis en évidence aucun marqueur spécifique permettant d’identifier clairement cette population régulatrice chez l’homme. L’analyse transcriptomique de ces cellules issues de donneurs sains nous a permis de mettre en évidence de nouveaux marqueurs qui leur sont associés tels que CD9, CD10, CD5, ICOS-L (inducible T cell co-stimulator ligand), GARP (glycoprotein-A repetitions predominant protein) et CD1b. Nous avons pu montrer que la présence de ces marqueurs était corrélée à l’expression d’IL-10 et que l’expression de CD1b sur les cellules CD24hi CD38hi était associée à une augmentation de la capacité suppressive de ces cellules. La présence de ces cellules CD1b+ a également été retrouvée en plus forte proportion chez les patients traités par belatacept identifiés comme présentant un meilleur pronostic clinique du greffon. Des résultats préliminaires suggèrent également que d’autres mécanismes peuvent être impliqués dans la fonction immunorégulatrice des LB CD24hi CD38hi comme la sécrétion de cytokines régulatrices telles que l’IL-35. L’identification de ces molécules permet d’améliorer la caractérisation et la compréhension des mécanismes immunorégulateurs de ces cellules et pourrait être d’une grande aide pour le monitoring immunologique de la réponse humorale en transplantation. / Like for regulatory T cells, many studies on B cells immunoregulatory functions have emerged in the past few years. The immunosuppressive capacity of CD24hiCD38hi regulatory B cells known for their ability to produce IL-10 has been demonstrated in several pathologies, in particular in autoimmune diseases. In kidney transplant, the role of these cells in graft tolerance has also been suggested. So far, accurate phenotypic and functional analyses of these Breg are still lacking. Transcriptomic miccroarray analysis of CD24hiCD38hi B cells from healthy donors led us to identify new phenotypic markers as CD9, CD10, CD5, ICOS-L (inducible T cell co-stimulator ligand), GARP (glycoprotein-A repetitions predominant protein) and CD1b. We showed a link between this markers and IL-10 expression and we demonstrated that a CD1b marker on CD24hiCD38hi B cells was associated with an increase of regulatory properties. Breg CD24hiCD38hiCD1b+ was also found in higher frequencies in kidney transplant recipients treated with belatacept. Finally, preliminary results also suggest that other regulatory mechanisms may be involved in immunoregulatory function of CD24hiCD38hi B cells, especially through immunoregulatory cytokines such as IL-35. The identification of these molecules can improve characterization and understanding of immune-regulatory mechanisms of these cells and could be helpful in humoral response immuno-monitoring in transplantation.