B-cells of peripheral blood in humans represent a heterogeneous cellular environment displaying many important functions in the immune system. Recently, there is an increasing amount of evidence that B cell subpopulations are involved in the pathogenesis of many different diseases. However, there is little or no knowledge on how the individual differentiation stages of B lymphocytes are involved in pathological processes, and how they are distributed and represented under the physiological state and under pathological conditions. There is a reasonable assumption that, as with dendritic cells, NK / NKT cells and T lymphocytes, also B cell populations will contain minor and/or rare subpopulations reaching relative frequencies in the range of 0.01% to 0, 1 ‰. The primary aim of this thesis was to investigate the extent of phylogenetic and ontogenetic heterogeneity of the peripheral B cell population and lymphopoietic tissues on the basis of a comparative study across different vertebrate species. Another goal of the work was to use polychromatic flow cytometry with 183 individuals, out of them 50 controls and 133 patients with different (immune) pathologies or tumors in order to identify an optimal combination of surface features, and to use it to detect and demonstrate the existence of minor/rare...

The immune system will maintain the integrity of the organism from harmful non-malicious recognizes and protects the body against exo- and endogenous toxic substances and together with the nervous and endocrine system are among regulatory systems of the organism. Recently the evidence has supported the emerging concept of different B cell subpopulations to play a direct or indirect role in a pathogenesis of spectrum of disorders. However, so far the knowledge has been limited mainly in the way of how the specific differentiation stages of B lymphocytes are involved in pathogenesis of diseases and how course of disease, stage, and eventually different treatment can affect B cell homeostasis. This work is focused on the study of peripheral CD27+ B lymphocytes (one of the least explored human B lymphocytes) in healthy controls and patients with various immunopathologies, in this case we present representative results for patients with inflammatory bowel disease. Using polychromatic flow cytometry we examined 31 of peripheral blood samples, including 14 controls, 7 patients with Crohn's disease (CD) and 5 with ulcerative colitis (UC). In 6 patients with CD, we were able to perform immunophenotyping also 2 hours after intravenous administration of infliximab, and in one patient 14 days after drug...

Abstract Food hypersensitivities are becoming increasingly common worldwide. Previous studies indicate that cell mediated immunity has a role in delayed paediatric gastrointestinal food hypersensitivities, but the exact pathogenetic mechanisms are unknown. Cytotoxic activation of T-lymphocytes is known to play an important role in the pathogenesis of celiac disease (CD). The pathogenetic mechanisms of cow's milk protein sensitive enteropathy (CMSE) are largely unknown. CMSE is a non-IgE related type of food hypersensitivity with variable gastrointestinal symptoms but no visible mucosal abnormalities on light microscopy. The diagnosis is based on an open or blinded elimination/challenge test, as the endoscopic, histological and laboratory findings are generally non-specific. This thesis aims to characterize the role of lymphocyte cytotoxicity in the pathogenesis and diagnosis of CMSE in preschool and school aged children, including comparison with CD where the pathogenetic significance of cytotoxicity is well established. The study cohort consisted of 151 children, including 57 with untreated CMSE, 18 with treated CMSE, 24 with CD, and 52 controls. Using immunohistochemistry, the mucosal expressions of cytotoxic T cell-restricted intracellular antigen type 1 (TIA-1), perforin, granzyme A and B were analysed in the duodenal bulb and descending duodenum. Intraepithelial T-lymphocytes were labelled with CD3, alpha/beta and gamma/delta T cell receptor antigens. To determine the rates of overall and epithelial apoptosis as well as proliferation, the immunohistochemical TUNEL technique, M30 and Ki-67 antibodies were used. Serum levels of granzymes, CD30 and soluble Fas were studied using ELISA method. The number of intraepithelial lymphocytes with TIA-1, perforin and granzyme A containing granules was increased in CMSE. This increase was related to antigen challenge and not a constitutional abnormality. The cytotoxic reaction in CMSE differed from that in CD by being of lesser magnitude, concerning predominantly the descending duodenum and not showing signs of cytotoxicity related epithelial destruction. The serum levels of GrA, GrB and CD30 were increased in both CMSE and CD, correlating with the number of duodenal CD3+, alpha/beta and gamma/delta+ intraepithelial lymphocytes. The results strongly support the role of cell-mediated immunity in the pathogenesis of CMSE. Mucosal cytotoxic activation seems to be manifested by the release of cytoxicity related proteins in serum. This provides a new approach to the monitoring of intestinal immune activation which could help in diagnosis and in objectively monitored treatment response.

Dans le thymus, la présentation par les cellules stromales thymiques (cellules épithéliales (TEC) ou dendritiques (DC)) de peptides dérivés de protéines du soi associés au complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II) est un mécanisme essentiel au développement des lymphocytes T CD4 (LT CD4) et à la sélection du répertoire de récepteur à l'antigène (TCR) qu'elles expriment. Ainsi, une interaction de faible intensité entre le TCR exprimé par les thymocytes et les complexes pMHC est nécessaire à la sélection positive des thymocytes alors qu'une interaction de forte affinité conduira à la délétion. L'apprêtement des protéines dans la voie de présentation du CMH-II dépend d'une protéolyse séquentielle impliquant un ensemble de protéases de spécificité relativement imprécise. Ainsi des protéases peuvent promouvoir ou empêcher la génération de certains peptides pouvant se lier aux molécules de CMH-II. La protéase à sérine spécifique du thymus (TSSP) est exprimée dans le thymus par les TEC du cortex et les DC thymiques, mais pas par les DC en périphérie. Différentes études suggèrent que TSSP serait une protéase de la voie de présentation du CMH-II qui limiterait par des mécanismes encore inconnus la présentation de certains antigènes du " soi " dans le thymus et notamment par les DC. Ainsi TSSP limiterait la tolérance au " soi " dans le thymus. Notamment, nous avons montré que les souris NOD déficientes en TSSP (NOD Tssp°) sont résistantes au diabète de type 1 (T1D) corrélé à une délétion accrue de cellules T CD4 spécifiques de certains antigènes associés au T1D. Ainsi, les souris NOD Tssp° sont partiellement tolérantes à S100ß, un antigène des îlots de Langerhans associé au développement du T1D. Afin de mieux comprendre l'impact de la sélection négative sur le répertoire autoréactif, nous avons analysé le répertoire de cellules T CD4 spécifiques de S100ß chez des souris NOD sauvages (WT) et NOD Tssp°. Bien que relativement divers, le répertoire TCRaß présente, dans les deux souches de souris, un biais pour des réarrangements TCRa dominants et publics de faible avidité. Des cellules T CD4 de forte avidité exprimant un répertoire privé sont retrouvées chez les souris NOD WT mais sont sélectivement délétés chez les souris NOD Tssp°. Ainsi, l'augmentation de la disponibilité en antigène favorise la délétion de cellules T de fortes avidité. Parallèlement, nous avons analysé l'effet de l'absence de TSSP sur le développement d'une autre pathologie autoimmune médiée par les cellules T CD4, l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) induite par le peptide MOG35-55. Les souris NOD Tssp° développent une pathologie moins sévère que les souris sauvage. Cette réduction de sévérité résulte, au moins en partie, d'une diminution de l'avidité et de la fonctionnalité des cellules T CD4 encéphalitogènes spécifiques de MOG35-55. L'ensemble de ces travaux et les études précédentes de notre équipe suggère que TSSP, en régulant négativement la présentation antigénique, empêche la tolérance au soi et ainsi favorise l'émergence d'un répertoire TCR autoréactif de haute avidité pour l'antigène. Dans ce contexte, le maintien de TSSP au cours de l'évolution est surprenant. Néanmoins, l'absence de TSSP entraîne également une réduction de réponse spécifique de certains antigènes du non soi. Ainsi, dans le thymus, TSSP en limitant la tolérance au soi permettrait une diversification du répertoire TCR. / In the thymus, the presentation by thymic stromal cells (epithelial (TEC) or dendritic cells (DC)) of peptides derived from self-proteins associated with the major histocompatibility complex class II (MHC-II) is an essential mechanism for the development of CD4 T cells (CD4) and selection of their antigen receptor (TCR) repertoire. Thus, a low intensity interaction between the TCR expressed by thymocytes and pMHC complexes is necessary for the positive selection of thymocytes while a high affinity interaction lead to its deletion. The processing of proteins for MHC-II presentation pathway is dependent of sequential proteolysis involving a set of protease with a relatively imprecise specificity. Proteases can therefore promote or inhibit the generation of certain peptides that can bind to MHC-II molecules. The thymus specific serine protease (TSSP) is expressed in the thymus by cortical TEC and thymic DC, but not by DC in the periphery. Various studies suggest that TSSP is a protease of MHC-II presentation pathway which could limit, by some unknown mechanisms, the presentation of certain self-antigens in the thymus and in particular by DC. Thus, TSSP might limit self-tolerance in the thymus. In particular, we have shown that TSSP-deficient NOD mice (NOD Tssp°) are resistant to type 1 diabetes (T1D) correlated with an increased deletion of CD4 T cells specific for certain antigens associated with T1D. Thus, NOD Tssp° are partially tolerant to S100ß, a Langerhans islet antigen associated with the development of T1D. To better understand the impact of negative selection on the self-reactive repertoire, we analyzed the S100ß-specific CD4 T cells repertoire of NOD wildtype (WT) and NOD Tssp° mice. Although it's relatively diverse, the TCRaß repertoire presents, in both strains of mouse, a bias to low-avidity dominant and public TCRa rearrangements. High avidity CD4 T cells expressing a private repertoire are found in NOD WT mice but are selectively deleted in NOD Tssp° mice. Thus, increasing the availability of antigen promotes high avidity T cells deletion. In parallel, we analyzed the effect of the absence of TSSP on the development of another autoimmune disease mediated by CD4 T cells, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by the MOG35-55 peptide. NOD Tssp° mice develop a less severe pathology than WT mice. This reduction of severity results, at least in part, in a decrease of avidity and functionality of encephalitogenic MOG35-55- specific CD4 T cells. Taken together, this work and previous studies from our team suggests that TSSP, by negatively regulating antigen presentation, prevents self-tolerance and thus promotes the emergence of a self-reactive TCR repertoire of high avidity for the antigen. In this context, maintaining TSSP during evolution is surprising. Nevertheless, the absence of TSSP also reduces the specific response against some non-self-antigens. Thus, in the thymus, TSSP by limiting self-tolerance would allow the diversification of the TCR repertoire.

Le répertoire T CD8 préimmun correspond aux lymphocytes T spécifiques d'antigène circulant en périphérie, et n'ayant pas encore été activés. Ces cellules sont très rares, et de ce fait, n'ont jusqu'ici pas pu être étudiées de façon approfondie. Nous avons dans un premier temps développé un protocole d'enrichissement basé sur la technologie des tétramères. Nous avons pu détecter et énumérer des lymphocytes T CD8 naïfs spécifiques d'antigènes dans le sang de sujets sains. Nous avons ensuite utilisé cet outil pour évaluer le répertoire T préimmun de patients chroniquement infectés par le virus de l'hépatite C (cHCV). Nous avons démontré que celui-ci est significativement perturbé, avec des cellules hypersensibles à l'activation TCR et une proportion importante de lymphocytes T de phénotype mémoire alors qu'ils n'ont pourtant pas rencontré leur antigène cible. Ces anomalies disparaissent après résolution de l'infection, soulignant l'intérêt d'instaurer précocément un traitement antiviral chez ces patients. Enfin, nous avons observé dans un modèle de souris transgéniques (OTI) une proportion importante de T inexpérimentés de phénotype mémoire chez les animaux non-immunisés déficients en cxcr3. Nos travaux démontrent que les lymphocytes T inexpérimentés peuvent perdre leur naïveté dans différentes situations pathologiques. Ces résultats devraient être pris en considération pour l'optimisation de futures stratégies d'immunothérapie, notamment lorsque des patients dits "inflammatoires" sont la cible de vaccinations. Enfin, nos résultats soulignent la difficulté d'interpréter les données d'immunophénotypage en l'absence d'information sur la spécificité antigénique. / The CD8 preimmune repertoire is defined as the set of circulating antigen-specific T CD8 lymphocytes that have not been activated yet by their cognate antigen. Because those cells are very rare, they have not been evaluated in humans. We developed a tetramer-based enrichment protocol that allowed for the first time direct detection and enumeration of those rare naive antigen-specific CD8 T cells in healthys. We then used this tool to characterize the CD8 preimmune repertoire in patients with chronic hepatitis C viral infection. We found that their naive CD8 T cells are dysregulated, being hypersensitive to TCR signals, and with increased proportions of memory-phenotype (MP) cells in inexperienced populations. These perturbations are reversible after viral clearance, highlighting the added benefit of early antiviral treatment. Finally, using a transgenic model (OTI), we observed high proportions of MP inexperienced T cells in the blood of cxcr3-deficient unimmunized mice. This suggests that CXCR3-dependent lymphocyte trafficking could account for some preimmune repertoire alterations. Altogether, our work demonstrates that inexperienced T cells can lose their naiveté in several pathological situations. The impact of these findings will need to be considered when designing future immunotherapeutic strategies - especially when « inflammatory » patients are being targeted. Additionally, we highlight the challenge of interpreting T-cell immunophenotyping studies without getting knowledge into antigen-specific populations.

L'interleukine-2 (IL-2) est nécessaire à l'homéostasie des lymphocytes T régulateurs CD4+ Foxp3+ (Tregs) et son administration à faibles doses permet d'induire une expansion spécifique et dose-dépendante de ces cellules. Nous avons précédemment démontré que l'administration d'IL-2 à faibles doses permet de restaurer la tolérance immunitaire chez la souris NOD (modèle murin de diabète autoimmun). Toutefois cette stratégie n'est efficace à long terme que chez 30% des souris traitées.Mon travail de thèse a porte? sur l'amélioration de la thérapie par faibles doses d'IL-2. Dans un premier temps, nous avons démontré que la combinaison de l'IL-2 avec la rapamycine, une drogue ciblant préférentiellement les lymphocytes T effecteurs et épargnant les Tregs, ne permet pas d'améliorer le traitement. Au contraire, la rapamycine abolit de façon transitoire la tolérance induite par l'IL-2. Dans un deuxième temps, nous avons essayé d'augmenter les doses d'IL-2, dans le but d'induire une activation plus forte des Tregs. Néanmoins, le traitement par fortes doses d'IL-2 ne prévient pas le diabète autoimmun mais accélère son développement et est associé à une très forte toxicité.Ensuite, un deuxième axe de ma thèse s'est articulé autour de notre découverte de l'existence d'autoanticorps anti-IL-2 neutralisants chez la souris NOD et les patients souffrant de diabète de type 1. Ces autoanticorps modulent négativement l'homéostasie des Tregs in vivo, suggérant un rôle potentiel dans la physiopathologie du diabète autoimmun.Dans l'ensemble, ces résultats permettent de reconsidérer l'utilisation de l'IL-2 à faibles doses, seule ou combinée, dans le contexte du diabète de type 1. / CD4+ Foxp3+ regulatory T cells (Treg cells) are essential for the maintenance of immune tolerance. Interleukin-2 (IL-2) is mandatory for the homeostasis of Treg cells and its administration at low-doses induces a specific dose-dependent boost of Treg cells. Previous work has demonstrated that a short-tem treatment with low-doses IL-2 can revert established autoimmune diabetes in the NOD mouse model. However, this strategy induces long-term reversal in only 30% of the treated mice and can be optimized. During my PHD, my work has focused on the optimization of T1D therapy with low-doses of IL-2. First, we tried to combine low-doses of IL-2 with rapamycin, an immunosuppressive drug known to mainly affect Teff cells. The combined treatment (IL-2/Rapa) did not induce diabetes reversal and even reversibly broke IL-2-induced tolerance. Then, we tried to increase the IL-2 dose in order to increase the amplitude of the Treg boost. However, despite an important Treg cell boost, high-doses IL-2 administration to pre-diabetic NOD mice was toxic and precipitated T1D onset. In a second project, we described the existence of neutralizing anti-IL-2 autoantibodies in NOD mice and T1D patients. Our data suggested that anti-IL-2 autoantibodies negatively impacted on Treg cell homeostasis in vivo, contributing to the impaired immune tolerance observed in NOD mice and T1D patients. Altogether, our results lead to the consideration of low-doses IL-2, alone or combined, for the treatment of T1D. In addition, our demonstration of the existence of anti-IL-2 autoantibodies in NOD mice and T1D patients leads to a better understanding of T1D physiopathology.

Les mastocytes sont des cellules immunitaires présentes dans tous les tissus de l'organisme. Ils ont été depuis longtemps associés aux réponses allergiques, mais ces cellules sont aussi des acteurs majeurs de la réponse inflammatoire. La dégranulation des mastocytes, ou exocytose des granules sécrétoires, est un mécanisme d'action important de ces cellules. Au laboratoire, nous avons mis au point une méthode innovante qui nous permet de suivre en temps réel la dynamique de cette dégranulation. Cette méthode repose sur l'utilisation de l'avidine couplé à un fluorochrome qui se lie spécifiquement à la matrice des granules. Nous avons recherché les modalités de la dégranulation lorsque les mastocytes sont activés par un ligand cellulaire comme des cellules cibles recouvertes d'anticorps. Nous avons pu mettre en évidence, de façon surprenante, que les mastocytes dégranulent de manière polarisée contre une cellule cible opsonisée avec des anticorps de type IgE ou IgG en mettant en place un nouveau mécanisme que nous avons nommé ADDS (Antibody Dependent Degranulatory Synapse). L'ADDS est caractérisée par une signalisation du récepteur RFc et une dépolymérisation du cytosquelette cortical d'actine locales. De plus, cette synapse peut aussi avoir lieu lorsque le mastocyte est au contact d'un parasite opsonisé comme Toxoplasma Gondii, et induit la mort du parasite et la libération de cytokines et chimiokines pro-inflammatoires. Nous avons ensuite analysé la dynamique de la dégranulation à l'échelle " single cell " et sa régulation par des facteurs inflammatoires. Grâce à une approche de " cell barcoding " et de cytométrie en flux en temps réel, nous avons pu mettre en évidence que la dégranulation induite par l'agrégation des RFc?I était contrôlée par deux mécanismes : un premier qui règle le nombre de mastocytes qui dégranulent et un second qui régule l'intensité de la dégranulation. L'interleukine 33 peut finement potentialiser ces deux mécanismes en augmentant le pourcentage de mastocytes qui dégranulent et l'intensité de la dégranulation. L'IL-33 induit ainsi l'émergence de cellules hautement inflammatoires. Dans un second axe de recherche, nous avons étudié quel pouvait être l'impact des prostaglandines dans le dialogue entre mastocytes et lymphocytes T CD4+ Helper (TH). Nos résultats indiquent un rôle insoupçonné de la prostaglandine D2 et la prostaglandine E2 comme des acteurs importants pour la production d'interleukine 17 par les LTH. En conclusion, mon travail de thèse nous a permis de révéler l'existence de la synapse dégranulatoire des mastocytes, de nouveaux mécanismes contrôlant la dégranulation et d'identifier les mastocytes comme une source importante de prostaglandines impliquées dans la polarisation des LTH. / Mast cells are tissue-resident immune cells particularly enriched in regions exposed to the external environment. They have been associated, for a long time, with allergic disorders but these cells are also major effectors of inflammatory response. The degranulation process, or granule exocytosis, is one of the main effector functions of mast cells and it has been implicated in various biological processes. In our laboratory, we have developed a new method to monitor live mast cell degranulatory response. This approach is based on fluorescent avidin that binds selectively mast cell granule matrix. Thanks to this method, we have investigated the degranulatory response following mast cell activation by cell bound antigens. We have shown that mast cells can undergo polarized degranulation toward IgE- or IgG-opsonized cells in a new mechanism we named ADDS (Antibody Dependent Degranulatory Synapse). The ADDS is characterized by a local signaling of FcR receptors and cortical actin depolymerisation. Moreover, this synapse takes place when mast cells are triggered by opsonized parasite Toxoplasma Gondii. It leads to the death of the parasite and the release of pro-inflammatory cytokines and chemokines. We next analyzed the mast cell degranulatory response dynamics at the single cell level and its regulation by alarmin IL-33. Using cutting-edge "cell barcoding" approach and live flow cytometry, we showed that Fc?RI mediated degranulatory response is controlled by two mechanisms: a first one that sets the frequency of degranulated mast cells and a second one that regulates the magnitude of the degranulation. The IL-33 fine tunes these two mechanisms by augmenting both the frequency of degranulated mast cells and the extent of individual mast cell degranulation. Our results indicate that interleukin 33 induces the emergence of high inflammatory mast cells. In a second axis of research, we analysed the influence of prostaglandins during the cooperation between mast cells and CD4+ T helper cells. Our results indicate that prostaglandin D2 and E2 produced by mast cells are important inducers of interleukin 17 by CD4+ T helper cells. Taken together, my thesis work revealed that mast cells can form degranulatory synapses, new mechanisms that control the degranulatory response and identified mast cells as a source of pro-IL-17 prostaglandins during their cooperation with CD4+ T helper cells.

La Broncho-Pneumopathie chronique obstructive (BPCO) est un problème majeur en santé publique puisque ce sera la 3ème cause de mortalité en 2020. Il s'agit d'une maladie inflammatoire chronique du poumon se traduisant par une obstruction progressive des bronches, partiellement ou non réversible, incluant bronchite chronique, hypersécrétion de mucus et emphysème. L'atteinte ne se limite pas au poumon et affecte d'autres organes dont le tube digestif en favorisant la maladie de Crohn. Le premier facteur de risque impliqué dans le développement de cette maladie est l’exposition à la fumée de cigarette qui induit un stress oxydatif au sein du poumon responsable d'une inflammation chronique et du développement de la BPCO. L'interleukine-17 joue un rôle essentiel dans ce processus en contrôlant l'inflammation et l'altération de la fonction respiratoire. L'objectif de cette thèse est de comprendre les facteurs contrôlant cette réponse IL-17 afin de proposer ensuite de nouvelles voies thérapeutiques. Dans la première partie, nous nous sommes focalisés sur le stress oxydatif et à son impact sur les cellules de l’immunité innée. Ensuite, nous abordons le rôle d'un facteur immunorégulateur, l'IL-10, et à son interférence avec le microbiote digestif. Cela nous a amené à nous intéresser aux lésions digestives associées au tabagisme. Un modèle murin d’exposition chronique à la fumée de cigarette a été développé afin de reproduire la physiopathologie de la BPCO. Concernant l'impact du stress oxydatif, nous avons étudié le rôle des cellules iNKT (cellules ayant un puissant potentiel dans l’immunorégulation et dans l’inflammation) qui sont activées par ce type de stress. Les cellules iNKT sont rapidement recrutées et activées au sein du poumon suite à l’exposition à la fumée de cigarette. En utilisant des souris déficientes, nous avons montré l’importance de ces cellules dans la physiopathologie de la BPCO. Cette pathogénicité est dépendante de la production de l’interleukine-17 par ces cellules et est initiée par le stress oxydatif sur les cellules épithéliales pulmonaires et les cellules dendritiques qui activent les cellules iNKT.Dans la seconde partie du projet, l’IL-10 intervient notamment dans le contrôle de l'inflammation afin d’éviter le développement de réponses immunologiques exacerbées dans certains contextes. Dans les poumons exposés à la fumée de cigarette, la production d’IL-10 est augmentée et la déficience pour cette cytokine entraîne une augmentation de la réponse Th17 et du déclin de la fonction pulmonaire. Une dysbiose (altération du microbiote) est observée avec la fumée de cigarette et la déficience à l'IL-10. De plus, une déplétion des bactéries Gram+ par antibiothérapie permet de limiter le développement de la réponse IL-17 et de l'atteinte pulmonaire soulignant l'importance du microbiote. En conclusion, nous avons identifié le stress oxydatif et l'IL-10 comme facteurs intervenant dans la réponse IL-17 associé à la BPCO. Ce travail souligne également le rôle du microbiome comme un organe à part entière et la modulation de ce dernier pourrait aboutir à l'identification de nouvelles voies thérapeutiques. / Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a major health problem which is going to become the third leading cause of death worldwide by 2020. COPD is characterized by a chronic inflammation of the airways causing progressive bronchial obstruction, with no completely reversible airflow limitation, including chronic bronchitis, mucus hypersecretion and emphysema. The pathology is not limited to the airways and can affect others organs including the gastro-intestinal tract promoting Crohn disease. Cigarette smoke exposure is the most important risk factor for developing COPD. Exposure to cigarette smoke induces a strong burden of reactives oxygen species and this oxidative stress is responsible for a chronic inflammation and the development of COPD. Interleukin (IL)-17 plays a critical role in controlling process of inflammation and lung function decline.The aim of this thesis is the understanding which factors are controlling the IL-17 response in order to propose new therapeutic approaches.In the first part, we focused on oxidative stress and its impact on innate immune cells. Then we addressed the role of an immunoregulatory factor, the interleukin (IL)-10, and its interference with intestinal microbiota. This part lead us to study intestinal damages linked to cigarette smoking.To mimic the physiopathology of COPD, we set up a mouse model of chronic exposure to cigarette smoke. Concerning the impact of oxidative stress, we investigated the role of iNKT cells (cells with a crucial potent role in immunoregulation and inflammation) activated by this type of stress. iNKT cells rapidly accumulate and be activated within the lungs of cigarette smoke exposed mice. Using deficient mice, we demonstrated that these cells strongly contribute to the COPD pathogenesis. This pathogenicity is iNKT cells-produced IL-17 dependant and initiated by the effect of oxidative stress on airway epithelial cells and dendritic cells activating iNKT.In the second part of the work, IL-10 interferes notably in the inflammation control in order to avoid exacerbated immunological responses development in some contexts. In cigarette smoke exposed lungs, IL-10 production is up-regulated and the deficiency for this cytokine leads to an increased Th17 response and to lung function decline. An altered microbiota (named dysbiosis) is observed with cigarette smoke exposure and IL-10 deficiency. Moreover, Gram+ bacteria depletion using antibiotics is able to limit the IL-17 response development and the lung function decline highlighting the crucial role for microbiota.To conclude, we identified two factors, oxidative stress and IL-10, implicated in IL-17 response linked to COPD. This work also underlines the role of microbioma as a whole organ and the modulation of this microbioma could result in new therapeutic ways identification in COPD.

Agamaglobulinemia ligada ao X (XLA) é uma imunodeficiência primária caracterizada por ausência ou número reduzido de células B maduras em sangue periférico, de todos os isotipos de imunoglobulina e um aumento da susceptibilidade a infecções bacterianas e enterovirais graves. XLA é causada por mutações no gene Bruton\'s tirosino quinase, que codifica um membro da proteína da família das tirosino quinases citoplasmáticas que tem papel vital na modulação de muitos processos celulares. Neste estudo foram analisados trinta e três pacientes quanto à presença de mutações de BTK, por SSCP/HA e seqüenciamento. A análise da expressão foi realizada pela técnica por PCR em tempo real. Foram encontradas mutações do tipo stop codons, substituições de aminoácido, defeitos de splicing, pequenas deleções/inserções e frameshift nestes pacientes afetando os domínios PH, SH3, SH2 e o domínio da quinase da proteína. A análise da expressão mostrou níveis baixos nos pacientes com mutação do tipo stop codon, e nas outras mutações, os níveis de expressão foram de aproximadamente 15% e se correlacionaram com os tipos de mutação. / X-linked Agammaglobulinemia (XLA) is a primary immunodeficiency characterized by the absence or decreased numbers of mature B cells in peripheral blood, and by a lack of all immunoglobulin isotypes, leading to an increased susceptibility to severe bacterial and enteroviral infections. XLA is caused by mutations in the gene encoding for Bruton\'s tyrosine kinase (BTK), a protein member of the Tec family of cytoplasmic tyrosine kinases and plays a vital modulation role in many cellular processes. In this study thirty-three patients were analyzed for the presence of BTK mutations by SSCP/HA and sequencing. The expression analysis was carried out by the technique of Real-Time PCR. It was found mutations of the stop codons type, amino acid substitutions, splice defects, small deletions/insertions and frameshift in these patients affecting the PH, SH3, SH2 and tyrosine kinase domains of protein. The expression levels were very low in the patients with stop codon mutations, and in the other mutations, the expression levels were about 15% and were correlated with the mutation types.

La génération de plasmocytes (PC) à longue durée de vie sécrétant des anticorps hautement affins spécifiques de l’antigène, caractéristique de la réponse immune adaptative, est l’étape ultime de la différenciation des lymphocytes B au sein des centres germinatifs des organes lymphoïdes secondaires. La transition d’un lymphocyte B naïf vers un PC est associée au passage d’un programme transciptionnel des gènes de l’identité B vers l’expression des gènes de l’indentité plasmocytaire. Ce travail de thèse s’est concentré sur la caractérisation de cette étape terminale de la différenciation lymphocytaire B humaine tant au niveau transcriptomique qu’épigénétique. A l’aide d’un modèle de différenciation in vitro à partir de lymphocytes B naïfs humains, nous avons identifié les cellules engagées dans ce processus. Ces précurseurs des plasmablates sont notamment caractérisés par une répression de la voie de signalisation de l’IL-4 aboutissant à la perte du marqueur CD23, le récepteur de faible affinité à l’IgE mais aussi à l’apposition de 5hmC, l’hydroxyméthylcytosine, au niveau des gènes de l’identité PC. L’étude de cette marque épigénétique dans un contexte pathologique, le myélome multiple, a fait l’objet du second axe de recherche de notre projet et a révélé le rôle du gène FAM72D dans la prolifération cellulaire. / The generation of long-lived plasma cells (PCs) secreting protective, antigen-specific, high-affinity antibodies as a part of adaptative immunity, is the ultimate step of the terminal differentiation of B cells within germinal centers of secondary lymphoid organs. The transition of a naïve B cell into a PC is associated with the switch from a B cell identity programm to PC identity programm. The focus of this thesis project was to characterise the transcriptomic and épigenetic profile of cells commited to this ultimate step of the B cell differentiation. Thanks to an in vitro model of human naïve B cell differentiation into PCs, we identify cells commited to this process. These plasmablasts founder cells are caracterised by a downregulation of the IL-4 pathway leading to the loss of CD23, the low-affinity receptor for IgE, but also to the hydroxymethylation (5hmC apposition) of PC identity genes. The study of 5hmC in multiple myeloma samples was the subject of the second research axis of our project and revealed the role of FAM72D gene as a marker of cell proliferation.