Comme tous les marsupiaux, l’opossum Monodelphis domestica nait dans un état très immature – glabre, aveugle, sourd – mais doit grimper sur le ventre de la mère pour trouver une tétine à laquelle il s’accroche afin de poursuivre son développement. Pour ce faire, il rampe à l’aide de ses membres antérieurs, qui sont mobiles contrairement aux membres postérieurs, et se dirige vers une tétine qu’il avale partiellement. Des sens céphaliques sont nécessaires pour qu’il trouve la tétine et s’y accroche. Le toucher est un des sens qui est fonctionnel dès la naissance. Ce sens repose sur des cellules spécialisées qui ont la propriété de percevoir des déformations mécaniques des tissus et d’y répondre en déclenchant l’activation de fibres nerveuses. Cette propriété s’appelle mécanotransduction et est rendue possible par la présence de récepteurs moléculaires à la surface des cellules dont la tâche est de réagir aux stimuli mécaniques afin de provoquer la réponse. Peu de ces récepteurs ont été formellement identifiés et caractérisés. Toutefois, Piezo2 est un canal transmembranaire retrouvé dans une vaste gamme de mécanorécepteurs et qui joue un rôle crucial dans la perception du toucher, en plus d’être impliqué dans la vestibulation (sens de l’équilibre) et l’audition. Le rôle de Piezo2 a surtout été étudié chez des mammifères euthériens matures. Peu d’études ont porté sur son expression développementale, et aucune ne concernait les marsupiaux. L’objectif principal de cette thèse était de décrire l’expression de Piezo2 au niveau de la tête d’opossums en développement. L’expression du gène a été examinée par RT-PCR et hybridation in situ, alors que la présence de la protéine a été démontrée par immunohistochimie. La RT-PCR montre une expression de l’ARNm de Piezo2 à tous les âges à partir de la naissance jusqu’au 21e jour postnatal (P21). L’immunohistochimie n’a pas permis de mettre en évidence Piezo2 dans la peau faciale ni chez les nouveau-nés ni chez l’adulte. Cependant, Piezo2 est présent dans l’oreille interne dès la naissance. Dans le vestibule, le marquage Piezo2 est observé sous la forme de disques à la surface de l’épithélium dans la macule utriculaire dès la naissance et dans la macule sacculaire et les crêtes ampullaires à P7. Ces disques ont une morphologie similaire à ceux formés par l’accumulation d’actine où se développent les cils des cellules ciliées, ce qui permet de penser que Piezo2 se trouve à la surface des cellules ciliées présomptives. Dans la cochlée, la protéine est aussi présente sur toute la surface apicale de l’organe de Corti présomptif. Avec l’âge, le patron de marquage se restreint à la surface des cellules ciliées externes, dont les trois rangées sont visibles à P11. À P14, les disques de marquage Piezo2 sont bien nets dans tous les organes sensoriels de l’oreille interne. Du marquage Piezo2 a aussi été observé dans la membrane tectoriale de la cochlée et les membranes otolithiques des macules vestibulaires, ce qui suggère qu’il joue un rôle dans le développement de ces structures acellulaires. Ces résultats suggèrent que Piezo2 n’est pas impliqué dans la mécanosensation tactile faciale à la naissance et pourrait jouer un rôle mineur dans le toucher chez l’opossum. L’expression de Piezo2 dans l’oreille interne indique qu’une forte maturation des cellules ciliées a lieu au cours de la 1re semaine postnatale dans la macule utriculaire et lors de la 2e semaine pour les autres organes sensoriels vestibulaires. Les cellules ciliées cochléaires auraient une maturation un peu plus tardive, au cours de la 2e semaine postnatale. La forte présence de Piezo2 dans l’épithélium cochléaire dès la naissance, alors que les cellules ciliées sont encore indifférenciées, suggère que cette molécule pourrait jouer un rôle dans la différenciation cellulaire. En résumé, cette étude montre que Piezo2 n’est pas impliqué dans la mécanosensation précoce chez l’opossum, mais qu’il joue un rôle dans le développement de la vestibulation et de l’audition. / Like most marsupials, the opossum Monodelphis domestica is born in a very immature state, ie. blind, glabrous and deaf. To pursue its development and growth, the newborn crawls with its forelimbs on its mother’s belly to find a teat where it attaches. Cephalic senses are needed to find the teat and trigger the attachment. Touch is one of the senses, which depends on mechanoreceptors, sensory cells capable of perceiving the mechanical changes in tissues and to transmit them as neural inputs, a process called mechanotransduction. Of the few molecular receptors underlying mechanotransduction identified so far, Piezo2 is the best candidate. It is a mechanosensitive cation channel found in a wide variety of mechanoreceptors and plays a crucial role in the perception of touch, as well as having been linked to the vestibular and auditory vestibular systems. While having been well characterized in mature eutherian mammals, few studies have looked at its role during ontogenesis and none were done in marsupials. The main objective of this thesis was to describe the developmental expression of Piezo2 in the head of the opossum. Gene expression was examined by RT-PCR and in situ hybridization, while the presence of the protein was demonstrated by immunohistochemistry. RT-PCR has shown that gene expression of Piezo2 is present from birth (postnatal day 0, P0) until P21. Immunohistochemistry did not reveal the presence of Piezo2 in cephalic skin tissues at any stage from birth to adulthood. However, Piezo2 is present in the inner ear from birth onwards. In the vestibular labyrinth, disk-shaped patches of Piezo2 labeling are present in the utricular macula at P0 and can be observed at P7 in the saccular macula and in the crista ampullaris. In all these sensory organs, Piezo2 labeling is similar to that of disk-shaped patches of actin accumulation where the stereocilia of hair cells develop. This suggests that Piezo2 is located at the surface of the hair cells in the inner ear. In the auditory system, the protein is present over the surface of the whole presumptive organ of Corti at P0. With age, Piezo2 labeling was restricted to the apical surface of the outer hair cells by P11. At P14, numerous discs are present in all the sensory organs of the inner ear and the only difference with P21 seems to be an increase in their number. Piezo2 labeling was also observed in the tectorial membrane of the cochlea and the otolithic membranes of the macula, suggesting that it plays a role in the development of these acellular structures. These results indicate that Piezo2 is not involved in skin facial mechanosensation at birth in the opossum and may be less important in the perception of touch in marsupials than in eutherians. The pattern of expression of Piezo2 in the vestibular system suggests that the maturation of the hair cells is important during the first postnatal week in the utricular macula and during the second postnatal week in the other vestibular sensory organs. The hair cells in the organ of Corti are maturating more during the late second postnatal week. Moreover, the strong expression of Piezo2 in the undifferentiated cochlear epithelium during the first postnatal weeks suggests that it may play a role in the differentiation of the cells of the organ of Corti of the opossum Monodelphis domestica. In summary, this study highlights that Piezo2 is not involved in early mechanosensation in opossums but plays a role in the development of both the vestibular and auditory systems.

Le phénotype des chondrocytes peut être modulé par des facteurs de croissance comme par des contraintes mécaniques. Nous avons caractérisé le potentiel chondrogénique de la "Bone Morphogenetic Protein" (BMP)-2 sur des chondrocytes murins primaires amplifiés en culture monocouche sur plastique. Nous avons aussi développé un nouveau modèle d’étude de la mécanotransduction par la compression dynamique de ces cellules incluses en hydrogel d’agarose. Nous avons ainsi confirmé l’implication des voies ERK1/2 et p38 dans ces mécanismes, révélé l’activation de Smad2/3 en réponse à la compression et identifié de nouveaux gènes mécano-sensibles. Par ailleurs, nous avons mis en évidence le rôle des intégrines-bêta-1 dans la rigidité du tissu cartilagineux. Nos résultats complètent la connaissance fondamentale des mécanismes de régulation du phénotype chondrocytaire, mais peuvent également contribuer à l'amélioration des techniques de reconstruction du cartilage dans le domaine de l'ingénierie tissulaire. / Chondrocytes phenotype can be modulated by growth factors as well as mechanical stress. We characterised Bone Morphogenetic Protein (BMP)-2 chondrogenic potential on mouse primary chondrocytes expanded in monolayer on culture plastic. Also, we developed a new model to investigate mechanotransduction by applying dynamic compression on these cells embedded in agarose hydrogel. Hence, we confirmed ERK1/2 and p38 pathways implication in such mechanisms, we revealed Smad2/3 activation in response to compression and we identified new mechanosensitive genes. Besides, we highlighted the role of beta-1-integrins in cartilage stiffness. Our results completed the basic knowledge of regulation mechanisms underlying chondrocytes phenotype, but could also contribute to improve techniques for cartilage reconstruction in the field of tissue engineering.

La mécanotransduction correspond à un processus dans lequel la force physique est convertie en signal chimique ou électrique. Ce processus est à la base de nombreuses fonctions physiologiques, y compris le sens du toucher, l’audition, la proprioception et la nociception. Nous ne connaissons pas à ce jour les mécanismes moléculaires à l’origine de la diversité fonctionnelle des mécanorécepteurs. L’objectif de thèse était de fournir 1 caractérisation des canaux mécanosensibles des neurones sensoriels afin d’identifier les mécanismes responsables des propriétés des mécanorécepteurs. 4 types de courants excitateurs ont été identifiés et classés sur la base de leurs cinétiques de relaxation: des courants à relaxation rapide, intermédiaire, lente ou ultra-lente. La relaxation résulte de l’adaptation et de l’inactivation. Nous montrons également que ces courants mécanosensibles possèdent des propriétés spécifiques permettant le codage des différents paramètres du stimulus mécanique. Tous s’activent graduellement en fonction de l’intensité du stimulus mécanique, mais seuls les courants à relaxation lente et ultralente informent sur la persistance du stimulus. A contrario, les courants à relaxation rapide et intermédiaire sont mis en jeu essentiellement par des stimulations rapides, ils traduisent donc la rapidité d’installation du stimulus. Nous avons ensuite identifié un nouveau courant mécanosensible potassique (IKmech) exerçant un effet inhibiteur sur la décharge des mécanorécepteurs. Le profil pharmacologique et les travaux menés sur des souris KO et transgéniques montrent que le courant IKmech est porté par la sous-unité Kv1.1 qui est mécano-susceptible via un mécanisme par lequel la pression altère la sensibilité au potentiel des canaux. En s’opposant aux courants excitateurs, le courant IKmech régule le seuil de décharge des mécano-nocicepteurs et la fréquence de décharge des mécanorécepteurs non nociceptifs. / The somatosensory system mediates fundamental physiological functions, including the senses of touch, pain and proprioception. The aim of my thesis was to understand molecular mechanism of mechanotransduction in mammalian sensory neurons.We identified 4 types of mechanotransducer currents that distribute differentially in cutaneous nociceptors and mechanoreceptors and that differ in desensitization rates. Desensitization of mechanotransducer channels in mechanoreceptors was fast and mediated by channel inactivation and adaptation, which reduces the mechanical force sensed by the transduction channel. Both processes were promoted by negative voltage. These properties of mechanotransducer channels suited them to encode the dynamic parameters of the stimulus. In contrast, inactivation and adaptation of mechanotransducer channels in nociceptors had slow time courses and were suited to encode duration of the stimulus. Thus, desensitization properties of mechanotransducer currents relate to their functions as sensors of phasic and tonic stimuli and enable sensory neurons to achieve efficient stimulus representation.In the second work, we explored the molecular determinants of threshold differences and temporal adaptation among mammalian mechanoreceptors. We identified a novel mechanosensitive K+ current (IKmech) in different classes of mechanosensory neurons from mouse and rat DRGs. IKmech activates slowly in response to mechanical stimulation and is carried by Kv1.1 subunit-containing K+ channels. By antagonizing depolarizing drive induced by excitatory MS currents, IKMech regulates threshold for noxious mechano-perception and temporal adaptation in non-painful mechanosensation. Our work has identified Kv1.1 as an essential molecular element in defining the threshold range of mechanical sensitivity and temporal responses of fibers associated with mechanical perception.

Les événements biochimiques de l'activation T ont été décrits depuis longtemps et sont bien connus. A l'échelle moléculaire la liaison du Récepteur des Cellules T (TCR) présent à la surface du lymphocyte T avec un peptide (du soi ou non soi), ce dernier étant chargé sur le Complexe Majeur d'Histocompatibilité (MHC), présent à la surface des Cellules Présentatrices d'Antigène (CPA) conduit à l'initiation de la réponse immunitaire. La réponse des lymphocytes T est extrêmement spécifique, sensible, robuste et semble présenter des caractéristiques de mécano-transduction. En effet, il a été démontré récemment que le TCR agirait comme un mécanosenseur alors que le lymphocyte T peut sentir la mécanique de son environnement à une échelle cellulaire. Cependant, la majorité de ces études ont été réalisées en opposant un lymphocyte T à un substrat inerte limitant la compréhension sur la contribution éventuelle de chaque partenaire cellulaire car la présence de l'APC peut induire des changements dans l'organisation du lymphocyte T.Le but de cette thèse a été de mettre en place un suivi de l’activation des lymphocytes T pat une APC modèle, sous force grâce à l’utilisation de la microscopie à force atomique. Il a mené à plusieurs développements méthodologiques originaux validés de manière expérimentale avec un système cellulaire modèle (hybridomes murins vs. Cellules COS modifiées pour être des APC pouvant être modifiées à souhait grâce à l’expression d’une grande variété de molécules impliquées dans la réponse immunitaire). / The biochemical events of T activation have been described for a long time and are well known. At the molecular level, the binding of the T-cell receptor (TCR) present on the surface of the T-cell with a peptide (self or non-self) loaded on the Major Histocompatibility Complex (MHC), present on the surface of the Antigen Presenting Cells (APC), leads to the initiation of the immune response. In addition, the T cell response is extremely specific, sensitive, robust and appears to have mechano-transduction characteristics. Indeed, it has recently been demonstrated that the TCR would act as a mechanosensor while the T lymphocyte can feel the mechanics of its environment on a cellular scale. However, the majority of these studies were performed by opposing/facing a T cell to an inert substrate (e.g., bead, functionnlized glass slides molecularly decorated or not), limiting the understanding of the possible contribution of each cell partner because the presence of APC can induce changes in the organization of the T cell. The aim of this thesis was to set up a follow-up of the activation, under force, between a model APC and a T lymphocyte. It has led to several original methodological developments experimentally validated with a model cell system (mouse hybridomas vs. COS cells modified to be complexifiable APCs).

Les cellules vivantes sont capables de réagir aux signaux mécaniques tels que la rigidité de la surface sur laquelle elles adhèrent, les forces de tractions ou compressions auxquelles elles sont soumises, le flux de liquide à la surface de leur membrane ou encore la géométrie de leurs adhésions ou de leur forme globale. Ces signaux influent sur des processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la migration et la mort cellulaire. Ces processus sont finement régulés par des réactions biochimiques qui forment un réseau de signalisation. La mécanotransduction est la traduction du signal mécanique en signal biochimique.C’est dans le but d’étudier la mécanotransduction que nous avons étudié l’utilisation d’ultrasons pour stimuler mécaniquement les cellules à des fréquences temporelles et spatiales relativement élevées. De nombreux montages expérimentaux et de nombreuses voies ont été considérées dans cette partie très exploratoire. Nous en retenons finalement des pistes prometteuses pour la continuation future de ce projet.Nous avons développé ce que nous nommons des substrats actifs, qui nous permettent de contrôler à la fois spatialement et temporellement la stimulation mécanique appliquée à des cellules vivantes. Ces substrats actifs consistent en des micropiliers de fer incrustés dans un élastomère peu rigide (PDMS) et manipulés par deux électroaimants. Nous pouvons contrôler dynamiquement le déplacement des piliers qui vont déformer localement et de manière continue la surface. Cette déformation va ensuite déformer en traction ou en compression les cellules vivantes étalées sur la surface à proximité. En employant des marqueurs fluorescents nous pouvons réaliser de la Microscopie de Forces de Traction et surveiller la contrainte appliquée par les piliers aux cellules à travers la surface de PDMS, et nous pouvons étudier la réponse mécanique des cellules. De plus, ces substrats sont compatibles avec la microscopie de fluorescence en cellule vivante, ce qui rend possible l’observation de la réponse cellulaire au niveau morphologique (forme des adhésions focales, activité protrusive, …) et surtout biochimique.En effet, pour étudier la réponse biochimique des cellules après une stimulation mécanique, nous observons par microscopie de fluorescence des biosenseurs portant des paires de fluorophores donneur/accepteur. Ces biosenseurs nous permettent d’observer l’activité de protéines impliquées dans la signalisation cellulaire en calculant l’efficacité de Transfert d’Énergie Résonnant de Förster (FRET) de ces biosenseurs. Pour ce faire, les échantillons sont illuminés alternativement aux longueurs d’ondes d’excitation des fluorophores donneurs puis accepteurs. Le signal de fluorescence est collecté simultanément dans un canal d’émission du donneur et un canal d’émission de l’accepteur. Une grande partie de ma thèse a été consacrée à la mise au point d’une méthode quantitative pour analyser les images de fluorescence afin de mesurer une efficacité de FRET qui ne dépende pas de facteurs expérimentaux ni de la quantité de biosenseurs présents dans les cellules. Nous évaluons alors les différentes méthodes pour déterminer les facteurs de correction répandus corrigeant le débordement de spectre du donneur dans le canal accepteur et l’excitation directe de l’accepteur à la longueur d’onde d’excitation du donneur. Pour obtenir des mesures plus quantitatives, nous avons mis au point une nouvelles méthode pour déterminer 2 facteurs de correction supplémentaires. Nous comparons cette méthode à la seule préexistante et évaluons l’influence des paramètres de traitement des images sur les valeurs d’efficacité de FRET mesurées. / Living cells can react to mechanical signals such as the rigidity of the surface they adhere on, the traction or compression forces applied on them, the liquid flow at their membrane surface or the geometry of their adhesions or of their overall shape. Those signals influence cellular processes such as proliferation, differentiation, migration or cell death. Those processes are tightly regulated by biochemical reactions that constitute a signaling network. Mechanotransduction is the translation of the mechanical signal into the biochemical one.In order to study mechanotransduction, we have considered the use of ultrasounds to mechanically stimulate cells at relatively high temporal and spatial frequencies. Numerous setups and options have been considered in this very exploratory project. Finally, we will retain some promising leads for the continuation of this project.We have developed what we call active substrates that allows us to control both spatially and temporally the mechanical stimulation on living cells. Those active substrates consist of iron micropillars embedded in a soft elastomer and actuated by 2 electromagnets. We can control dynamically the displacement of the pillar that will deform locally and continuously the surface. This deformation will then deform in traction or in compression the living cells spread on the surface nearby. Thanks to fluorescent trackers we can perform Traction Force Microscopy and monitor the stress applied by the pillars to the cells through the PDMS surface, and we can look at the mechanical response of the cells. Moreover, those substrates are compatible with live cell fluorescence microscopy, which makes possible the observation of the cellular response at the morphological level (focal adhesions, protrusive activity, …) and most importantly at the biochemical level.Indeed, in order to study the cellular biochemical response after a mechanical stimulation, we use fluorescence microscopy to observe biosensors containing pairs of donor/acceptor fluorophores. Those biosensors allow us to monitor the activity of proteins implied in cellular signaling by computing the Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiency of those biosensors. To do so, samples are alternatively excited at donor and acceptor excitation wavelengths. The fluorescence signal is then simultaneously measured in donor and acceptor emission channels. A substantial part of my thesis has been dedicated to the development of a quantitative method to analyze fluorescence images in order to measure FRET efficiencies that do not depend on experimental factors or biosensors concentration in cells. We assess different methods to compute standard correction factors that account for spectral bleed-through and direct excitation of acceptors at donor excitation wavelength. To obtain more quantitative measurements, we have developed a new method to compute 2 additional correction factors. We compare this method with the only one preexisting, and we assess the influence of image processing parameters on FRET efficiency values.

L'adhésion et la migration des cellules jouent un rôle important dans de nombreux mécanismes cellulaires qui vont de la morphogenèse à la prolifération tumorale en passant par la réparation des tissus. Il est maintenant bien établi que l'environnement physique et mécanique des cellules a une grande influence sur de nombreuses fonctions cellulaires comme l'adhésion et la migration ainsi que sur leur devenir et donc leur différentiation. Pour contrôler les propriétés de l'environnement cellulaire, nous avons choisi de combiner des méthodes de micro-fabrication issues de la microélectronique aux techniques de biologie cellulaire et moléculaire. Nous nous sommes notamment intéressés à l'influence de la rigidité du support sur la migration cellulaire et les forces mécaniques exercées par les cellules, des fibroblastes, sur la matrice. Pour cela, nous avons utilisé un substrat constitué de micro-piliers flexibles, qui ont servi de micro-capteurs de force. Nous avons montré que les cellules employées adaptent les forces qu'elles exercent sur leur support à la rigidité de ce dernier. Nous avons ensuite étudié l'influence de la topographie du substrat sur la migration cellulaire. Nous avons pour cela également utilisé des micro-piliers, mais dont le diamètre est 5 à 10 fois supérieur aux précédents. Les cellules, en migrant, rencontrent donc alternativement des surfaces lisses et rugueuses. Nous avons montré que dans ces environnements, les cellules adoptent un comportement s'approchant de celui observé dans un gel tridimensionnel et que le noyau joue un rôle dans cette migration. Enfin, nous avons abordé l'étude de l'étalement cellulaire dans ces environnements texturés.

Les colloïdes utilisés sont des suspensions de nanoparticules magnétiques (nanocristaux d'oxyde de fer de 10 nm) chargées négativement en surface, qui s'adsorbent de façon aspécifique sur la membrane de la plupart des types cellulaires, où elles sont spontanément internalisées dans des vésicules intracellulaires. Les nouvelles propriétés magnétiques de cellules thérapeutiques ainsi marquées et implantées au sein de l'organisme permettent leur suivi in vivo de manière non-invasive par IRM. Nous avons ainsi pu suivre des cellules musculaires lisses dans un modèle d'anévrisme et des explants musculaires dans un modèle d'incontinence urinaire. Dans chaque cas, l'évolution des propriétés de contraste des cellules marquées au cours du temps a été étudiée in vitro et in vivo. Ce marquage magnétique nous a aussi permis de soumettre les cellules à des forces magnétiques et analyser leur influence sur la migration cellulaire in vitro et la faisabilité d'un guidage magnétique in vivo.

L’angiogenèses par bourgeonnement est associée à une réorganisation majeure de la matrice extracellulaire (MEC). Nous avons déjà démontré que la lysyl oxydase-like 2 (LOXL2), une enzyme responsable du crosslinking de la MEC, régule la formation de vaisseaux intersomitiques dans les embryons de poisson zèbre et de capillaires en hydrogels 3D. Dans ce manuscrit, nous avons examiné les mécanismes impliqués dans cette régulation. Nous avons constaté l’association intracellulaire de LOXL2 avec la fibronectine et le collagène IV, avant d’être incorporée dans des structures fibrillaires dès l’exocytose. De plus, l’inhibition de l’expression de LOXL2 entraine des défauts de déposition de la MEC et diminue sa rigidité, inhibant secondairement la maturation des structures d'adhésion cellulaire. Alors que LOXL2 n‘est pas nécessaire pour la formation de capillaires dans un modèle 2D sur MEC de fibroblastes, les défauts de déposition de MEC sont corrélés à l'inhibition de formation des capillaires en hydrogel 3D. Ni l’addition de LOXL2 exogène, ni l’augmentation de la rigidité des hydrogels ne compense la perte d’expression de LOXL2. Enfin, nous avons pu montrer que ni l'activité catalytique ni le domaine catalytique de LOXL2 ne sont essentiels pour la formation de capillaire dans le poisson zèbre et dans les hydrogels et pour l’assemblage du collagène IV par des cellules endothéliales. L’ensemble de ces données suggère donc que les domaines SRCR de LOXL2 exprimés par des cellules endothéliales régulent l’échafaudage de fibronectine et de collagène IV dans la MEC qui est nécessaire à la formation de capillaires. / Sprouting angiogenesis is associated with major extracellular matrix (ECM) remodelling, consisting in both degradation of the microenvironment and generation of a new basement membrane. We have previously reported that lysyl oxidase-like 2 (LOXL2), an enzyme responsible for ECM crosslinking, regulates formation of intersomitic vessels (ISV) of zebrafish embryos and of capillaries in 3D hydrogels. In this manuscript we investigated the mechanisms involved. We found that LOXL2 associates with fibronectin and collagen IV intracellulary before direct incorporation in fibrillar structures of the ECM upon exocytosis. In addition, silencing LOXL2 demonstrated its involvement in ECM deposition as both composition and stiffness of the ECM were affected, which subsequently altered maturation of cell adhesion structures. Whereas LOXL2 is not required for formation of capillaries on top of a fibroblast monolayer, in a 2D assay, ECM defaults were associated with altered formation of capillaries in 3D hydrogels.Neither addition of exogenous LOXL2, nor increasing the stiffness of hydrogels could restore capillary formation. Moreover, we could show that neither the catalytic activity nor the catalytic domain were required for capillary formation in vivo and in 3D hydrogels, and for collagen IV deposition by endothelial cells. Altogether, these data suggest that the SRCR domains of LOXL2 expressed by endothelial cells regulate 3D capillary morphogenesis through scaffolding of fibronectin and collagen IV in the ECM.

La scoliose idiopathique de l'adolescent (SIA) est une courbure rachidienne tridimensionnelle de plus de 10° qui affecte 4% de la population pédiatrique. L’hétérogénéité de ce désordre musculo-squelettique complexe explique notre incompréhension des causes de la SIA. Néanmoins, plusieurs facteurs biologiques ont été associées à son étiologie. Les réponses osseuses aux stimulations mécaniques normalement appliquées sont nécessaire au fonctionnement optimal du système squelettique. Cependant, la mécanotransduction des tissus musculo-squelettiques dans la SIA est méconnu. L'objectif principal de cette thèse était d'étudier l'apport de la mécanotransduction dans l'étiologie de la SIA au niveau cellulaire et moléculaire. Nous avons étudié les ostéoblastes des patients atteints de SIA et des sujets témoins. L'induction mécanique a été réalisée à l'aide d'une application d'écoulement de fluide oscillatoire. L’immunofluorescence (IF) et la microscopie confocale ont été utilisées pour évaluer les cils, l'actine et les tests fonctionnels. Les modifications moléculaires ont été étudiés par qPCR ou ELISA. Un séquençage d'exome entier sur une cohorte de 73 SIA et 70 sujets témoins appariés a été fait, pour vérifier l'hypothèse que l'accumulation de variants rares dans des gènes impliqués dans la mécanotranduction cellulaire contribueraient à l'étiologie de la SIA. Nous avons découvert une élongation anormale des cils des ostéoblastes SIA, qui étaient significativement plus longs que ceux des sujets témoins dans des conditions de ciliogenèse. Les cellules SIA soumises à une application d'écoulement de fluide, n'ont pas été capable d'ajuster la longueur de leurs cils proportionnellement à la force appliquée. La réponse de l'ajustement de la longueur des cils était significativement différente de celle des ostéoblastes témoins, par des stimulations à court et à long terme.. L'expression des facteurs ostéogéniques était significativement réduite dans les ostéoblastes SIA, suggérant une diminution de la mécanosensibilité. De plus, l'analyse transcriptomique en réponse aux forces appliquées a révélé une altération de l'expression des gènes impliqués dans la voie canonique de Wnt. L'augmentation de la sécrétion du facteur VEGF-A en réponse aux forces appliquées dans les ostéoblastes témoins n'a pas été détectée dans les ostéoblastes SIA. Notre analyse SKAT-O des données du séquençage d’exomes entiers a confirmé l’accumulation de variants rares dans la SIA au niveau de gènes associés à la mécanotransduction cellulaire. Les conséquences de ces anomalies de mécanotransduction ont été étudié par des études cellulaires fonctionnelles, démontrant que les ostéoblastes SIA n’ont pas réussi à se positionner ni à s’allonger proportionnellement au flux bidirectionnel appliqué. Le réarrangement des filaments d'actine induit par l’application d’un flux a été compromis dans la SIA. . Enfin, il a été démontré que le flux de fluide avait un effet inhibiteur sur leur migration. Nos données suggèrent une mécanotransduction altérée dans les ostéoblastes SIA affectant les cils, les voies moléculaires de signalisation, le cytosquelette et le comportement de la cellule en réponse à l'écoulement appliqué. La réponse cellulaire à ces stimulations joue un rôle dans la structure, la force, la forme et le fonctionnement du système squelettique. Etudier le profil de réponse altérée des cellules osseuses scoliotiques peut mener à la conception des approches thérapeutiques plus efficaces / Adolescent idiopathic scoliosis (AIS) is a three-dimensional spinal curvature that affects up to 4% of children. As a complex disorder, the cause of AIS is still poorly understood. However, multiple categories of biological factors have been found to be associated with its etiology. The role of biomechanics has been acknowledged by clinicians both in the description of deformity and in relation to bracing treatments. Bone responses to routinely applied forces are an important part in a tightly regulated network that is necessary for the optimal function of the skeletal system. However, little is known about the mechanotransduction of musculoskeletal tissues in AIS. The main goal of this dissertation was to investigate the contribution of mechanotransduction in the etiology of AIS from a cellular-molecular aspect. We studied primary osteoblasts obtained intraoperatively from AIS patients and compared them to samples from trauma cases as controls. Fluid flow application was used for mechanical induction. Immunofluorescence staining, and confocal microscopy was used to assess cilia, actin and cellular tests. Molecular changes were followed using RT-PCR or ELISA. We also performed whole exome sequencing (WES) to test the hypothesis that rare variants accumulation in genes involved in cellular mechanotransduction could contribute to AIS etiology. We found an abnormal cilia elongation among AIS osteoblasts, which grew significantly longer than controls. AIS cells after fluid flow application failed to adjust their cilia length in proportion to the applied force. Under both short- and long-term flow applications, their cilia length adjustment was significantly different from controls. Notably, the elevation in the expression of osteogenic factors, that was normally observed with control osteoblasts, was significantly reduced in AIS osteoblasts, suggesting a decrease in their mechanosensitivity. Moreover, transcriptomic analysis following the applied forces revealed an altered expression of genes involved in the Wnt canonical pathway. Strain induced increase in secreted VEGF-A in control osteoblasts was not detected in AIS flow-conditioned media. At the genomic level, our SKAT-O analysis of the WES data also supported the involvement of heterogenous defects in genes pertaining to the cellular mechanotransduction machinery. We tested the consequence of these mechanotransduction abnormalities in a series of functional cellular studies. As expected and unlike controls, AIS osteoblasts failed to position or elongate themselves in proportion to the bidirectional applied flow. The strain-induced rearrangement of actin filaments was compromised in AIS osteoblasts. Finally, fluid flow showed to have an inhibitory effect on their migration contrasting with control cells that migrated significantly faster under flow. In summary, our data strongly suggest an impaired mechanotransduction in AIS osteoblasts that affect cilia, downstream signaling molecular pathways, cytoskeleton and finally the behaviour of the whole cell in response to flow. Fluid flow is one of the main mechanical forces applied physiologically to the bone cells. Cellular responses to these stimulations play a critical role in the structure, strength, shape and optimal performance of the skeletal system. Mapping the impaired profile response of scoliotic bone cells can help in designing more efficient therapeutic approaches or explaining the mechanisms behind less than optimal bracing outcomes.

La capacité des leucocytes à se déplacer dans tout l’organisme est indispensable pour une réponse immunitaire rapide et efficace. Leur migration, dite amiboïde, est caractérisée par une vitesse importante (10-20 μm/min) et une grande adaptabilité face aux divers environnements qu’ils rencontrent, qu’ils soient bidimensionnels comme la paroi luminale endothéliale ou tridimensionnels (3D) comme les tissus. Telle qu'actuellement décrite, la migration amiboïde requiert de l’adhésion ou de la friction avec un support solide. Nous avons ici montré que les lymphocytes T effecteurs sont capables de nager sans interaction avec un support solide. Le mécanisme de propulsion est basé sur le flux rétrograde d’actine qui entraine une brosse protéique de molécules transmembranaires liées au cytosquelette entrant en interaction avec le medium. Par ailleurs, lors de leur migration sur la surface luminale des parois endothéliales, les leucocytes sont soumis à un flux important et s’orientent par rapport au flux via des mécanismes mal déterminés. Nous avons montré que l’orientation des lymphocytes et des neutrophiles respectivement dans le sens ou à contresens d’un flux peut s’expliquer sans détection moléculaire du stress hydrodynamique. Le lamellipode pour les neutrophiles et l’uropode pour les lymphocytes est non-adhérent et s’oriente dans le flux comme une girouette dans le vent. La polarisation avant-arrière réaligne l’ensemble de la cellule dans le même sens que l’extrémité orientée par le flux. Le mécanotactisme des leucocytes sous flux repose ainsi sur des mécanismes passifs, c’est-à-dire sans mécanotransduction. / A fast and efficient immunity response needs leukocytes’ability to migrate within the entire organism. Their migration, called amoeboid, is characterized by a high speed (10-20 μm.min-1) and a great adaptability to move through various environment, either two-dimensional as luminal endothelial surface or tri-dimensional (3D) environment as tissue. Since the observation of leukocytes migrating without adhesion through solid 3D medium, amoeboid migration is described as requiring either adhesion or friction with solid support to permit motility. We showed here that effector T lymphocytes are able to swim without any interaction with solid substrate. Propulsion is based on actin retrograde flow coupled with transmembrane proteins linked to cytoskeleton (like integrins) which drag a brush of polymeric molecules in interaction with the medium. Furthermore, cell guidance is required for many crucial functions as organism growth or immune system. However, when crawling on luminal endothelial surfaces, cells are exposed to blood flow and they robustly orient either with or against the flow with unknown mechanisms. We showed that lymphocytes and neutrophils flow orientation can be explain without any molecular flow sensor of shear stress. Lamellipodium for neutrophils and uropod for lymphocytes is non-adherent and orients in the direction of flow like a wind vane. Front-rear cell polarization aligns the axis of the whole cell with the non-adherent pole oriented by flow. Flow mechanotaxis of leukocytes relies on passive mechanisms without mechanotransduction.