L'analyse chromosomique sur puce ADN (ACPA) tend à devenir le principal examen diagnostique dans la déficience intellectuelle (DI). Parmi les techniques d'ACPA, les puces SNP ont l'intérêt de pouvoir détecter les pertes d'hétérozygotie, et par conséquent d'identifier les isodisomies uniparentales (iUPD) et les zones d'identité liées à la consanguinité. Nous avons étudié une cohorte de 1 187 patients atteints de DI, dans un cadre diagnostique, sur puces SNP. Nous avons réalisé, par cette étude, 145 diagnostics (12%) dont 2 iUPD et 6 délétions n'incluant qu'un seul gène. De plus, nous avons détecté 639 CNV rares non décrits chez des sujets contrôles et incluant des séquences codantes, ce qui nous a permis d'identifier 11 gènes candidats dans la DI : CAMTA1, SP3, CNTNAP4, NUDT12, STXBP6, DOCK8, DOCK10, SMARCA2, NYAP2, ATAD3A et ATAD3B. Nous avons tenté de valider l'implication de ces gènes par séquençage, mais n'avons trouvé de seconde mutation pour aucun d'entre eux. Toutefois, des réarrangements de CAMTA1 ont été retrouvés dans 2 autres familles avec un phénotype homogène (DI et ataxie congénitale) ce qui nous a permis d'affirmer qu'il s'agit d'un gène de DI. Par ailleurs, l'homozygosity mapping, réalisé avec puces SNP, a identifié, par séquençage whole exome, une mutation non-sens homozygote du gène BUD13 dans une famille de DI syndromique. Enfin, de façon fortuite, nous avons caractérisé en ACPA une translocation familiale entraînant une disruption d'un gène d'ataxie spino-cérébelleuse, ATXN10, ce qui a permis de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie. Au total, notre étude démontre l'intérêt des puces SNP dans la DI, d'une part en diagnostic et d'autre part pour l'identification de nouveaux gènes responsables de DI.

Les douleurs neuropathiques, celles qui sont provoquées par des lésions du système nerveux central ou périphérique, sont les plus difficiles à traiter du fait de leur résistance aux traitements antalgiques classiques. Les traitements utilisés aujourd'hui font appel à des classes thérapeutiques non spécifiquement ciblées sur la douleur, en particulier des antidépresseurs et des anticonvulsivants. Leur efficacité limitée ne repose en fait que sur des observations empiriques. Une meilleure connaissance des processus physiopathologiques sous-tendant les douleurs neuropathiques constitue un préalable à toute innovation thérapeutique, et c'est à cette fin que je me suis appliqué à développer deux modèles de douleurs neuropathiques chez le rat pour en étudier les caractéristiques comportementales, fonctionnelles, cellulaires et biochimiques. Le premier modèle visait à l'induction d'une douleur neuropathique centrale provoquée par la section complète de la moelle épinière au niveau thoracique (T8-T9) ; le second a consisté à injecter, directement au niveau spinal, par voie intrathécale (i.t.), le facteur neurotrophique BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor ; dont l'implication dans les voies de signalisation nociceptive est bien établie dans la littérature). Dans les deux cas, les conséquences pro-algiques de ces interventions ont été comparées à celles induites par la ligature unilatérale du nerf sciatique, qui constitue encore aujourd'hui un modèle classique, mais très imparfait, d'une douleur neuropathique périphérique. Dès le 2ème jour après la section spinale, et jusqu'au moins deux mois plus tard, les rats lésés présentent une forte allodynie mécanique (test des filaments de von Frey) dans le territoire cutané juste en avant de la lésion. Cet effet traduit bien une neuropathie centrale car il n'existe pas chez les rats " sham " qui ont subi l'intégralité de l'intervention chirurgicale à l'exception de la section spinale. L'allodynie mécanique est associée à une induction significative de l'expression (RTqPCR) de marqueurs de souffrance neuronale (ATF-3) et d'activation microgliale (OX-42, récepteurs P2X4, P2X7 et TLR4) et astrocytaire (GFAP), ainsi que du BDNF et de cytokines pro-inflammatoires (IL-1ß, IL-6, TNF-α), mais de façon plus transitoire, ceci dans les ganglions de racines dorsales et/ou la moelle épinière dorsale (comme à la suite de la ligature du nerf sciatique, mais avec des cinétiques différentes). Pour sa part, l'injection intrathécale i.t. d'une dose infra-nanomolaire unique de BDNF (0.3 - 3.0 ng) induit aussi une forte allodynie et une hyperalgésie mécaniques, au niveau des pattes postérieures, qui se développent en 3-5 jours, et perdurent pendant deux semaines. Cependant, au contraire de la section spinale (et de la ligature du nerf sciatique), l'injection i.t. de BDNF ne provoque pas d'activation microgliale ni d'induction de cytokines. Elle entraine en revanche une auto-induction du BDNF, qui semble clé pour l'hyperalgésie puisque celle-ci peut être, en grande partie, supprimée par l'administration d'un inhibiteur du récepteur TrkB du BDNF, la cyclotraxine B (20 mg/kg i.p.), comme d'ailleurs l'hyperalgésie induite par la ligature du nerf sciatique. Au plan pharmacologique, un antalgique opiacé comme le tapentadol s'est révélé efficace dans les deux modèles. De même, les anticonvulsivants, comme la prégabaline et la gabapentine, ont réduit la douleur neuropathique chez les rats injectés par le BDNF i.t. et chez les rats CCI-SN. En conclusion, il semble que l'injection intrathécale de BDNF, qui évite la réalisation de lésions par intervention chirurgicale, puisse constituer un nouveau modèle pertinent de douleur neuropathique chez le rat. De plus, nos résultats laissent à penser que le blocage de la voie de signalisation BDNF-TrkB pourrait ouvrir de nouvelles pistes pour la réduction des douleurs neuropathiques périphériques. (...)

Le microenvironnement, composé de différents éléments cellulaires et de la matrice extracellulaire, joue un rôle primordial dans le développement tumoral et la dissémination métastatique. Ainsi, l'étude de ces interactions cellulaires est importante pour que des thérapies ciblées luttent contre la chimiorésistance des cellules tumorales. Ce travail de thèse a pour but d'étudier le rôle du facteur de croissance IGF-I dans la chimiorésistance des cellules du cancer de l'ovaire et des leucémies myéloïdes présente au sein du microenvironnement.Dans un premier temps, nous avons mis en évidence que la chimiorésistance des cellules du cancer de l'ovaire, acquise grâce aux cellules hôtes (hospicells), est liée à la sécrétion de IGF-I par ces cellules. Nous avons également montré que IGF-I est impliqué dans la régulation de certains gènes ABC (MDR-1, MRP1, MRP2, et BCRP) via les voies de STAT3, Jak2, PI3K et ERK.Dans les leucémies myéloïdes, nous avons montré que IGF-I a un effet sur la prolifération des cellules tumorales. Il induit l'expression de la protéine P-gp ainsi que la chimiorésistance des cellules sensibles à la chimiothérapie. Nous avons également déterminé le rôle de IGF-I dans la résistance des cellules leucémiques en présence des hospicells. Ces dernières ont une activité hyperangiogénique in vivo, lié à l'HIF-1 et au VEGF, et inhibent les réponses immunes des lymphocytes T par production de NO.Nous avons déterminé le rôle crucial de MMP-9 dans la migration des cellules résistantes du cancer du sein exprimant la protéine P-gp et dans la formation d'un réseau tubulaire, suggérant un lien existant entre l'expression de P-gp et de MMP-9.

Les rhabdomyolyses correspondent à la destruction de fibres musculaires striées squelettiques et mettent en jeu le pronostic vital. La principale cause génétique est liée à un défaut d'oxydation des acides gras ; néanmoins, plus de la moitié des cas n'ont pas de cause identifiée. En 2008, des mutations du gène LPIN1 ont été rapportées comme une nouvelle étiologie de rhabdomyolyse de transmission autosomique récessive. La protéine lipin1 a une double fonction : un rôle de PAP1 intervenant dans la synthèse du triacylglycérol et des phospholipides membranaires ; un rôle de co-activateur transcriptionnel en association avec les PPARs et PGC1α pour réguler de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme, dont certains de l'OAG. Lipin1 a deux homologues, lipin2 et lipin3, qui possèdent une activité PAP1 et un site de fixation à des récepteurs nucléaires tels que les PPARs. Nous avons montré que les mutations de LPIN1 rendent compte de plus de 50% des cas de rhabdomyolyse sévère de la petite enfance, une fois écarté le diagnostic de déficit de l'OAG. Une délétion intragénique en phase a été fréquemment identifiée chez les Caucasiens. Nous avons montré qu'il s'agissait d'un probable effet fondateur et que cette délétion est délétère. En effet, à l'inverse de la forme normale de lipin1, la forme délétée est incapable de complémenter la levure pah1, déficiente pour l'homologue de LPIN1. Nous avons ensuite étudié, dans une série de 171 patients, l'implication de LPIN1 dans des pathologies musculaires moins sévères, ainsi que le rôle des deux homologues LPIN2 et LPIN3. Les mutations de LPIN1 sont impliquées dans les rhabdomyolyses sévères et précoces uniquement et les accès de rhabdomyolyse ont toujours un facteur déclenchant, le principal étant les infections aiguës fébriles. Aucune altération majeure de LPIN2 et de LPIN3 n'a été identifiée, même dans des phénotypes modérés. Enfin, nous avons cultivé des myoblastes et des myotubes de patients avec mutations de LPIN1 afin d'étudier les mécanismes de rhabdomyolyse. Les myoblastes déficients en lipin1 ont une activité PAP1 très diminuée et une accumulation de gouttelettes lipidiques. Le niveau d'expression des gènes cibles des facteurs de transcription co-activés par lipin1 (PPARδ, PPARα, PGC1α, ACADVL, CPT1B and CPT2) sont inchangés par rapport aux contrôles, alors que le niveau de lipin2 est augmenté. L'analyse transcriptomique sur cultures de myotubes a identifié chez les patients 19 gènes sous-exprimés et 51 sur-exprimés, notamment ACACB, qui code pour Accβ, enzyme clé de la balance synthèse d'acides gras/OAG. L'invalidation d'ACACB par siRNA dans des myoblastes déficients en lipin1 diminue le nombre de gouttelettes lipidiques, confirmant le lien entre la sur-expression d'ACACB et l'accumulation d'acides gras libres chez les patients. Cependant, le taux de malonyl-CoA, produit d'Accβ, et l'activité CPT1 (étape limitatrice de l'OAG, inhibée par le malonyl-CoA), sont comparables entre myoblastes de patients et de contrôles. Néanmoins, le traitement des cultures par l'association de tumor necrosis factor alpha et d'interleukine-1 β, choisis pour simuler les conditions pro-inflammatoires des infections aiguës, entraîne une augmentation encore plus poussée du taux de malonyl-CoA, une diminution de l'activité CPT1 et une augmentation de l'accumulation de gouttelettes lipidiques chez les patients. Au total, nos données placent LPIN1 comme une cause importante de rhabdomyolyse héréditaire. Le déficit en lipin1 entraine une perturbation du métabolisme lipidique, via une sur-expression d'ACACB, qui est exacerbée en conditions pro-inflammatoires. Nos résultats suggèrent que les conséquences du déficit en lipin1 sont compensées par des mécanismes d'adaptation suffisants en condition normale, mais insuffisants pour la demande métabolique induite par des stress environnementaux comme l'infection, conduisant aux rhabdomyolyses.

L'objectif de cette thèse a été d'explorer l'association entre des variants génétiques impliqués dans la variabilité interindividuelle de la réponse au traitement par les opioïdes et la survenue d'effets secondaires. Nous avons recherché si des facteurs génétiques influençaient la réponse à la morphine dans le traitement de la douleur aigüe. L'allèle T du polymorphisme c.3435C>T d'ABCB1 est significativement associé aux doses de morphine et à la survenue de nausées dans une étude pilote chez des patients libanais en post-opératoire. Ensuite, l'étude de la réponse à la morphine chez des patients présentant une obésité morbide a montré que la fréquence de l'allèle 118G d'OPRM1 et le seuil de sensibilité à la douleur sont plus élevés que chez les patients à poids normal. La recherche des facteurs influençant la variabilité de la réponse à la méthadone chez des patients toxicomanes traités pour substitution a mis en évidence deux polymorphismes (TaqIA de DRD2/ANKK1 et c.118A>G d'OPRM1) significativement associés à la dose maximale de méthadone administrée. Trois facteurs sont associés au phénotype CYP3A, impliqué dans le métabolisme de la méthadone: la prise de benzodiazépines, l'infection par le VIH et un polymorphisme de POR, gène qui code une oxydoréductase. De plus, le travail mené sur les effets secondaires cardiaques de la méthadone a permis de mettre en évidence trois facteurs corrélés à l'allongement de l'espace QT : la dose, l'infection par le VIH et le polymorphisme p.Lys897Thr de KCNH2 codant pour le canal potassique hERG. Ces travaux contribuent à démontrer l'intérêt d'intégrer des données cliniques et génétiques dans la prescription personnalisée des opioïdes.

En 2008, le génome d'un nouveau virus a été caractérisé au sein d'un cancer cutané rare survenant préférentiellement chez l'immunodéprimé, le carcinome de Merkel. Ce nouveau virus appartenait à la famille des Polyomaviridae qui comprend des virus dont le caractère cancérigène chez l'animal est avéré depuis plus de 50 ans. Dénommé Polyomavirus de Merkel puisqu'il semblait lié à la survenue du cancer du même nom, il constituait le premier Polyomavirus impliqué de manière consistante dans un cancer humain. Cette implication reposant sur une étude unique limitée à 10 cas, l'objectif de notre travail de thèse était de confirmer le rôle étiologique du Polyomavirus de Merkel dans le carcinome de Merkel.Nous avons montré que le génome du Polyomavirus de Merkel était présent dans les trois quarts des cas de carcinome de Merkel, mais également que le virus infecte la population générale de manière quasi-ubiquitaire et de nombreux tissus en dehors de la peau. Les faits que chez les sujets atteints de carcinome de Merkel, l'ADN viral soit présent à des taux décelables de manière chronique dans différents tissus et que les titres d'anticorps sériques spécifiques du virus soient élevés suggèrent que ces sujets développent une infection chronique active. Celle-ci pourrait faciliter la survenue de mutations et d'intégrations de l'ADN viral qui sont spécifiquement associées aux carcinomes de Merkel. Ces modifications secondaires du génome viral aboutissent à la production d'oncoprotéines virales par les cellules tumorales, mais à l'abolition des capacités réplicatives donc lytiques du virus et constitueraient ainsi le support de la transformation tumorale.

La génération et/ou le recrutement de cellules immuno-suppressives fait partie des mécanismes majeurs utilisés par les tumeurs afin d'échapper aux réponses anti-tumorales du système immunitaire. Parmi les cellules capables d'inhiber les réponses anti-tumorales, les lymphocytes T CD4+ régulateurs et les macrophages de type II tiennent un rôle de premier ordre dans le contexte tumoral. Au cours de ma thèse, j'ai pu étudier l'impact de ces deux populations dans la suppression des réponses immunitaires anti-tumorales dans le modèle MT/ret de mélanome spontané métastatique. L'ensemble de nos résultats met en avant plusieurs niveaux d'immuno-suppression dans le modèle MT/ret. D'une part, les lymphocytes T CD4+ régulateurs, de par leur localisation dans les ganglions drainants et dans la peau, semblent impliqués dans la suppression des réponses anti-tumorales aux localisations et aux moments où les tumeurs nécessitent une forte inhibition des effecteurs anti-tumoraux. D'un autre côté, les macrophages de type II présentent, en plus de leurs capacités immuno-suppressives, des fonctions importantes pour la croissance et la dissémination tumorale justifiant leur localisation dans le microenvironnement tumoral. Dans un second temps, nos données suggèrent pour la première fois un rôle des monocytes Ly-6Cfort dans le contrôle tumoral via la lyse de ces dernières ou encore le maintien de la dormance des cellules tumorales disséminées. En conséquence, nous proposons de les ajouter à la liste des acteurs immunitaires directement impliqués lors des phases d'élimination et d'équilibre de la théorie de l'immuno-éditing. De plus, nous mettons en évidence leur inhibition par les lymphocytes T CD4+ régulateurs, ce qui n'avait pas non plus été décrit précédemment. Ceci nous pousse à suggérer de prendre plus en compte l'impact des lymphocytes T CD4+ régulateurs sur d'autres populations immunitaires que les lymphocytes T dans le contexte tumoral

Quatre études épidémiologiques menées en Afrique ont montré que les enfants issus de mères ayant un placenta infecté par Plasmodium falciparum lors de l'accouchement font des infections palustres plus précocement que les autres enfants. Le fœtus serait sensibilisé in utero par les parasites infectants et développerait par la suite une tolérance aux infections palustres. Cette hypothèse nous conduit à supposer que i) la réponse anticorps spécifique de P. falciparum est différente chez les enfants en fonction du statut infectieux du placenta des mères à l'accouchement et ii) que cette sensibilité ne pourrait être induite que par les antigènes parasitaires porteurs des mêmes polymorphismes que ceux rencontrés in utero. Un troisième projet a consisté au développement d'une méthodologie permettant de distinguer les anticorps maternels de ceux néo-synthétisés par l'enfant dans le but de mesurer précisément l'acquisition de la réponse anticorps élaborée par l'enfant dès son plus jeune âge. Nous avons mis en place le suivi régulier et rapproché d'une cohorte de 620 nouveau-nés de la naissance à 18 mois au Bénin. Nous avons mesuré leurs réponses anticorps dirigées contre sept antigènes de P. falciparum candidats vaccins et constaté que le processus de maturation immunitaire commence à être mis en place à l'âge de 18 mois. L'infection palustre placentaire ne semble pas influer sur l'acquisition de la réponse anticorps spécifique jusqu'à 18 mois de vie. La méthodologie de distinction des anticorps maternels et néo-synthétisés a été validée. La caractérisation des polymorphismes des antigènes parasitaires présents à l'accouchement et pendant le suivi des enfants, mis en relation avec les données environnementales, a permis de valider en partie l'hypothèse de tolérance immunitaire.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie grave caractérisée par une obstruction progressive des petites artères pulmonaires, conduisant à une augmentation progressive des résistances vasculaires pulmonaires (RVP) et à terme à une défaillance cardiaque droite et au décès du patient. La vasoconstriction, le remodelage vasculaire pulmonaire, la thrombose in situ et la dysfonction endothéliale sont autant de facteurs qui contribuent au développement et à la progression de la maladie. Ces travaux de doctorat ont visé à préciser et mieux comprendre le phénotype anormal de la cellule endothéliale (CE) pulmonaire de patients HTAP afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques adéquates pour corriger et restaurer la dysfonction endothéliale associée à l'hypertension pulmonaire. Plusieurs perturbations fonctionnelles liées à des anomalies moléculaires ont pu être identifiées. Les CE HTAPi sont caractérisées par une prolifération, une migration, une survie et une réponse excessive à différents facteurs de croissance : PDGF, EGF, et FGF2. Parmi les anomalies moléculaires à l'origine de ces perturbations fonctionnelles, nous avons retrouvé une production et une libération anormale de FGF2, de MMP2, de MIF, d'IL-6 et de MCP-1, mais aussi une activité constitutive de la MAPK, une surexpression des facteurs anti-apoptotiques BCL2 et BCL-xL, de FGFR2, de p130cas et de CD74. Cette meilleure compréhension de la CE-HTAPi a déjà permis d'identifier plusieurs cibles qui pourraient être évaluées et à aussi permis de soulever un certain nombre de questions qui requiert des études plus poussées.

Ce travail a permis de réaliser une évaluation complète de différentes séquences de siRNA dirigées contre EWS/Fli-1 dans le cadre du traitement des tumeurs de la famille du sarcome d'Ewing Un siRNA a été vectorisé de manière efficace par des nanoparticules polymères ciblées contre un marqueur membranaire spécifique des ESFT. Ces nanoparticules ont été caractérisées et semblent bien tolérées à la fois in vitro et in vivo. Leur évaluation a été réalisée sur des cellules humaines et après prise des tumeurs ce qui représente une avancée intéressante dans la lutte contre les ESFT. La mise au point d'un modèle fluorescent de sarcome d'Ewing permettra de mieux caractériser leur effet sur les métastases, facteur essentiel dans la survie des patients. Enfin, il a été montré que les techniques d'imagerie in vivo permettaient de suivre le devenir in vivo des nanoparticules ce qui permettra de comprendre leur biodistribution et leur mode d'action.