La mitochondrie occupe un rôle essentiel au sein des cellules cancéreuses. Etant la source principale de synthèse d’ATP mais est également le lieu de réactions anaboliques et cataboliques, la mitochondrie supporte le développement tumoral. De plus, la mitochondrie est également impliquée dans la réponse aux stress cellulaire en régulant notamment l’autophagie ou la mort des cellules cancéreuses.Dans ce contexte, nous avons démontré que la fonction mitochondriale peut altérer la réponse au stress réticulaire permettant la survie des cellules tumorales. En effet, la surexpression de la protéine GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper) atténue la mort cellulaire induite par le stress réticulaire. Ceci est permis grâce au maintien du réseau mitochondrial et à l’augmentation de la fonction mitochondriale. Dans cette étude, nous avons démontré que le maintien de la fonction mitochondriale est important pour l’effet protecteur de GILZ puisque l’utilisation de lignées cellulaires de mélanome dépourvues d’activité mitochondriale (lignées ρ0) et surexprimant GILZ sont sensibles à la mort induite par les inducteurs de stress réticulaire. Nos études ont également démontré que l’augmentation de la fonction mitochondriale induite par GILZ peut être utilisée pour resensibiliser les cellules cancéreuses à la mort notamment en utilisant des molécules prooxydantes comme l’elesclomol.Dans un autre contexte tumoral, nous avons également démontré qu’une sous population de cellules de mélanome BRAFV600E peuvent augmenter leur métabolisme mitochondrial dans le but de survivre à la mort cellulaire induite par les inhibiteurs de MAPK. La résistance aux MAPKi implique une augmentation significative de l’OxPHOS mitochondriale associée un remodelage du réseau mitochondrial autour du réticulum endoplasmique facilitant la recapture du calcium mitochondrial. Nos résultats ont permis de démontrer que la fonction mitochondriale est cruciale pour la survie des cellules cancéreuses. De part son rôle cellulaire multiple, il apparaît clairement que la mitochondrie constitue une cible thérapeutique de choix dans le traitement des cancers. / Mitochondria occupies a key role in cancer cells. As the main source of ATP synthesis and the site of anabolic and catabolic reactions, mitochondria support tumor development. Besides, mitochondria are also involved in the response to cellular stress regulating autophagy or cancer cell death.In this context, we have demonstrated that mitochondrial function may alter the ER stress response thus promoting tumor cell survival. Indeed, overexpression of the Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper protein (GILZ) protein attenuates endoplasmic reticulum stress mediated cell death. This is achieved by maintaining the mitochondrial network and the increase of mitochondrial function. In this study, we demonstrated that maintaining mitochondrial function is important for the protective effect of GILZ since using melanoma cell lines lacking mitochondrial activity (ρ0 cell lines) and overexpressing GILZ are susceptible to death induced by reticular stress inducers. Our studies have also shown that the increase of mitochondrial function induced by GILZ can be used to re-sensitize the cancer cells to death induced by prooxidant molecules as elesclomol.In another tumoral context, we have also demonstrated that a sub-population of BRAF mutated melanoma cells can increase mitochondrial metabolism to survive to ER stress-mediated cell death induced by several MAPK inhibitors. Resistance to MPAki involves a significant increase in mitochondrial OXPHOS associated with mitochondrial network remodeling around the ER, which facilitates mitochondrial calcium uptake. Our results have shown that mitochondrial function is crucial for the survival of cancer cells. Altogether our data indicate that given their multiple cellular roles, cancer cell mitochondria constitute attractive therapeutic targets.

Doctorat en sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Des études épidémiologiques ont montré que l’exposition à certains xénobiotiques est associée à une augmentation de la prévalence des maladies métaboliques. L’Homme est exposé à des mélanges de xénobiotiques de manière chronique et inévitable. Nous avons étudié les effets de l’interaction de deux xénobiotiques sur le métabolisme du foie, organe majeur de détoxification de l’organisme. Nous avons choisi deux perturbateurs endocriniens et polluants organiques persistants, qui activent des voies de signalisation différentes: la 2, 3, 7, 8 tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD), agissant via le récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR), et l’α-endosulfan, un pesticide organochloré, qui peut agir via la voie du récepteur aux oestrogènes (ER) ou du récepteur X aux pregnanes (PXR). Notre objectif est de déterminer l’effet du mélange de ces polluants par rapport à chaque polluant isolé sur la régulation de certaines voies du métabolisme hépatique in vitro dans la lignée hépatocytaire humaine, HepaRG. Dans une première publication, une étude du transcriptome de cellules HepaRG différenciées a été effectuée. Ces cellules ont été exposées pendant 30 heures à 25nM de TCDD, 10μM d’α-endosulfan, ou au mélange. Nous avons observé que le mélange inhibe fortement l’expression de certains gènes impliqués dans le métabolisme glucidique et dans celui des alcools. Dans une seconde étude, nous avons donc étudié le mécanisme d’action du mélange sur le métabolisme glucidique. L’expression de deux gènes de la néoglucogenèse hépatique, le transporteur de glucose 2 (Glut2) et la glucose 6 phosphatase (G6Pc), est réduite de plus de 80% par le mélange. L’expression d’autres gènes du métabolisme glucidique (pyruvate kinase, glycogène synthase, glycogène phosphorylase, pyruvate déhydrogénase 2) est aussi diminuée, suggérant que le mélange peut affecter ce métabolisme de manière significative. De plus, la production de glucose diminue de 80% avec le mélange dans des conditions néoglucogéniques. En condition glycolytique, l’oxydation du glucose en CO2 diminue de 30% après 72 heures d’exposition au mélange. Un traitement à plus long terme (8 jours) avec des doses plus faibles des polluants (0.2 à 5nM de TCDD, 3μM d’α-endosulfan) diminue aussi l’expression de la G6Pc et de Glut2. Nous avons montré que la TCDD active bien la voie du AhR, et que le ER est impliqué dans l’action de l’α-endosulfan. Dans la troisième partie de cette thèse, nous avons étudié la régulation de plusieurs enzymes impliquées dans le métabolisme de l’alcool (alcool déshydrogénases, ADHs, cytochrome P450 2E1, CYP2E1) après l’activation du AhR. Les agonistes du AhR entrainent la diminution de l’expression des ARNm des ADH1, 4, 6 et du CYP2E1 et des protéines correspondantes. Nous avons montré que cette régulation utilise la voie génomique du AhR. De plus, cet effet est également observé après traitement de 8 jours par de faibles doses de TCDD. L’exposition chronique de l’Homme à de faibles doses de xénobiotiques en mélange pourrait affecter le métabolisme glucidique hépatique et contribuer, en partie, au développement du syndrome métabolique. / Epidemiological studies have shown that exposure to certain xenobiotics is associated with an increased prevalence of metabolic diseases. Humans are exposed to mixtures of xenobiotics in a chronic and inevitable way. We studied the effects of the interaction of two xenobiotics on metabolism in the liver, the major organ for detoxification in the body. We chose two endocrine disruptors and persistent organic pollutants which activate different signaling pathways: 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), which uses the AhR (Aryl hydrocarbon receptor) pathway, and α-endosulfan, an organochlorine pesticide, which acts via the PXR (pregnane X receptor) and/or the ER (estrogen receptor) pathway. Our aim was to determine the effects of this pollutant mixture, as compared to each pollutant alone, on the regulation in vitro of some hepatic metabolism pathways in the human hepatic cell line, HepaRG. In the first publication, a transcriptomic study of differentiated HepaRG cells was performed. The cells were exposed for 30h to 25nM TCDD, to 10 µM α-endosulfan or to the mixture. We observed that the mixture strongly inhibited the expression of some genes involved in the metabolism of glucose and alcohol. In the second study, we studied the mechanism of action of the mixture of pollutants on the metabolism of glucose. The expression of two genes involved in hepatic gluconeogenesis, glucose transporter 2 (GLUT2) and glucose-6-phosphatase (G6Pc), were reduced 80% by the mixture. The expression of other glucose metabolism genes (pyruvate kinase, glycogen synthase, glycogen phosphorylase, pyruvate dehydrogenase 2) also was decreased suggesting that the mixture might impact markedly carbohydrate metabolism. Furthermore, glucose production decreased 40% with the mixture under gluconeogenic conditions. Under glycolytic conditions, the oxidation of glucose into CO2 decreased 30% after 72h of exposure of the cells to the mixture. Long-term treatment (8 days) with lower doses (0.2 to 5 nM TCDD, 3 µM α-endosulfan) similarly decreased G6Pc and GLUT2 expression. We showed that TCDD activated the AhR pathway, and that ER was partly involved in the α-endosulfan effect. In the third part of this thesis, we studied the regulation of several enzymes involved in the metabolism of alcohol (alcohol dehydrogenase, ADH, cytochrome P450 2E1, CYP2E1) after activation of AhR. AhR agonists led to a decrease in the amounts of mRNAs for ADH1, 4, 6 and CYP2E1 and the corresponding proteins. We showed that this regulation uses the AhR genomic pathway. Furthermore, this effect was also observed after 8 days of treatment with lower doses of TCDD. Chronic exposure of individuals to low doses of xenobiotics in mixtures might significantly affect hepatic carbohydrate metabolism and be a contributing factor for the development of the metabolic syndrome.

Le paludisme est une des maladies tropicales les plus dévastatrices au monde causée par des parasites protozoaires intracellulaires du genre Plasmodium. Cinq espèces de plasmodies sont responsables du paludisme chez l'homme et causent 600 000 décès par an principalement chez les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes vivant dans les régions les plus pauvres du globe. Les parasites ont généré une résistance contre les chimiothérapies existantes et aucun vaccin efficace n'est encore disponible. Il est donc impératif d'identifier et de valider de nouvelles cibles qui peuvent être exploitées pour la découverte de nouveaux médicaments.Cette étude a porté sur la caractérisation d'un enzyme, la phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC), produit d'un gène spécifique au parasite et absent chez l'hôte humain, ce qui constitue l'un des pré-requis d'une cible potentielle pour la découverte de médicaments. Le gène avait été montré comme essentiel pour des parasites seulement en absence de malate ou de fumarate, suggérant un rôle de la protéine dans le métabolisme du carbone intermédiaire des parasites.Mes études de thèse avaient pour but de caractériser le rôle de la PEPC en utilisant la métabolomique. J'ai d'abord établi et normalisé une méthodologie d'analyses métabolomiques des globules rouges infectés par Plasmodium et optimisé l'analyse des métabolites hydrophiles présents dans le parasite intracellulaire et sa cellule hôte. Nous nous sommes concentrés sur les métabolites du métabolisme du carbone intermédiaire, où la PEPC pouvait jouer un rôle déterminant par analogie avec les plantes et les bactéries. Des analyses ciblées utilisant un marquage isotopique du métabolome à partir de 13C-U-glucose, 13C-bicarbonate et 13C, 15N-glutamine ont aussi été réalisées permettant de mieux appréhender les conséquences d'un KO de l'enzyme PEPC sur le métabolisme du parasite.Les données montrent que l'enzyme PEPC permet une fixation du bicarbonate et catalyse une réaction anaplérotique conduisant à du malate qui est introduit dans le cycle de l'acide tricarboxylique mitochondrial, transférant ainsi des équivalents réducteurs du cytoplasme à la mitochondrie et fournissant aussi un point d'entrée du squelette carboné dans le cycle. Les résultats montrent surtout que les parasites possèdent un cycle complet et de type oxydatif de l'acide tricarboxylique mitochondrial. Il parait y avoir trois points d'entrée: 1. l'acétyl CoA résultant du pyruvate généré par la glycolyse et décarboxylé dans la mitochondrie; 2. l'acide alpha-cétoglutarique provenant du glutamate, qui lui-même résulte de la désamination de la glutamine essentiellement fournie par l'environnement externe; 3. le malate, produit en aval de la malate déshydrogénase qui réduit l'oxaloacétate produit par la PEPC. En aval de la PEPC, la biosynthèse des pyrimidines opère grâce à l'activité de l'aspartate aminotransférase agissant sur oxaloacétate.En dehors du malate, le fumarate est le seul autre métabolite qui permet de s'opposer au défaut de croissance des parasites déficients en PEPC, ce qui a conduit à évaluer le rôle de la fumarase. À cette fin, l'étiquetage du gène endogène fumarase avec une étiquette HA, a permis de montrer que la protéine est exprimée dans les stades intra-érythrocytaires de P. falciparum et de montrer que la protéine se trouve à la fois dans la mitochondrie et le cytoplasme. La protéine recombinante a été exprimée avec succès et partiellement caractérisée biochimiquement. De nombreuses tentatives visant à générer des mutants de délétion génétique de P. falciparum n'ont pas abouti, laissant en suspens la question du caractère essentiel du gène pour les parasites. Cependant, il est possible de cibler le locus du gène via un marquage C-terminal. Ceci suggère que l'enzyme peut être essentielle pour la survie du parasite et donc une cible exploitable pour la découverte d'un type nouveau de médicament antipaludique. / Malaria is one of the world's most devastating tropical diseases caused by obligate intracellular protozoan parasites of the genus Plasmodium. Five species of these parasites cause malaria in humans and infection results in ~600,000 deaths annually primarily in children under the age of 5 and pregnant women living in the poorest areas of the globe. The parasites have an outstanding ability to generate resistance against existing chemotherapies and an efficacious vaccine is not available yet. Therefore it is imperative that attempts are being made to identify and validate new targets that can be exploited for future drug discovery.This study focused on the validation and elucidation of a parasite-specific gene product namely phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC), which is not present in the human host and thus has one of the pre-requisites of a potential drug target. The gene had been previously genetically validated and it was demonstrated that mutant parasites lacking pepc were only viable in the presence of malate or fumarate, suggesting a role of the protein in intermediary carbon metabolism of the parasites.My studies had the goal to assess the role of PEPC using a metabolomics approach. Initially the methodologies to perform metabolomics analyses of Plasmodium-infected RBCs were established and standardised and it was assessed how to best analyse the hydrophilic metabolites present in the intracellular parasites and its host cell. We focused on metabolites of intermediary carbon metabolism, as it is likely that PEPC is important for metabolic functions linked to this in the parasites, in analogy to plants and bacteria. While global metabolomics analyses were appealing, it was decided to apply a targeted metabolomics and comparative approach using stable isotope labelling of the parasite metabolomes with 13C-U-glucose, 13C-bicarbonate and 13C-,15N-glutamine to assess the consequences of the pepc knockout on parasite metabolism.The data demonstrated that PEPC has an anaplerotic function fixing bicarbonate and leading to generation of malate that is fed into the mitochondrial tricarboxylic acid cycle and so transfers reducing equivalents from cytoplasm to mitochondrion as well as providing an entry point of carbon skeleton into the cycle. The most important findings with respect to parasite mitochondrial metabolism were that the parasites possess a complete and oxidative tricarboxylic acid cycle, which appears to have three entry points: 1. Acetyl CoA resulting from glycolytically generated pyruvate that is decarboxylated in the mitochondrion; 2. α-ketoglutarate from the reaction of glutamate dehydrogenase and 3. malate, which is a downstream product of malate dehydrogenase that reduces oxaloacetate the reaction product of PEPC. Other downstream reactions supported by PEPC activity are pyrimidine biosynthesis through the activity of aspartate aminotransferase also acting on the PEPC-derived oxaloacetate.Apart from malate, fumarate was the only other metabolite that reversed the growth defect of pepc mutant parasites. Hence the role of fumarase in the parasites was also assessed. To this end the endogenous fumarase gene of P. falciparum was tagged with an HA-tag, which showed that the protein is expressed in the intra-erythrocytic stages of P. falciparum and demonstrated that the protein is located in both mitochondrion and cytoplasm. In addition, the recombinant protein was produced and partially biochemically characterised. Numerous independent attempts to generate genetic deletion mutants of P. falciparum were unsuccessful, leaving the question whether the gene is essential for the parasites unanswered. However, it was possible to manipulate the locus by C-terminal tagging of the fumarase gene suggesting that fumarase might be indeed essential for parasite survival and therefore possibly suitable for future drug design and discovery.

Au-delà de l'information génétique contenue dans la séquence de l'ADN des cellules, il existe une mémoire cellulaire, dite épigénétique comprenant l'ensemble des circuits génétiques avec rétroactions positives permettant d'amplifier ou de maintenir une réponse cellulaire dans le temps. Nous nous sommes intéressés, à travers deux exemples, aux boucles de rétrocontrôle positif comme élément de réponse à un signal, permettant de fixer, de manière à la fois dynamique et robuste, le comportement cellulaire. Dans un premier temps, nous avons identifié une boucle d'auto-amplification dans la production de vitellogénine chez la truite et permettant d'expliquer l' « effet mémoire de la vitellogénèse » (une seconde stimulation à l'œstradiol induit une plus forte production de vitellogénine et plus rapidement que lors de la première stimulation, alors même que le niveau de vitellogénine retombe à zéro entre les deux stimulations). Le modèle que nous proposons implique un récepteur tronqué à l'œstradiol possédant une activité basale même en l'absence de son ligand, permettant de maintenir la cellule dans un état d'aptitude à répondre sans pour autant produire de vitellogénine. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à une des causes possibles provoquant la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), responsable des métastases dans les cancers. L'EMT témoigne d'un état plus agressif des cellules tumorales et s'accompagne notamment d'un changement du métabolisme des cellules cancéreuses, diminuant la part de la phosphorylation oxydative au profit de la glycolyse (effet Warburg). Cela entraîne une baisse d'efficacité de la production d'ATP, obligeant les cellules à prélever davantage de nutriments dans leur milieu. Cette observation a suscité le développement de thérapies basées sur la privation de glucose et qui, a priori, devraient nuire principalement aux cellules cancéreuses. Nous avons étudié les effets d'un faible contenu cellulaire en ATP sur la transformation cellulaire. Nous avons observé qu'un traitement par un analogue non métabolisable du glucose diminue drastiquement le contenu en ATP des cellules ayant passé l'EMT et induit des changements morphologiques et génétiques orientés vers le phénotype mésenchymateux. La protéine MKL1, cofacteur de transcription dont l'activité est régulée par la polymérisation de l'actine, pourrait être un relais génétique entre l'état métabolique cellulaire et le maintien de l'EMT. Ces résultats suggèrent de fortes connections entre l'EMT et le niveau énergétique des cellules, faisant d'une privation d'énergie une cause possible de l'aggravation du phénotype mésenchymateux et remettant en cause les bienfaits sur le long terme de thérapies visant à « affamer » les cellules tumorales. / Beyond the genetic information contained in the DNA sequence of cells, there is a cellular memory called epigenetic, including genetic circuits with positive feedback loops amplifying or maintaining cellular states in time. We studied through two examples, the positive feedback loops as part of response to a signal, able to set cell behavior, in a dynamic and robust way. As a first step, we identified a self-amplification loop in the production of trout vitellogenin explaining the "vitellogenesis memory effect" (a second estradiol stimulation induces higher and faster vitellogenin production than during the first stimulation, even though the vitellogenin level falls to zero between the two stimuli). The model we propose involves a truncated estradiol receptor, with a basal activity even in the absence of its ligand, which is able to maintain the cell in an estrogen-responsive state without producing vitellogenin. In a second step, we studied one of the possible causes leading to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), involved in cancer metastasis. The EMT reflects a more aggressive state of tumor cells and is associated with a particular change in the metabolism of cancer cells, reducing the part of oxidative phosphorylation in favor of glycolysis (Warburg effect). This leads to a reduction in the efficiency of ATP production, forcing the cells to take more nutrients from their environment. This observation led to the development of treatments based on glucose deprivation which should mainly affect cancer cells. We studied the effects of a low cellular ATP content on cell transformation. We observed that a treatment with a non-metabolizable glucose analogue drastically reduces the ATP content of cells that had undergone EMT and induces morphological and genetic changes enforcing the mesenchymal phenotype. We identified the transcriptional coactivator MKL1, whose activity is regulated by actin polymerization, as a possible genetic link between the cellular metabolic state and maintenance of EMT. These results suggest strong connections between the EMT and the energy level of the cells, and raise serious questions about the benefits of the long-term therapy "starving" tumor cells, considering that energy deprivation could aggravate the mesenchymal cell phenotype.

Certaines formes d'épilepsies nécessitent encore d'être étudiées pour pouvoir être traitées. Le modèle d'animaux épileptiques développé par le Laboratoire de Neurobiologie est constitué des lignées MSO-Fast et MSO-Slow, convulsant respectivement rapidement ou tardivement après l'injection de méthionine sulfoximine (MSO). Ce travail a pour but d’analyser et de comparer ces deux lignées afin de mieux comprendre les mécanismes contribuant à l’apparition des crises induites par la MSO. Les deux lignées ont d'abord été caractérisées par leurs réponses à la MSO. L'implication de la voie glutamatergique a ensuite été mise en évidence par l'administration de convulsivants et d'anticonvulsivants ainsi que par une étude de l'anxiété et de la faculté d'apprentissage. L'étude de la glutamine synthétase, enzyme-clé du recyclage du glutamate en tant que neurotransmetteur, a révélé une plus faible activité de cette enzyme pour la lignée MSO-Fast. La mesure de la variation du taux de glycogène astrocytaire indique que le métabolisme glucidique, lié étroitement à la voie glutamatergique, participe à la différence de sensibilité entre les deux lignées. Une étude complémentaire de la glycosylation des protéines a révélé une modification de la N-glycosylation induite par une dose convulsivante de MSO. Les concentrations de 13 molécules appartenant à la famille des monoamines ont été mesurées par HPLC. Cette étude démontre d'une part la forte diminution de tryptophane et de tyrosine après injection de MSO et d'autre part l'implication de la noradrénaline et de la sérotonine, les deux principaux neurotransmetteurs contrôlant la quantité de glycogène astrocytaire. / Certain forms of epilepsies still require understanding their mechanisms to be treated. The model of epileptic animals developed by the Laboratory of Neurobiology is constituted by the lines MSO-Fast and MSO-Slow, convulsing respectively quickly or late after the injection of methionine sulfoximine (MSO). This work aims at analyzing and at comparing these two lines to better understand mechanisms contributing to the appearance of the crises induced by MSO. Both lines were characterized at first by their answers to MSO. The implication of the glutamatergic neurotransmission was then revealed by the administration of convulsants and anticonvulsants as well as by a study of the anxiety and the faculty of learning. The study of the glutamine synthetase, the key-enzyme of the the neurotransmitter glutamate recycling, revealed a lower activity of this enzyme for the line MSO-Fast. The measure of the variation of astrocyte glycogen indicates that the glucidic metabolism, connected to the glutamatergic pathway, participates to the difference of sensibility between both lines. The study of the glycoproteins revealed a modification of N-glycosylation linked to a convulsante dose of MSO. The concentrations of 13 molecules belonging to the family of monoamines were measured by HPLC. This study demonstrates on one hand the strong decrease of tryptophane and tyrosine after injection of MSO and on the other hand the implication of norepinephrine and serotonine, two main neurotransmitters controlling the quantity of astrocyte glycogen.

L’océan domine la surface de notre planète et joue un rôle majeur dans la régulation de notre biosphère. Par exemple, les microorganismes photosynthétiques vivant dans l’océan produisent 50% de l’oxygène que nous respirons tous les ans, et une grande partie de notre alimentation et des ressources minérales en proviennent. En cette époque de crise écologique liée à l’accumulation anthropogénique de gaz à effet de serre dans l’atmosphère, il est impératif de développer des énergies plus durables que les carburants fossiles. Le biodiesel pourrait être une source de carburant viable et durable pour remplacer le pétrodiesel mais jusque-là, nos efforts visant à produire des lipides à base de microalgues se sont essentiellement concentrés sur des algues vertes. Dans cette thèse je propose des méthodes pour mieux caractériser une autre catégorie de microalgue : les diatomées. Les diatomées sont une composante importante du phytoplancton et contribuent 40% de la production marine de biomasse primaire. Les diatomées accumulent des lipides en réponse à la carence en nutriments, et même si elles semblent accumuler tout autant de lipides que les microalgues vertes, les voies métaboliques menant à l’accumulation de lipides sont encore peu connues.Dans cette thèse je décris notre caractérisation du glycerolipidome de la diatomée modèle Phaeodactylum tricornutum ainsi que notre étude du remodelage de lipides suite à la carence d’azote ou de phosphate. Des accessions de P. tricornutum isolées dans différentes régions de l’océan ont aussi été étudiées afin de comparer leurs réponses au stress nutritif. Nous avons trouvé que la réponse métabolique menant à l’accumulation de lipides en carence d’azote ou de phosphate est différente. En effet, la carence en azote semble déclencher le recyclage des galactoglycerolipides chloroplastiques ainsi qu’une augmentation de la biosynthèse de novo d’acides gras, alors que la carence en phosphate est plus sévère car nous avons observé une accumulation plus significative de triacylglycerols ainsi que la déplétion totale des phospholipides. De plus, nous avons observé des réponses au stress différentes entre les accessions de P. tricornutum, et en particulier concernant leur capacité à accumuler des lipides. Nous proposons l’hypothèse que ces différences sont liées à leur aptitude à recycler du carbone issu de molécules de stockage non lipidiques.Des approches génomiques ont permis de nombreuses avancées pour mieux comprendre le métabolisme des lipides de microalgues mais notre compréhension des voies de biosynthèse de lipides chez les diatomées est encore limitée. Il y a eu diverses tentatives de caractérisation de la réponse au stress de carence par approche transcriptomique mais l’étude de ces données est incomplète du fait de l’annotation insuffisante des gènes encodant les voies métaboliques pertinentes. Ainsi, dans cette thèse je décris nos tentatives d’annotation de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides de P. tricornutum ainsi que les approches d’ingénierie génétique visant à mieux caractériser certains de ces gènes. J’ai également utilisé notre nouvelle annotation de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides pour effectuer une étude comparative de plusieurs transcriptomes de P. tricornutum en conditions de carence trouvés dans la littérature. J’ai ainsi pu produire une liste de gènes potentiellement impliqués dans l’accumulation de lipides. Enfin, nous avons pu utiliser ces données pour aider l’interprétation de données génomiques et transcriptomiques issues de la diatomée oléagineuse Fistulifera solaris afin de mieux comprendre comment elle accumule des quantités importantes de lipides pour des applications dans le secteur des biotechnologies et des bioénergies. / The ocean dominates the surface of our planet and plays a major role in regulating the biosphere. For example, the microscopic photosynthetic organisms living in the ocean provide 50% of the oxygen we breathe every year, and much of our food and mineral resources are extracted from the ocean. In a time of ecological crisis linked to the accumulation of anthropogenic greenhouse gases in the atmosphere, we must investigate more sustainable energies than fossil fuels. Much attention has been given to biodiesel but so far most efforts to efficiently produce triacylglycerols in microalgae have focused on green algae. In this thesis I propose approaches to better understand another type of microalgae that is significantly divergent from green lineages: diatoms. Diatoms are a major phylum of phytoplankton in the ocean and account for 40% of marine primary productivity. While diatoms appear to be at least as effective as green algae for producing lipids, the fatty acid and glycerolipid biosynthetic pathways leading to their production have not yet been well characterized. Therefore, I propose to better characterize these pathways in the model diatom Phaeodactylum tricornutum in order to help unlock the potential of diatoms for lipid-based biotechnological applications.In this thesis, I discuss our attempts to establish a reference for the glycerolipidome of P. tricornutum and of our assessment of the lipid remodeling and accumulation that occurs in response to nitrogen- and phosphorus-starvation. A range of accessions of P. tricornutum isolated from different parts of the ocean were also examined to compare their responses to nutrient deprivation. We found that the metabolic response leading to lipid accumulation in different nutrient-deprived conditions are distinct. Nitrogen-deprivation appears to trigger the recycling of chloroplastic galactoglycerolipids as well as a strong increase in de novo fatty acid synthesis while the response to phosphorus-deprivation was more severe as we observed a higher triacylglycerol pool and the complete depletion of phospholipids. Furthermore, we observed several differences among accessions of P. tricornutum regarding their ability to accumulate triacylglycerol in response to nutrient starvation and propose the hypothesis that these differences are linked to their ability to recycle intracellular carbon from non-lipid storage molecules.Genome-enabled approaches have also allowed significant steps towards elucidating the lipid metabolism of microalgae in the past decade, but our understanding of diatom metabolic pathways is still limited compared to that of other microalgae and higher plants. There have been several attempts to characterize the stress response in P. tricornutum by using transcriptomic approaches but this data is difficult to exploit to its full potential without a better annotation of genes encoding the relevant pathways. Therefore, in this thesis I discuss our attempts to annotate P. tricornutum lipid metabolism genes. Based on this annotation I have attempted to better characterize a selection of genes by genetic engineering and have pursued a comparative study of several published transcriptomes of P. tricornutum in nutrient deprived conditions to produce a list of candidate genes likely to be involved in triacylglycerol accumulation. Finally, we used this data to help interpret genome and transcriptome data of the newly sequenced oleaginous diatom Fistulifera solaris to help understand how it accumulates unusually high amounts of triacylglycerol for applications in the biotechnology and bioenergy industry.

Dans le cadre d'un projet visant à développer des agents ciblant spécifiquement le facteur HIF1alpha inductible par l'hypoxie, BAYER Pharmaceuticals a identifié de façon inattendue de nouveaux inhibiteurs du complexe I, impliqué dans la respiration mitochondriale, qui étaient capables de tuer les cellules cancéreuses hypoxiques in vitro et in vivo. Lors de la modification d'un composé principal plusieurs dérivés ayant des propriétés pharmacodynamiques et pharmacocinétiques favorables ont été identifiés. Ces composés de deuxième génération comprennent BAY87-2243 (B87), que j'ai étudié au cours de mon travail de thèse. Au cours de ces dix dernières années, les mitochondries ont attiré une attention sans précédent en tant que cibles pour le développement de nouveaux traitements anticancéreux avec des applications cliniques. Ainsi, il est apparu important de caractériser les effets antinéoplasiques potentiels de B87 en détail. Mon premier objectif était de tester B87 in vitro, afin de déterminer les conditions dans lesquelles B87 pourrait inhiber la prolifération ou réduire la viabilité des cellules transformées. Dans des conditions de culture standard (disponibilité en nutriments et en oxygène normale), B87 limite la prolifération de plusieurs lignées cellulaires de cancer humain (y compris du carcinome du poumon non à petites cellules H460 et des cellules de carcinome colorectal HCT116), mais ne favorise pas la mort cellulaire. Ensuite, j'ai testé les effets anti-prolifératifs et cytotoxiques de B87 en combinaison avec des médicaments anticancéreux actuellement employés ou molécules naturelles avec des effets antinéoplasiques putatifs. Dans ce contexte, j'ai identifié un fort effet de synergie entre B87 et l'alpha-ketoglutarate (alphaKG), centrale intermédiaire du cycle de Krebs. Pour caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents d'une telle synergie, j'ai étudié la capacité de B87 en association avec l’alphaKG à moduler les grandes voies cellulaires bioénergétiques par l’analyse de flux extracellulaires et par spectrométrie de masse. Dans les cellules HCT116 et H460, l'administration combinée de B87 et alphaKG inhibe non seulement la respiration mitochondriale (comme observé avec l’action de B87 seule), mais aussi la glycolyse, en favorisant par conséquent une baisse létale des taux d'ATP et de glucose-6-phosphate. La combinaison de faibles doses de B87 avec l’alphaKG a également exercée des effets antinéoplasiques robustes in vivo. En conclusion, l’alphaKG s’avère augmenter les effets anticancéreux de B87 in vitro et in vivo, lors de la mise en place d'une crise bioénergétique létale dans les cellules malignes. / In the context of a project aimed at the development of agents that specifically target hypoxia-inducible factor 1 alpha, BAYER Pharmaceuticals unexpectedly identified novel inhibitors of respiratory complex I, which were able to kill hypoxic cancer cells in vitro and in vivo. Upon modification of a lead compound, several derivatives with favourable pharmacodynamic and pharmacokinetic properties have been identified. These second-generation compounds include BAY87-2243 (B87), which I studied during my PhD thesis work.Throughout the past decade, mitochondria attracted unprecedented attention as targets for the development of novel anticancer regimens with clinical applications. Thus, it seemed important to characterize the potential antineoplastic effects of B87 in detail. My first aim was to test B87 in vitro, in order to identify conditions in which B87 might inhibit the proliferation or reduce the viability of transformed cells. In standard culture conditions (normal nutrient availability and oxygen tension), B87 limited the proliferation of several cancer cell lines (including human non-small cell lung carcinoma H460 cells and human colorectal carcinoma HCT116 cells), but did not promote cell death.Next, I tested the antiproliferative and cytotoxic effects of B87 in combination with currently employed anticancer drugs or natural molecules with putative antineoplastic effects. In this context, I identified a strong synergistic effect between B87 and alpha-ketoglutarate (alphaKG), a central intermediate of the Krebs’ cycle. To characterize the molecular mechanisms underlying such a synergy, I investigated the ability of B87 plus alphaKG to modulate the major bioenergetic cellular circuitries by extracellular flux analysis and mass spectrometry. In both H460 and HCT116 cells, the combinatorial administration of B87 and alphaKG inhibited not only mitochondrial respiration (as expected from B87 alone) but also glycolysis, hence promoting a lethal drop in ATP and glucose-6-phosphate levels.Combining low doses of B87 with alphaKG also exerted robust antineoplastic effects in vivo, in both H460 and HCT116 xenografts growing on immunodeficient mice. In conclusion, alphaKG turned out to boost the anticancer effects of B87 in vitro and in vivo, upon the establishment of a lethal bioenergetic crisis in malignant cells.

Le cancer du sein est l’un des cancers le plus souvent diagnostiqué chez les femmes en Europe et dans le monde. Pour certaines formes agressives de cancer du sein, la chimiothérapie est le seul traitement systémique efficace. L'identification des nouveaux biomarqueurs potentiels de progression du cancer, ainsi que leur caractérisation et validation est cruciale, et peut permettre une meilleure compréhension de la biologie du cancer du sein. Nous avons réalisé le séquençage à haut débit de l'exome sur une cohorte de 29, 23 et 27 patients atteints de cancer du sein micropapillaire, métaplasique, et lobulaire pléomorphe respectivement. Outre le taux de mutation élevé dans les gènes déjà étudiés dans la progression du cancer, les carcinomes lobulaires pléomorphiques ont présenté des mutations du gène PYGM (8 patients sur 27, 30%), impliqué dans le métabolisme du glycogène. D'autres analyses de bases de données publiques montrent que PYGM est considérablement sous-exprimé dans les cancers de manière générale par rapport aux tissus normaux et que la faible expression dans les tumeurs est corrélée avec une faible survie sans rechute. Le marquage immunohistochimique sur les tissus inclus en paraffine et fixés au formol de notre cohorte de patients, a confirmé une diminution de l'expression de PYGM dans la zone tumorale comparé aux tissus non-cancéreux adjacents. Pour étudier l'effet de la dérégulation du PYGM sur le métabolisme de la cellule cancéreuse et sa fonction potentielle dans la progression du cancer, nous avons surexprimé PYGM dans des lignées cellulaires cancéreuses. Nous avons observé que la surexpression du PYGM a diminué la quantité du glycogène et modulé certains produits finaux du métabolisme du glycogène. L’analyse métabolomique a révélé une activation métabolique due à la surexpression de PYGM; la modulation de la mort cellulaire dans les conditions de privation de glucose a été observée, mais ces deux effets étaient dépendants de la lignée cellulaire. Les analyses biochimiques et moléculaires nous ont aidés à étudier le comportement des cellules en fonction du niveau d'expression de PYGM. Ces analyses pourraient nous informer sur la pertinence du ciblage du PYGM dans le développement de nouveaux traitements basés sur les biomarqueurs métaboliques utilisés pour le traitement du cancer du sein. L'impact de plusieurs autres biomarqueurs potentiels, identifiés par des analyses de génome, a été testé au cours de ce travail et les gènes étudiés sont mentionnés à la fin de la section résultats. En conclusion, les technologies haut débit jouent un rôle important dans l’identification des nouvelles voies qui peuvent être impliquées dans le développement des cancers. / Breast cancer is the most common cancer diagnosed in women in Europe and worldwide. For some aggressive forms of breast cancer, chemotherapy represents the only effective systemic treatment option. The identification of new potential cancer progression biomarkers, as well as their characterization and validation, is crucial, and may lead to a better understanding of breast cancer biology. We performed whole exome and targeted sequencing on a cohort of 29 micropapillary, 23 metaplastic, and 27 pleomorphic lobular breast cancer patients samples. Apart from high mutational rate in genes already known in cancer progression, pleomorphic lobular carcinoma presented mutations in PYGM, a gene involved in glycogen metabolism, in 8 out of 27 samples (30 %). Further analyses of publicly available datasets showed that PYGM is dramatically underexpressed in common cancers as compared to normal tissues and that low expression in tumors is correlated with poor relapse-free survival. Immunohistochemical staining on formalin-fixed paraffin-embedded tissues available in our cohort of patients confirmed higher PYGM expression in normal breast tissue compared to equivalent tumoral zone. We thus overexpressed PYGM in different cancer cell lines in order to investigate the effect of PYGM dysregulation on cancer cell metabolism and its potential function in cancer progression. We observed that PYGM overexpression decreased glycogen content and modulated final glycogen metabolism products content. Metabolomics analysis revealed a metabolic activation due to PYGM overexpression; and modulation of cell death under glucose deprivation was observed, however these effects were cell line dependent. Biochemical and molecular analyses help us to investigate cell behavior according to PYGM expression level and could inform about a potential efficacy of PYGM targeting in new therapy development based on metabolic biomarkers applied to breast cancer treatment. The impact of several other potential biomarkers, identified by broad genome analyses, was tested during this thesis and these genes are mentioned in the end of result section. Altogether, high-throughput technologies play an important role in novel cancer pathways identification that may be involved in the pathogenesis of common malignancies.