Macrophages are cells of the innate immune system that can be found in large quantities in cancer tumors and affect cancer progression by regulating growth and invasiveness of cancer cells. There are two main phenotypes of macrophages denoted M1 and M2. In this thesis, the M1 and M2 phenotype of human macrophages were characterized, and effects of the macrophages on the growth and invasiveness of colon and lung cancer cells were studied. Macrophages of the M1 phenotype, but not the M2 phenotype, inhibited growth of both colon and lung cancer cells, and the inhibition for some of the cancer cell lines was induced by cell cycle arrest in the G1/G0 and/or G2/M cell cycle phases. In the colon cancer cell line, the macrophage induced cell cycle arrest was found to attenuate the cytotoxic effect of the chemotherapeutic drug 5-FU. Macrophages were also shown to express high levels of proteases (matrix metalloproteinase-2 and 9) and high levels of proteins of the urokinase-type plasminogen activator (uPA) system, in comparison to the lung cancer cell lines studied. Expression of these has been found to predict poor outcome in lung cancer, and the results suggest macrophages to be important contributors of these in lung tumors. Furthermore, the M1 phenotype was found to express higher levels of the uPA receptor than the M2 phenotype. Prostaglandin E2 (PGE2) is a potent inflammatory molecule expressed by e.g. macrophages and monocytes, and inhibition of its expression has been shown to reduce the risk of colon cancer. Green tea and black tea was found to be potent inhibitors of PGE2 formation in human monocytes, and the inhibitory effects of green tea was likely due to its content of the polyphenol epigallocatechin gallate. Rooibos tea also inhibited PGE2 formation, but was less potent than green and black tea. The primary mechanism for the inhibition was via inhibition of expression of enzymes in the PGE2 formation pathway, and primarily microsomal prostaglandin synthase-1. / Macrophages are cells of the immune system often found in large numbers in cancer tumors. They affect multiple aspects of cancer progression, including growth and spread of cancer cells, and the efficacy of treatments. There are two major macrophage phenotypes denoted M1 and M2, that have mainly pro- and anti-inflammatory properties, respectively. In this thesis, M1 and M2 macrophages were characterized and effects of them on different aspects of cancer progression were studied using culture of colon, and lung cancer cells. The M1 phenotype inhibited proliferation of cancer cells from both colon and lung. The growth inhibition was for some cell lines accompanied by cell cycle arrest. The macrophage induced cell cycle arrest was found to protect colon cancer cells from the cytostatic drug 5-fluorouracil. Prostaglandin E2 (PGE2) contributes to colon cancer development and treatment of monocytes with tea extracts inhibited PGE2 formation via inhibition of expression of microsomal prostaglandin E synthase-1. Proteases can degrade the extracellular matrix of a tumor to facilitate cancer cell invasion and metastasis. The M1 and M2 phenotypes of macrophages expressed several protease activity related genes to a greater extent than lung cancer cells, and M1 more so than the M2 phenotype.

In this study, we sought to define an underlying molecular mechanism of how inflammation induces cancer initiation. Cancer-associated inflammation is marked by the presence of inflammatory cells and mediators including cytokines, chemokines, and reactive oxygen species. There is a growing body of evidence establishing the link between chronic inflammation and cancer. Twenty percent of cancers have been linked to chronic infections. For instance, bacterial and viral infections induce inflammation which is a known risk factor for cancer. During inflammation, Ml macrophages' production of pro-inflammatory cytokines and reactive oxygen species (ROS) drives their function as anti-microbial. Likewise, the transcription factor nuclear factor kappa B (NF-KB) is known to induce a variety of stimulators, including ROS, to contribute to the inflammatory process. Therefore, we sought to explore the relationship between Ml macrophages and NF-KB, suggesting that Ml macrophage mediates cancer initiation via a NF-KB-dependent pathway, which collectively contributes to a metastatic phenotype.

Apesar de apenas 10% dos indivíduos infectados por Mycobacterium tuberculosis desenvolverem tuberculose, essa doença causa a morte de milhares de pessoas anualmente. Sabendo que o background genético do hospedeiro está relacionado com suscetibilidade/resistência à infecção por M. tuberculosis, nosso grupo vem avaliando diferenças na resposta imunológica entre camundongos C57BL/6 resistentes e BALB/c suscetíveis. No presente estudo, nós nos propusemos a avaliar populações de macrófagos M1 e M2 em animais com capacidade diferente de elaborar resposta imune celular nessa infecção. Animais C57BL/6, que elaboram resposta imune celular de maior magnitude, e BALB/c foram infectados com M. tuberculosis, e avaliados aos 30 e 70 dias de infecção. Observamos maior porcentagem de células CD11b+Ly-6C+, que caracterizam monócitos inflamatórios, no pulmão de animais BALB/c com 70 dias de infecção comparada à porcentagem detectada em animais C57BL/6 com mesmo período de infecção. Houve correlação positiva significativa entre número de bacilos e expressão gênica para iNOS aos 30 dias de infecção comparando ambas as linhagens. Ao contrário da nossa hipótese inicial, observamos maior porcentagem de células CD11b+F4/80+CD206+, que caracteriza o fenótipo de macrófagos M2, no pulmão de animais C57BL/6 com 70 dias de infecção comparada à porcentagem detectada em animais BALB/c com mesmo período de infecção, havendo correlação inversa significativa de células CD11b+F4/80+CD206+ e número de bacilos aos 70 dias de infecção. Não houve diferença na análise funcional de macrófagos M1 e M2 obtidos a partir de precursores da medula óssea, comparando as duas linhagens de camundongos. Dessa forma, experimentos com o propósito de estudar a função dessas células in vivo serão conduzidos para avaliar se os macrófagos M2 participam da resposta protetora que auxilia na eliminação dos bacilos ou na resposta protetora que auxilia no reparo tecidual do hospedeiro. / Despite only 10% of individuals infected with Mycobacterium tuberculosis develop tuberculosis, this disease causes millions of deaths annually. We know that the host genetic background is associated with susceptibility/resistance to M. tuberculosis-infection. Therefore, our group has studied differences in the immunologic response between resistant C57BL/6 mice and susceptible BALB/c mice. In the present study, our aim was to evaluate populations of M1 and M2 macrophages in mice that generate different magnitude of cellular immune response in this infection. C57BL/6 mice, which elaborate a higher immune cellular response, and BALB/c mice were infected with M. tuberculosis, and evaluated 30 and 70 days post infection. We observed higher percentage of CD11b+Ly-6C+ cells, which characterize inflammatory monocytes, in the lung of BALB/c mice with 70 days of infection compared to the percentage detected in C57BL/6 animals in the same period of infection. There was a significant positive correlation between CFU number and iNOS genic expression comparing both mouse strains 30 days post infection. On the contrary to our initial hypothesis, we observed higher percentage of CD11b+F4/80+CD206+ cells, which characterize M2 macrophage phenotype, in the lung of Day 70-infected C57BL/6 animals compared with the percentage detected in BALB/c mice at the same time of infection. There was a significant inverse correlation between CD11b+F4/80+CD206+ cells and bacillus number at 70 days post infection. There was no difference in the functional analysis of M1 and M2 macrophages obtained from precursors of bone marrow, comparing both mouse strains. Therefore, experimental assays with the aim to study whether M2 macrophages contribute for the protective immune response that induce bacillus clearance or contribute to the protective immune response that promote host tissue repair will be performed in an attempt to understand better the role of these cells in the M. tuberculosis-infection.

Monócitos são células hematopoiéticas com função na imunidade inata e adquirida. De acordo com o estímulo que recebem, podem se diferenciar em macrófagos e potencializar suas funções efetoras, modulando a resposta imune e participando de vários processos fisiológicos e patológicos. Os macrófagos são muito heterogêneos e capazes de assumir diferentes fenótipos em resposta aos estímulos que recebem do microambiente. Em um ambiente gorvernado por interferon gama (IFN-γ), se diferenciam em células com aumentada capacidade de apresentação de antígenos e síntese de citocinas pró-inflamatórias (macrófagos M1). Por outro lado, quando são estimulados por interleucina-4 (IL-4), eles se diferenciam em um fenótipo antagonista com atividade de reparo (macrófagos M2). Dada a importância destas células no sistema imune, é necessário desenvolver e otimizar técnicas que sirvam de ferramentas para estudar a diferenciação de macrófagos em seus perfis fenotípicos bem como seu papel em doenças humanas. Assim, o objetivo deste estudo foi padronizar e comparar dois diferentes protocolos de isolamento de monócitos descritos na literatura e analisar seu impacto sobre a diferenciação de macrófagos. Isolamos monócitos do sangue periférico de cinco indivíduos saudáveis pelas técnicas de aderência e seleção positiva. Os monócitos foram diferenciados a macrófagos com suplementação de M-CSF. Depois da indução aos perfis M1 e M2, avaliamos marcadores de superfície celular, expressão de mRNA de citocinas, secreção de quimiocinas e fagocitose. Observamos que os métodos utilizados para isolar monócitos possuem diferentes purezas, mas que monócitos isolados por ambos métodos foram capazes de ser diferenciados a macrófagos em seus perfis M1 e M2. Análises de citometria de fluxo mostraram que há uma diminuição da expressão de CD14, principalmente em macrófagos M2, e manutenção (M2) ou aumento (m1) da expressão de HLA-DR. Monócitos (CD80-CD86high) induzidos aos fenótipo M1 são caracterizados pela regulação positiva de CD80 e regulação negativa de CD86 (CD80++CD86+). O perfil M2 foi caracterizado pela expressão de CD206high e ausência de CD163- (CD206highCD163-). A expressão do mRNA revelou que IL-1β e TNF-α foram marcadores de M1 e TGF-β e CCL18 foram marcadores de M2. Além disso, quimiocinas inflamatórias como CXCL9, CXCL10 e CCL5 foram significativamente aumentadas em macrophagos M1. Macrófagos M1 e M2 são ativos e funcionais como demonstrado no ensaio de fagocitose. Embora ambos métodos utilizados para isolar monócitos tiveram purezas diferentes, ambas técnicas forneceram monócitos capazes de serem diferenciados a macrófagos. / Monocytes are hematopoietic cells with a major role in innate and adaptative immunity. According to the stimulus they receive, they can differentiate into macrophages and enhance effector functions by modulating the immune response and participating in various physiological and pathophysiological processes. Macrophages are very heterogeneous and are able to assume different phenotypes in response to the different stimuli they receive from the microenvironment. In a proinflammatory milieu ruled by interferon gamma (IFN-γ), they differentiate into cells with increased capacity to present antigens and synthesis of proinflammatory cytokines (M1 macrophages). On the other hand, when they are stimulated with interleukin 4 (IL-4), they differentiate into an antagonist phenotype with repair activity (M2 macrophages). Given the importance of these cells in the immune system, it is necessary to develop and optimize techniques that serve as useful tools for studying the differentiation of macrophages in their different phenotypic profiles as well as their roles in human diseases. In this regard, the aim of this study was to standardize and compare two different human monocyte isolation protocols described in the literature and analyze their impact on macrophage differentiation. We isolated peripheral blood monocytes from five healthy subjects by the adherence technique and positive selection. Monocytes were differentiated into macrophages with M-CSF supplementation. After M1 or M2 induction, we evaluated cell surface markers, mRNA cytokine expression, chemokine secretion and phagocytosis. We found that the methods used to isolate monocytes have different purities, but monocytes isolated from both methods were able to differentiate into the M1 and M2 profile. The monocyte and macrophage flow cytometry analysis demonstrated that CD14 decreased expression, mainly in M2 macrophages, and maintained (M2) or increased (M1) the HLA-DR expression. Monocytes (CD80-CD86high) induced to an M1 phenotype were characterized by upregulation of CD80 and down regulation of CD86. (CD80++CD86+) The M2 profile was characterized by the expression of CD206high and absence of CD163- (CD206highCD163-). The mRNA expression revealed that IL-1β and TNF-α were M1 markers and TGF-β and CCL18 were M2 markers. Further more, inflammatory chemokines as CXCL9, CXCL10 and CCL5 were significantly increased in M1 macrophages. M1 and M2 macrophages were active and functional as shown in the phagocytic assay. Although methods used for the isolation of monocytes yielded different purities, both techniques provided monocytes able to differentiate to macrophages.

Monócitos são células hematopoiéticas com função na imunidade inata e adquirida. De acordo com o estímulo que recebem, podem se diferenciar em macrófagos e potencializar suas funções efetoras, modulando a resposta imune e participando de vários processos fisiológicos e patológicos. Os macrófagos são muito heterogêneos e capazes de assumir diferentes fenótipos em resposta aos estímulos que recebem do microambiente. Em um ambiente gorvernado por interferon gama (IFN-γ), se diferenciam em células com aumentada capacidade de apresentação de antígenos e síntese de citocinas pró-inflamatórias (macrófagos M1). Por outro lado, quando são estimulados por interleucina-4 (IL-4), eles se diferenciam em um fenótipo antagonista com atividade de reparo (macrófagos M2). Dada a importância destas células no sistema imune, é necessário desenvolver e otimizar técnicas que sirvam de ferramentas para estudar a diferenciação de macrófagos em seus perfis fenotípicos bem como seu papel em doenças humanas. Assim, o objetivo deste estudo foi padronizar e comparar dois diferentes protocolos de isolamento de monócitos descritos na literatura e analisar seu impacto sobre a diferenciação de macrófagos. Isolamos monócitos do sangue periférico de cinco indivíduos saudáveis pelas técnicas de aderência e seleção positiva. Os monócitos foram diferenciados a macrófagos com suplementação de M-CSF. Depois da indução aos perfis M1 e M2, avaliamos marcadores de superfície celular, expressão de mRNA de citocinas, secreção de quimiocinas e fagocitose. Observamos que os métodos utilizados para isolar monócitos possuem diferentes purezas, mas que monócitos isolados por ambos métodos foram capazes de ser diferenciados a macrófagos em seus perfis M1 e M2. Análises de citometria de fluxo mostraram que há uma diminuição da expressão de CD14, principalmente em macrófagos M2, e manutenção (M2) ou aumento (m1) da expressão de HLA-DR. Monócitos (CD80-CD86high) induzidos aos fenótipo M1 são caracterizados pela regulação positiva de CD80 e regulação negativa de CD86 (CD80++CD86+). O perfil M2 foi caracterizado pela expressão de CD206high e ausência de CD163- (CD206highCD163-). A expressão do mRNA revelou que IL-1β e TNF-α foram marcadores de M1 e TGF-β e CCL18 foram marcadores de M2. Além disso, quimiocinas inflamatórias como CXCL9, CXCL10 e CCL5 foram significativamente aumentadas em macrophagos M1. Macrófagos M1 e M2 são ativos e funcionais como demonstrado no ensaio de fagocitose. Embora ambos métodos utilizados para isolar monócitos tiveram purezas diferentes, ambas técnicas forneceram monócitos capazes de serem diferenciados a macrófagos. / Monocytes are hematopoietic cells with a major role in innate and adaptative immunity. According to the stimulus they receive, they can differentiate into macrophages and enhance effector functions by modulating the immune response and participating in various physiological and pathophysiological processes. Macrophages are very heterogeneous and are able to assume different phenotypes in response to the different stimuli they receive from the microenvironment. In a proinflammatory milieu ruled by interferon gamma (IFN-γ), they differentiate into cells with increased capacity to present antigens and synthesis of proinflammatory cytokines (M1 macrophages). On the other hand, when they are stimulated with interleukin 4 (IL-4), they differentiate into an antagonist phenotype with repair activity (M2 macrophages). Given the importance of these cells in the immune system, it is necessary to develop and optimize techniques that serve as useful tools for studying the differentiation of macrophages in their different phenotypic profiles as well as their roles in human diseases. In this regard, the aim of this study was to standardize and compare two different human monocyte isolation protocols described in the literature and analyze their impact on macrophage differentiation. We isolated peripheral blood monocytes from five healthy subjects by the adherence technique and positive selection. Monocytes were differentiated into macrophages with M-CSF supplementation. After M1 or M2 induction, we evaluated cell surface markers, mRNA cytokine expression, chemokine secretion and phagocytosis. We found that the methods used to isolate monocytes have different purities, but monocytes isolated from both methods were able to differentiate into the M1 and M2 profile. The monocyte and macrophage flow cytometry analysis demonstrated that CD14 decreased expression, mainly in M2 macrophages, and maintained (M2) or increased (M1) the HLA-DR expression. Monocytes (CD80-CD86high) induced to an M1 phenotype were characterized by upregulation of CD80 and down regulation of CD86. (CD80++CD86+) The M2 profile was characterized by the expression of CD206high and absence of CD163- (CD206highCD163-). The mRNA expression revealed that IL-1β and TNF-α were M1 markers and TGF-β and CCL18 were M2 markers. Further more, inflammatory chemokines as CXCL9, CXCL10 and CCL5 were significantly increased in M1 macrophages. M1 and M2 macrophages were active and functional as shown in the phagocytic assay. Although methods used for the isolation of monocytes yielded different purities, both techniques provided monocytes able to differentiate to macrophages.

Apesar de apenas 10% dos indivíduos infectados por Mycobacterium tuberculosis desenvolverem tuberculose, essa doença causa a morte de milhares de pessoas anualmente. Sabendo que o background genético do hospedeiro está relacionado com suscetibilidade/resistência à infecção por M. tuberculosis, nosso grupo vem avaliando diferenças na resposta imunológica entre camundongos C57BL/6 resistentes e BALB/c suscetíveis. No presente estudo, nós nos propusemos a avaliar populações de macrófagos M1 e M2 em animais com capacidade diferente de elaborar resposta imune celular nessa infecção. Animais C57BL/6, que elaboram resposta imune celular de maior magnitude, e BALB/c foram infectados com M. tuberculosis, e avaliados aos 30 e 70 dias de infecção. Observamos maior porcentagem de células CD11b+Ly-6C+, que caracterizam monócitos inflamatórios, no pulmão de animais BALB/c com 70 dias de infecção comparada à porcentagem detectada em animais C57BL/6 com mesmo período de infecção. Houve correlação positiva significativa entre número de bacilos e expressão gênica para iNOS aos 30 dias de infecção comparando ambas as linhagens. Ao contrário da nossa hipótese inicial, observamos maior porcentagem de células CD11b+F4/80+CD206+, que caracteriza o fenótipo de macrófagos M2, no pulmão de animais C57BL/6 com 70 dias de infecção comparada à porcentagem detectada em animais BALB/c com mesmo período de infecção, havendo correlação inversa significativa de células CD11b+F4/80+CD206+ e número de bacilos aos 70 dias de infecção. Não houve diferença na análise funcional de macrófagos M1 e M2 obtidos a partir de precursores da medula óssea, comparando as duas linhagens de camundongos. Dessa forma, experimentos com o propósito de estudar a função dessas células in vivo serão conduzidos para avaliar se os macrófagos M2 participam da resposta protetora que auxilia na eliminação dos bacilos ou na resposta protetora que auxilia no reparo tecidual do hospedeiro. / Despite only 10% of individuals infected with Mycobacterium tuberculosis develop tuberculosis, this disease causes millions of deaths annually. We know that the host genetic background is associated with susceptibility/resistance to M. tuberculosis-infection. Therefore, our group has studied differences in the immunologic response between resistant C57BL/6 mice and susceptible BALB/c mice. In the present study, our aim was to evaluate populations of M1 and M2 macrophages in mice that generate different magnitude of cellular immune response in this infection. C57BL/6 mice, which elaborate a higher immune cellular response, and BALB/c mice were infected with M. tuberculosis, and evaluated 30 and 70 days post infection. We observed higher percentage of CD11b+Ly-6C+ cells, which characterize inflammatory monocytes, in the lung of BALB/c mice with 70 days of infection compared to the percentage detected in C57BL/6 animals in the same period of infection. There was a significant positive correlation between CFU number and iNOS genic expression comparing both mouse strains 30 days post infection. On the contrary to our initial hypothesis, we observed higher percentage of CD11b+F4/80+CD206+ cells, which characterize M2 macrophage phenotype, in the lung of Day 70-infected C57BL/6 animals compared with the percentage detected in BALB/c mice at the same time of infection. There was a significant inverse correlation between CD11b+F4/80+CD206+ cells and bacillus number at 70 days post infection. There was no difference in the functional analysis of M1 and M2 macrophages obtained from precursors of bone marrow, comparing both mouse strains. Therefore, experimental assays with the aim to study whether M2 macrophages contribute for the protective immune response that induce bacillus clearance or contribute to the protective immune response that promote host tissue repair will be performed in an attempt to understand better the role of these cells in the M. tuberculosis-infection.

Monócitos são células hematopoiéticas com função na imunidade inata e adquirida. De acordo com o estímulo que recebem, podem se diferenciar em macrófagos e potencializar suas funções efetoras, modulando a resposta imune e participando de vários processos fisiológicos e patológicos. Os macrófagos são muito heterogêneos e capazes de assumir diferentes fenótipos em resposta aos estímulos que recebem do microambiente. Em um ambiente gorvernado por interferon gama (IFN-γ), se diferenciam em células com aumentada capacidade de apresentação de antígenos e síntese de citocinas pró-inflamatórias (macrófagos M1). Por outro lado, quando são estimulados por interleucina-4 (IL-4), eles se diferenciam em um fenótipo antagonista com atividade de reparo (macrófagos M2). Dada a importância destas células no sistema imune, é necessário desenvolver e otimizar técnicas que sirvam de ferramentas para estudar a diferenciação de macrófagos em seus perfis fenotípicos bem como seu papel em doenças humanas. Assim, o objetivo deste estudo foi padronizar e comparar dois diferentes protocolos de isolamento de monócitos descritos na literatura e analisar seu impacto sobre a diferenciação de macrófagos. Isolamos monócitos do sangue periférico de cinco indivíduos saudáveis pelas técnicas de aderência e seleção positiva. Os monócitos foram diferenciados a macrófagos com suplementação de M-CSF. Depois da indução aos perfis M1 e M2, avaliamos marcadores de superfície celular, expressão de mRNA de citocinas, secreção de quimiocinas e fagocitose. Observamos que os métodos utilizados para isolar monócitos possuem diferentes purezas, mas que monócitos isolados por ambos métodos foram capazes de ser diferenciados a macrófagos em seus perfis M1 e M2. Análises de citometria de fluxo mostraram que há uma diminuição da expressão de CD14, principalmente em macrófagos M2, e manutenção (M2) ou aumento (m1) da expressão de HLA-DR. Monócitos (CD80-CD86high) induzidos aos fenótipo M1 são caracterizados pela regulação positiva de CD80 e regulação negativa de CD86 (CD80++CD86+). O perfil M2 foi caracterizado pela expressão de CD206high e ausência de CD163- (CD206highCD163-). A expressão do mRNA revelou que IL-1β e TNF-α foram marcadores de M1 e TGF-β e CCL18 foram marcadores de M2. Além disso, quimiocinas inflamatórias como CXCL9, CXCL10 e CCL5 foram significativamente aumentadas em macrophagos M1. Macrófagos M1 e M2 são ativos e funcionais como demonstrado no ensaio de fagocitose. Embora ambos métodos utilizados para isolar monócitos tiveram purezas diferentes, ambas técnicas forneceram monócitos capazes de serem diferenciados a macrófagos. / Monocytes are hematopoietic cells with a major role in innate and adaptative immunity. According to the stimulus they receive, they can differentiate into macrophages and enhance effector functions by modulating the immune response and participating in various physiological and pathophysiological processes. Macrophages are very heterogeneous and are able to assume different phenotypes in response to the different stimuli they receive from the microenvironment. In a proinflammatory milieu ruled by interferon gamma (IFN-γ), they differentiate into cells with increased capacity to present antigens and synthesis of proinflammatory cytokines (M1 macrophages). On the other hand, when they are stimulated with interleukin 4 (IL-4), they differentiate into an antagonist phenotype with repair activity (M2 macrophages). Given the importance of these cells in the immune system, it is necessary to develop and optimize techniques that serve as useful tools for studying the differentiation of macrophages in their different phenotypic profiles as well as their roles in human diseases. In this regard, the aim of this study was to standardize and compare two different human monocyte isolation protocols described in the literature and analyze their impact on macrophage differentiation. We isolated peripheral blood monocytes from five healthy subjects by the adherence technique and positive selection. Monocytes were differentiated into macrophages with M-CSF supplementation. After M1 or M2 induction, we evaluated cell surface markers, mRNA cytokine expression, chemokine secretion and phagocytosis. We found that the methods used to isolate monocytes have different purities, but monocytes isolated from both methods were able to differentiate into the M1 and M2 profile. The monocyte and macrophage flow cytometry analysis demonstrated that CD14 decreased expression, mainly in M2 macrophages, and maintained (M2) or increased (M1) the HLA-DR expression. Monocytes (CD80-CD86high) induced to an M1 phenotype were characterized by upregulation of CD80 and down regulation of CD86. (CD80++CD86+) The M2 profile was characterized by the expression of CD206high and absence of CD163- (CD206highCD163-). The mRNA expression revealed that IL-1β and TNF-α were M1 markers and TGF-β and CCL18 were M2 markers. Further more, inflammatory chemokines as CXCL9, CXCL10 and CCL5 were significantly increased in M1 macrophages. M1 and M2 macrophages were active and functional as shown in the phagocytic assay. Although methods used for the isolation of monocytes yielded different purities, both techniques provided monocytes able to differentiate to macrophages.

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Submitted by Daniella Santos (daniella.santos@ufma.br) on 2017-08-29T16:11:39Z No. of bitstreams: 1 MayaraSilva.pdf: 2720807 bytes, checksum: 1a7eeabdd7df89c4b7c0690e8136cb51 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T16:11:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MayaraSilva.pdf: 2720807 bytes, checksum: 1a7eeabdd7df89c4b7c0690e8136cb51 (MD5) Previous issue date: 2017-03-28 / CNPq / CAPES / FAPEMA / There is an increasing interest to find new products with therapeutic potential to the treatment of leishmaniasis, due the high toxicity and resistance of the majority of available treatments. Our aim was to formulate, characterise and evaluate the antiLeishmania amazonensis activity of babassu loaded poly(lactic-co-glycolic acid) – PLGA microparticles. The PLGA microparticles were loaded with the aqueous extract of babassu mesocarp (MMP) and evaluated for size, zeta potential, drug content, encapsulation efficiency in comparison to unloaded microparticles (CMP). The antiLeishmania effect was evaluated to promastigotes forms or to amastigotes in Balb/c macrophage cells infected with Leishmania amazonensis. Following macrophage treatment with MMP the percent of infected cells was determined by Giemsa staining and compared with cells treated with CMP or with free babassu extract (MESO). To find the potential mechanisms of the activity of MMPs, TNF -α, IL-6, IL-10, hydrogen peroxide, arginase and accumulated nitrite in the culture supernatants of the treated and untreated cells were also measured by ELISA, and by colorimetric assays, respectivelly. The size range of the microparticles was between 3 and 6,4 μm with an average zeta potential of −25 mV and encapsulation efficiency of 45%. The antiLeishmania activity of babassu-loaded microparticles was 10-fold higher than MESO. MMP showed an overall bioavailability and hence were more effective in eliminating intracellular parasites than the other formulations. Babassu microparticles also reduced the ex vivo parasite infectivity and this effect seems to be directly related to a polarization of macrophages to the M1 phenotype with an increased production of nitric oxide, hydrogen peroxide and TNF-α. Interestingly, this overexpression of TNF-α didn’t impair cell viability, suggesting the anti-apoptotic effects of the MMP in infected macrophages. These findings indicate that babassu load microparticles may be useful for targeting for new drugs, due to the immunomodulatory effects of polarization to M1 macrophages, infected with L. amazonensis, and further provide motivations for future studies on human cels in vitro and in animal models of leishmaniasis in vivo. / A bioprospecção de produtos com potencial terapêutico no tratamento da leishmaniose tem despertado crescente interesse, pois as drogas atualmente utilizadas apresentam elevada toxicidade e, muitas vezes, os protozoários são resistentes, sobretudo nos tratamentos prolongados. Na perspectiva de desenvolver uma nova formulação com ação anti-Leishmania avaliou-se a atividade do extrato aquoso do mesocarpo de babaçu (Attalea speciosa Mart) encapsulado em micropartículas biodegradáveis de PLGA [poly(lactic-co-glycolic acid]. Inicialmente, foi realizado o estudo morfométrico e funcional das micropartículas. Em seguida foi avaliada a atividade anti-Leishmania por ação sobre as formas promastigotas, comparando os efeitos das micropartículas de PLGA carregadas com extrato do mesocarpo de babaçu (MMP) com o extrato livre (Meso) e com micropartículas sem o mesocarpo, utilizadas como controle negativo (CMP). Também avaliamos os efeitos de MMP em culturas de macrófagos peritoneais, de camundongos Balb/c, infectados ou não com formas amastigotas de Leishmania amazonensis. Os seguintes parâmetros foram investigados nos sobrenadantes das culturas de macrófagos: quantificação das citocinas IL-10, IL-6 e TNF-α por ELISA, detecção de peróxido de hidrogênio, óxido nítrico e atividade da arginase. Foi determinada a taxa de infecção e o percentual de células infectadas. O mesocarpo de babaçu apresentou forteinteração com antígenos de L. amazonensis. A caracterização das micropartículas mostrou que as MMP apresentaram diâmetro e potencial zeta compatíveis com as micropartículas controle (CMP) e a eficiencia de encapsulamento do extrato foi de 45%. As MMPs foram mais ativamente fagocitadas do que o extrato de babaçu livre, ocasionando aumento de 25% no índice fagocítico, após 24 horas de incubação. Além de baixa toxicidade para macrófagos peritoneais, o encapsulamento do mesocarpo de babaçu potenciou em quase 10 vezes a ação anti-Leishmania para as formas promastigotas de Leishmania amazonensis, quando comparado ao extrato livre. O tratamento com MMP reduziu o número de amastigotas e a taxa de infecção de macrófagos peritoneais, possivelmente por seu efeito imunomodulador na polarização de macrófagos para o fenótipo M1, resultando no aumento de TNF-α e óxido nítrico e na inibição da produção de IL-10. Concluímos que o microencapsulamento do mesocarpo de babaçu melhorou a ação anti-Leishmania do extrato, mas manteve o seu efeito imunomodulador o que contribuiu para o melhor efeito tanto sobre os protozoários como para as células infectadas, evitando a morte das células por necrose ou apoptose. Os dados em conjunto indicam que as micropartículas MMP podem ser fortes candidatas ao desenvolvimento de novos produtos, devido aos seus efeitos imunomoduladores na polarização de macrófagos infectados com L. amazonensis para um perfil M1 e, adicionalmente, estimulam novos estudos quanto ao seus efeitos sobre células humanas in vitro e em modelo animal da leishmaniose in vivo.