Das Kolonkarzinom ist eine der häufigsten Tumorerkrankungen weltweit. Etwa 50 % der Patienten entwickeln Fernmetastasen. Diese haben eine sehr schlechte Überlebensprognose. Deshalb fokussiert die Forschung auf die Identifizierung neuer, molekularer Marker für eine verbesserte Metastasierungsvorhersage. Identifizierte Hochrisiko-Patienten könnten somit rechtzeitig eine individualisierte, intensivere Therapie erhalten. MACC1 (Metastasis-associated in colon cancer 1) ist ein neu identifiziertes Gen, das in Kolonkarzinomen und deren Fernmetastasen überexprimiert wird. Die Domänenstruktur von MACC1 ist kennzeichnend für Proteine der Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalwege. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der zellulären Funktion von MACC1 und seiner Rolle in der Tumorprogression sowie die Evaluierung von MACC1 als molekularer Metastasierungsmarker. MACC1-überexprimierende Tumorzellen zeigten in Abhängigkeit von der Domänenstruktur in in vitro Assays ein erhöhtes migratorisches, invasives und proliferatives Potential. Der Einfluss von MACC1 auf die Metastasierungskapazität von Tumorzellen konnte auch im Tiermodell belegt werden. Der Hepatocyte-growth-factor (HGF) induziert die epitheliale-mesenchymale Transition MACC1-exprimierender Zellen und die nukleäre Translokation von MACC1. Die Expression des HGF-Rezeptors Met war in diesen Zellen stark erhöht. Reportergen-Studien bestätigten die transkriptionelle Regulation von Met durch MACC1. Die Analyse humaner Kolonkarzinome ergab eine signifikant höhere MACC1 Expression in Primärtumoren mit metachroner Fernmetastasierung. MACC1 ist ein neu identifizierter Regulator des HGF/Met-Signalweges und trägt somit entscheidend zur Determinierung des metastatischen Potentials von Tumorzellen bei. MACC1 hat großes Potential als neuer, prognostischer Marker für die Metastasierung des Kolonkarzinoms und ist ein Kandidatengen als Ziel effektiver, molekularer Interventionsstrategien zur Metastasierungs-Prävention. / Colon cancer is one of the most frequent malignant diseases worldwide. About 50% of the patients develop distant metastasis. These patients have only few therapy options and very poor survival rates. Therefore cancer research focuses on the identification of novel molecular markers to provide a better prognosis of the metastatic risk. Identified high-risk patients would get access to an early, individualized therapy. MACC1 (metastasis associated in colon cancer 1) is a newly identified gene that is overexpressed in colon carcinomas and their distant metastases. The MACC1 domain structure is characteristic for proteins of the receptor tyrosine kinase signalling pathways. Aim of this study was the analysis of the cellular function of MACC1, its role in tumor progression and its evaluation as a molecular, prognostic marker for metastasis. MACC1 overexpressing tumor cells revealed higher migratory, invasive, and proliferative potential in in vitro assays. The impact of MACC1 on the metastatic potential of tumors was also shown in mouse models. The hepatocyte growth factor (HGF) induced epithelial-mesenchymal-transition in MACC1 positive cells and MACC1´s nuclear translocation. Expression of the HGF receptor Met was strongly elevated in these cells. Reporter gene experiments confirmed the transcriptional regulation of Met by MACC1. Analyses in human colon carcinomas showed a significantly higher MACC1 expression in tumors that developed distant metastases. MACC1 is a newly identified regulator of the HGF/Met signalling pathway. It contributes decisively to the metastatic capacity of tumor cells. MACC1 has great potential as new prognostic marker for colon cancer metastasis and is a promising candidate as target for effective, molecular intervention strategies for metastasis prevention.

MACC1, ein Hauptregulator von Metastasen, ist an zahlreichen Kennzeichen von Krebs beteiligt, einschließlich dereguliertem Metabolismus. Dennoch ist seine Rolle im Krebsstoffwechsel unklar. In der vorliegenden Arbeit wurde eine systematische Analyse von MACC1-getriebenen metabolischen Netzwerken durchgeführt. MACC1 erhöhte die GLUT1 auf Zellmembrane, was zu einer erhöhten Glukoseanreicherung, einem erhöhten Glukosefluss und somit zu einer erhöhten Zellproliferation führte. Außerdem, reduzierte MACC1 den Glutaminfluss unabhängig von der Nährstoffverfügbarkeit. Bei Glucoseentzug erhöhte MACC1 die Pyruvataufnahme und zeigte aber die geringe Auswirkungen auf den Pyruvatfluss. In vivo, MACC1 zeigte erhöhte Aufnahme von 18F-FDG und 18F-Glutamat in Lebermetastasen. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass MACC1 mehrere Wirkungen auf den Krebs-Metabolismus zeigt, was es attraktiv macht, seine Wirkungen in Krebsmodellen weiter zu untersuchen. Metastasierung ist die Haupttodesursache bei Darmkrebs. Fünfzehn bis zwanzig Prozent der Darmkrebs Patienten im Stadium II entwickeln im Verlauf der Erkrankung Metastasen, jedoch bleiben die Kriterien der Wahrscheinlichkeit mit welcher Patienten von Chemotherapie profitieren werden ungenau. Hier wurde das Potenzial der Plasma-Metabolomik zur Vorhersage von Metachronmetastasen untersucht. Plasma metabolische Profile wurden wesentlich unterschiedlich zwischen nicht-metastasierten und metachron metastasierten Patienten gefunden. Wie Klassifikationsmodelle aus Entscheidungsbäumen und Support-Vektor-Maschinen gezeigt haben die Plasmametaboliten haben die Fähigkeit nicht-metastasierte von metachron metastasierten Darmkrebs Patienten zu unterscheiden, mit einer durschnittlichen Vorhersagegenauigkeit von 0,75 bzw. 0,82 für jede der Methoden, angemessen. Zusammen, zeigen diese Ergebnisse, dass Plasmametaboliten das Potenzial haben, Darmkrebs Patienten gemäß ihrem Metastasierungsrisiko nichtinvasiv zu stratifizieren. / MACC1, a master regulator of metastasis, is involved in most hallmarks of cancer, including deregulated metabolism. Yet, fragmentary data on its role in cancer metabolism exist. Here, a systematic analysis of MACC1-driven metabolic networks by elucidation of cell nutrient preferences, environment dependent alterations of nutrient utilization, metabolic pathway functionality and metabolic tracing using 13C-labeled metabolic substrates had been performed. MACC1 was found to enhance surface GLUT1 thus leading to increased glucose depletion, glucose flux and hence increased cell proliferation. Besides, MACC1 was found to reduce glutamine flux independent of nutrient availability. Upon glucose deprivation MACC1 was found to enhance pyruvate uptake exhibiting minor effects on pyruvate flux. In vivo, MACC1 increased uptakes of 18F-FDG and 18F-glutamate in liver metastatic lesions. Together, these findings demonstrate that MACC1 exhibits multiple effects on cancer metabolism, thus making it attractive to further study its effects in cancer models. Metastasis is the main cause of death from colorectal cancer (CRC). Fifteen to twenty percent of stage II CRC patients develop metastasis during the course of disease, however the criteria of likely benefitting patients from chemotherapy remain imprecise. Here, the potential of plasma metabolomics to predict metachronous metastasis was assessed. Plasma metabolic profiles were shown to be significantly different between non-metastasized and metachronously metastasized CRC patients. As demonstrated by supervised classifications using decision trees and support vector machines plasma metabolites have the power to distinguish non-metastasized from metachronously metastasized CRC patients giving average prediction accuracy of 0.75 and 0.82 for each of the methods, respectively. Together, these results demonstrate that plasma metabolites have the potential to non-invasively stratify CRC patients according to their metastasis risk.

Das kolorektale Karzinom (KRK) ist die zweithäufigste Krebserkrankung und die Metastasierung die häufigste Todesursache hierbei. Das neu identifizierte Gen MACC1 (metastasis associated in colon cancer 1) wurde als prognostischer Marker für die Metastasierung des KRK beschrieben. Im Zuge dieser Arbeit wurden die Exons 14-19 des Protoonkogens MET (met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor)) und die kodierenden Exons von MACC1 in kolorektalen Tumoren sequenziert. Es waren in 60 Tumoren nur zwei MET Mutationen zu finden. In 154 kolorektalen Tumoren wurden die drei MACC1 single nucleotide polymorphisms (SNPs) rs47211888, rs975263 und rs3735615 identifiziert. Diese MACC1 SNPs veränderten nicht die MACC1 Expression in Tumoren oder KRK-Zelllinien. Sie waren nicht mit klinischen Daten von Patienten, nicht mit dem Gesamtüberleben oder dem metastasenfreien Überleben aller Patienten mit KRK assoziiert. Der MACC1 SNP rs975263 war signifikant mit einem kürzeren metastasenfreien Überleben in einer kleineren Gruppe von jüngeren Kolonkarzinom Patienten in frühen Stadien assoziiert. Zudem wurden mittels Microarray Analyse Targetgene von MACC1 identifiziert. MACC1 regulierte die Expression von S100P (S100 calcium binding protein P) und SPON2 (spondin 2, extracellular matrix protein) in den Zelllinien SW480 und SW620. Eine S100P oder SPON2 Überexpression förderte die Zellproliferation, Zellmigration und Zellinvasion. Intraspenal transplantierte Zellen mit hoher S100P oder SPON2 Expression führten im Gegensatz zu Kontrollzellen in Xenograft Modellen zur Bildung von Metastasen. Des Weiteren war die S100P oder SPON2 Expression in humanen metachron metastasierenden kolorektalen Tumoren höher als in nicht metastasierenden Tumoren. Patienten mit einer hohen S100P oder SPON2 Expression in ihren Tumoren hatten ein kürzeres metastasenfreies Überleben im Vergleich zu Patienten mit niedriger Expression. S100P und SPON2 könnten somit eine wichtige Rolle in der Metastasierung spielen. / Colorectal cancer (CRC) is the second leading cause of cancer-related deaths in the Western World, mainly due to metastasis. The gene MACC1 (metastasis associated in colon cancer 1) was described as a prognostic marker for CRC metastasis. In this study, we sequenced the exons 14-19 of the protooncogene MET (met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor)) and the coding exons of MACC1 in colorectal tumors. We found two MET mutations in 60 tumors. In 154 tumors we identified the MACC1 single nucleotide polymorphisms (SNPs) rs47211888, rs975263 and rs3735615. These SNPs did neither modify the MACC1 expression in tumors nor in CRC cell lines. They were not associated with clinical parameters of the patients or with the overall survival and metastasis-free survival time of all CRC patients. Only in a subgroup, younger patients with colon cancer in early stages, the SNP rs975263 was significantly associated with a shorter metastasis-free survival time. Additionally, we identified new target genes of MACC1 by microarray analysis. MACC1 regulated the expression of S100P (S100 calcium binding protein P) and SPON2 (spondin 2, extracellular matrix protein) in the cell lines SW480 and SW620. Cell with a high S100P and SPON2 expression, intrasplenically transplanted into NOD/SCID mice, led to metastasis formation whereas transplanted control cells did not metastasize at all. The S100P and SPON2 expression was higher in colorectal tumors with metachronous metastasis than in non-metastasizing tumors. CRC patients with a high S100P or SPON2 expression in their primary tumors had a shorter metastasis-free survival time compared to patients with a low expression. Thus, S100P and SPON2 might play an important role in CRC metastasis.

MACC1 wurde als prognostischer Biomarker für die Tumorprogression und das Metastasen-freie Überleben im KRK sowie in anderen soliden Tumoren beschrieben. Das Gen induziert Zellmotilität und Proliferation in Zellkultur sowie die Metastasierung im Mausmodell. Damit stellt MACC1 ein vielversprechendes Ziel für die Intervention bei Tumorprogression und –metastasierung und damit für die Behandlung von KRK-Patienten dar. Unser Ziel war es, die Transkription von MACC1 zu inhibieren. Hierfür identifizierten wir zunächst die Promoter-Region von MACC1 und untersuchten MACC1s transkriptionelles Regulationsnetzwerk. Durch ortsgerichtete Mutagenese, Chromatin Immunopräzipitation und Electrophoretic Mobility Shift Assay ermittelten wir, dass Transkriptionsfaktoren wie Ap-1, Sp1, C/EBPs und GIPC1 an den MACC1-Promoter binden und die Transkription des MACC1-Gens kontrollieren. Darüberhinaus konnten wir durch Hochdurchsatz-Screening die bisher ersten Inhibitoren gegen MACC1 identifizieren: Rottlerin und Lovastatin. Wir zeigten, dass diese spezifisch auf den endogenen MACC1-Promoter wirken, was eine zeit- und konzentrationsabhängige Reduktion der MACC1-Expression zur Folge hatte. Beide Inhibitoren begrenzten das Expressionsniveau von Sp1 und interferierten mit der Bindung von c-Jun mit dem MACC1-Promoter, was in einer Inhibition der MACC1-Transkription resultierte. Ferner führte die tägliche Behandlung von Xenograft-Mausmodellen mit Rottlerin zu einer Inhibition der MACC1-Expression im Primärtumor und einer damit einhergehenden Begrenzung des Tumorwachstums. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal der MACC1-Promoter und seine transkriptionelle Regulation beleuchtet wurden. Die neuen Erkenntnisse wurden zur Identifizierung der ersten Inhibitoren gegen MACC1 genutzt. Zur Behandlung von KRK-Patienten mit einem hohen Risiko für MACC1-induzierte Metastasierung könnten diese Inhibitoren Potential für die klinische Anwendung beherbergen. / MACC1 has been reported as a prognostic biomarker for tumor progression and metastasis-free survival in CRC along with other solid tumors. It induces cell motility and proliferation in cell culture and metastasis in mouse models. Consequently, targeting MACC1 to intervene in tumor progression and metastasis formation holds a promising approach to treat CRC patients. We designed a strategy to inhibit MACC1 via targeting its transcription. We first identified MACC1 gene promoter by creating various promoter-luciferase constructs. We then established that transcription factors such as Ap-1, Sp1, C/EBPs and GIPC1 bind to the MACC1 promoter and govern MACC1 transcription, expression and thus motility in vitro and in CRC patients. Using a high throughput screening targeting the MACC1 promoter, we identified small molecule MACC1 inhibitors, Rottlerin and Lovastatin. These inhibitors specifically restricted endogenous MACC1 promoter leading to reduced MACC1 expression in a time- and concentration-dependent manner. In vitro functional assays demonstrated the impact of the small molecule inhibitors on retarding cell proliferation and motility. Both inhibitors restricted Sp1 levels and interfered with the binding of c-Jun to the MACC1 promoter, thereby inhibiting MACC1 transcription. The study further described the effect of Rottlerin on a CRC-xenografted mouse model. Daily treatment of xenografted mice with Rottlerin resulted in the inhibition of MACC1 expression in the primary tumor accompanied with the restricted tumor growth. To summarize, this is the first study unraveling the MACC1 promoter, its transcriptional regulation and identification of newly identified MACC1 inhibitors. In clinical settings, inhibition of MACC1 expression using these inhibitors might provide immense potential for the treatment of CRC patients who are at high risk for MACC1-induced metastasis linked to shorter survival.

Das metastasierende kolorektale Karzinom stellt eine große Herausforderung in der Krebstherapie dar. Verlässliche und effiziente Biomarker zur Prognose des Krankheitsverlaufes oder der Therapieantwort (Prädiktion) sind rar. Metastasis-associated in colon cancer 1 (MACC1) ist ein prognostischer, prädiktiver und kausaler Biomarker für verschiedene Tumorentitäten. Durch die Induzierung von Zielgenen, wie z.B. MET, beeinflusst es Signalwege wie MEK/ERK und AKT/β-catenin und fördert so Zellproliferation und -motilität sowie Tumorprogression und Metastasierung in vivo. Diese Arbeit sollte neue Strategien erforschen diese Prozesse durch die Inhibition von MACC1 auf Transkriptions- und Signaltransduktionsebene zu unterbinden. Mit zwei verschiedenen Screeningmethoden konnten wir Statine als potente transkriptionelle Inhibitoren von MACC1 als auch phosphotyrosin (pY)-abhängige Interaktionen von MACC1 mit essentiellen Signalmolekülen identifizieren: SHP2, GRB2, SHC1, PLCG1 und STAT5B. Statine verringerten MACC1-spezifische Proliferation und Koloniebildung in vitro als auch Tumor Wachstum und Metastasierung in vivo bei Dosen äquivalent der humanen Standardtherapie zur Blutlipidsenkung. Mutation der pY-Bindungsstellen reduzierte die Aktivität des MACC1-induzierten ERK Signalwegs sowie Zellmigration und -proliferation. Anhand unserer Daten orchestriert MACC1, abhängig von MET und EGFR, neue SHP2/SRC/ERK und PKA/SRC/CREB Signalkaskaden zu einem malignen Phänotyp. Gezielte Intervention restringierte die MACC1-abhängige Koloniebildung, was neue therapeutische Interventionspunkte identifiziert und eine hervorragende Basis für Untersuchungen zur Kombinationstherapie darstellt. Die weitere Erforschung der spatiotemporalen Organisation des MACC1 Signalosoms und assoziierter Signalkaskaden soll das volle therapeutische Potential von MACC1 ausschöpfen. Wir empfehlen zudem Statine in der Krebstherapie bzw. -prävention, besonders bei MACC1-stratifzierten Patienten, anzuwenden. / Metastatic colorectal cancer still represents a major challenge in therapy. Reliable and efficient biomarkers for early prognosis of disease course or treatment response (prediction) remain scarce. Metastasis-associated in colon cancer 1 (MACC1) has been established as prognostic, predictive and causal biomarker for several tumor entities. Its induction of target genes such as MET affects several signaling pathways including MEK/ERK and AKT/β-catenin. Thus, it promotes cellular proliferation and motility as well as tumor progression and metastasis formation in vivo. This study intended to explore new strategies to inhibit these processes by targeting MACC1 on transcriptional and signaling level. By two distinct screening methods, we identified statins as potent MACC1 transcriptional inhibitors as well as phosphotyrosine (pY)-dependent interactions of MACC1 with crucial signaling molecules: SHP2, GRB2, SHC1, PLCG1 and STAT5B. Statins showed MACC1-specific reduction of proliferation and colony formation in vitro as well as restriction of tumor growth and metastasis formation in vivo at doses equivalent to human standard lipid reduction therapy. Mutation of the pY-interaction sites abrogated MACC1-dependent ERK signaling as well as cell migration and proliferation. Our data further suggest that MACC1 governs SHP2/SRC/ERK and PKA/SRC/CREB axes conferring a malignant phenotype in response to MET and EGFR. Targeted intervention restricted MACC1-dependent colony formation which indicates new drug intervention points for MACC1 signaling and provides an excellent baseline for further investigations of combinatorial treatments. Additional research about the spatiotemporal organization of MACC1 signalosome formation and downstream signaling will reveal the entire potential of MACC1 as therapeutic target, whereas statins should already be considered for cancer therapy or prevention, especially in patients stratified for MACC1 expression.

Störungen der zirkadianen Uhr beeinflussen zelluläre Prozesse wie Transkription, Zellzyklus und Stoffwechsel und können Tumorentstehung fördern. Unsere Studien untersuchten die Auswirkungen solcher Störungen auf die Krebsentwicklung durch Herunterregulation oder Ausschalten von Kern-Uhrgenen wie BMAL1 (ARNTL), PER2 oder NR1D1. Wir verwendeten in vitro- und in vivo-Modellen mit Darmkrebszelllinien HCT116, SW480 und SW620. Diese Manipulationen veränderten die zirkadiane Expression von MYC, WEE1 und TP53 (wichtig für Zellzyklus und Apoptose) sowie MACC1 (verbunden mit epithelial-mesenchymaler Transition und Metastasierung). Diese Veränderungen beeinflussen Zellproliferation, Apoptose, Migration und Invasion. Das Ausschalten von NR1D1 verringerte die Zellbeweglichkeit in vitro und reduzierte die Mikrometastasenbildung in vivo, begleitet von geänderten SNAI1 und CD44-Expressionen. MACC1 wird in HCT116-Wildtypzellen zirkadian exprimiert, was nach dem Ausschalten der Kern-Uhrgene gestört war. Wir identifizierten außerdem eine MACC1-NR1D1-Protein-Interaktion, die eine neue Regulierungsachse bei der Darmkrebsprogression darstellt. Unsere Daten zeigen, dass MACC1-Modulation den zirkadianen Phänotyp und Krebsfortschritt beeinflusst. MACC1-Knockout reduzierte die BMAL1-Oszillationsperiode, während seine Überexpression den gegenteiligen Effekt hatte. Dieses Zusammenspiel unterstreicht die Komplexität der Mechanismen bei Darmkrebs und die Rolle der zirkadianen Uhr bei der Metastasierung. Unsere Ergebnisse heben die Rolle von Kern-Uhrgenen bei Krebsprozessen wie Migration und Invasion hervor und bieten Einblicke in das MACC1-zirkadiane Uhr-Zusammenspiel in Darmkrebs. Zukünftige Forschungen könnten chronotherapeutische Strategien entwickeln, um Krebsbehandlungen zu personalisieren und zu verbessern. / Disruptions of the circadian clock affect cellular processes like transcription, cell cycle, and metabolism, potentially triggering tumorigenesis. Our studies examined the effects of these disruptions on cancer by downregulating or knocking out core-clock genes BMAL1 (ARNTL), PER2, or NR1D1. For this, we used in vitro and in vivo models with colorectal cancer (CRC) cell lines HCT116, SW480, and SW620. Core-clock gene manipulations altered circadian expression of MYC, WEE1, TP53 (involved in cell cycle and apoptosis), and MACC1 (linked to epithelial-mesenchymal transition and metastasis formation), affecting proliferation, apoptosis, migration, and invasion. NR1D1 knockdown reduced cell motility in vitro and decreased micrometastasis formation in vivo, with altered SNAI1 and CD44 expression. Furthermore, we showed that MACC1 is circadian expressed in HCT116 wild-type cells, and that its rhythmic expression is disrupted after core-clock gene knockout. We also found MACC1-NR1D1 protein-protien interactions, suggesting a new regulatory axis in CRC progression. Our data show MACC1 modulation impacts the circadian clock phenotype and cancer progression. Remarkably, MACC1 knockout reduced BMAL1 promoter oscillation period, while its overexpression had the opposite effect. This interplay highlights the circadian clock complexity and its role in CRC metastasis. Our findings underscore vital roles for core-clock genes in cancer processes like migration and invasion, providing insights into MACC1-circadian clock interplay in CRC. Future research may develop chronotherapeutic strategies for more personalized and effective treatments.