ANA-buljongen är utvecklad för att kunna anrika både aeroba och anaeroba bakterier vid inkubering i aerob miljö. Odlingsbuljongen innehåller antioxidanter som skyddar anaeroberna mot reaktiva syreradikaler, vilket främjar anaerob anrikning. Syftet med arbetet var att utvärdera om ANA-buljongen kan ersätta de två befintliga odlingsbuljongerna som idag används vid anrikning av bakterier på avdelningen för klinisk mikrobiologi, Kronoberg Blekingesjukhuset. Elva bakteriearter och fyra blandfloror användes i utvärderingen av ANA-buljongen. En mikroliter (µl) inokulat som innehöll ca 100 colony forming units tillsattes till ANA-buljong samt aeroba buljongen Brain Heart Infusion (BHI) eller den anaerobbuljongen Fastidious Anaerobe Broth (FAB). Prov från buljongerna odlades ut efter två, fyra och sju dygns inkubering. Tillväxtsgrad vid olika inkubationstider jämfördes mellan ANA-buljongen och BHI-buljongen/FAB. ANA-buljongen utvärderades även för odling av kliniska prov. De kliniska proven odlades ut på agarplattor samt inokulerades till ANA-, BHI-buljong och FAB. Vid utodling från buljongerna jämfördes fynden från BHI-buljongen och FAB med fynden från ANA-buljongen. Tillväxten verkade vara snabbare i ANA-buljongen jämfört med BHI-buljong och FAB. Vissa arter, exempelvis Cutibacterium acnes, uppvisade en betydligt snabbare tillväxt i ANA-buljongen. Vissa bakteriearter tillväxte men överlevde inte längre inkubationstider och kunde efter dessa inte detekteras. Anrikningen av blandfloror i ANA-buljongen resulterade i överväxt av en art vilken konkurrerade ut de övriga arterna. Detta fenomen uppstod inte i FAB. Att ersätta de två kliniska buljongerna med ANA-buljongen hade varit fördelaktigt både praktiskt, ekonomiskt och ur ett hållbarhetsperspektiv. Eftersom ANA-buljongen enbart visade sig användbar vid odling av renkulturer men inte vid odling av blandfloror är den inte optimal för klinisk diagnostik. Men den skulle eventuellt kunna nyttjas vid ortopediska Kamme-Lindberg-odlingar då det oftast är fråga om renkulturer. / ANA-broth is developed to enrich both aerobic and anaerobic bacteria by incubation in an aerobic environment. The broth contains antioxidants that protect anaerobic bacteria from reactive oxygen species and make it possible for anaerobic bacteria to grow in an oxygenated environment. The purpose of the study was to evaluate the ANA-broth and see if the broth could replace the two broths that are being used clinically today.  Eleven bacterial species and four mixed floras were used to evaluate the ANA-broth. One microliter (µl) inoculum with about 100 colony forming units was used to inoculate ANA-broth, Brain Heart Infusion (BHI) broth and Fastidious Anaerobe Broth (FAB), respectively. Samples from the broths were then used to inoculate agar plates after two, four and seven days of incubation, to evaluate the difference in enrichment effectiveness at different incubation times in relation to the clinically used broths. The ANA-broth was also evaluated by using clinical samples from patients. The findings from the ANA-broth were compared with the findings from the BHI-broth and FAB. The growth in the ANA-broth was quicker compared to the BHI-broth and FAB. Some bacterial species grew but became non-viable in the ANA-broth after a longer period of incubation. Bacterial species within mixed floras were not able to grow in coexistence in the ANA-broth. One bacterial species took over and competed out the residual bacteria. This phenomenon did not occur in FAB. If the ANA-broth could replace the broths now used clinically then that would be advantageous both in terms of practicality, economy and from a sustainability perspective. Though, the ANA-broth is not optimal for clinical use considering that only one bacterial species within a mixed flora was able to grow. As the broth has greater potential for cultures containing only one bacterial species it could possibly be suited for orthopaedic Kamme-Lindberg cultivation.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20240号 / 医博第4199号 / 新制||医||1020(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 川口 義弥, 教授 安達 泰治, 教授 小西 靖彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Wie in anderen Zellen sind auch bei Säugerspermien spezifische Lipide und Proteine der Zellmembran aufgrund ihrer heterogenen lateralen Verteilung in speziellen Domänen angereichert, die in unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Dimensionen existieren und der Zelle funktionale Variabilität ermöglichen. Aufgrund der fehlenden aktiven Proteinbiosynthese bietet dies den Spermien eine Möglichkeit, auf unterschiedliche Anforderungen zu reagieren. In der vorliegenden Arbeit wurden daher sogenannte detergenzresistente Membrandomänen (DRMs) aus Eberspermien unterschiedlicher Reifestadien präpariert und untersucht. Dabei stieg bereits in den Dichtegradienten mit zunehmender Reife die Dichte, bei der die opaleszenten Banden auftraten. Eine Analyse dieser mittels 31P-NMR zeigte mit zunehmender Reife eine Anreicherung an Glycerophosphatidylethanolamin und Phosphatidylinositol bei den Glycerophospholipiden, der Gehalt an Sphingomyelin hingegen nahm während der Nebenhodenreifung und auch nach der Ejakulation ab. Diese Veränderungen könnten auf eine Destabilisierung von Membrandomänen hindeuten, um eine Zusammenlagerung zu größeren Domänenclustern zu erleichtern, möglicherweise in Vorbereitung auf Kapazitation und Akrosomenreaktion. Zunächst werden die destabilisierten Membrandomänen jedoch durch die Anlagerung von Seminalplasmaproteinen geschützt, was vermutlich für das verringerte Lipid- zu Proteinverhältnis der DRMs bei Ejakulatspermien sorgt. Aufgrund der generellen Kälteempfindlichkeit von Eberspermien findet ihre Lagerung üblicherweise bei 16°C statt. Dies ist aus mikrobiologischer Sicht nachteilig gegenüber einer kälteren Lagerungstemperatur. Eine Untersuchung der Spermien von 64 Ebern zeigte jedoch bei 10% der Ejakulate eine individuum-spezifische Resistenz gegenüber der Lagerung bei 4°C. Die DRMs der kälteresistenten Spermien hatten einen erhöhten Anteil an langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie 31P-NMR und MALDI-TOF MS Analysen zeigten. / The lateral distribution of lipids and proteins in the plasma membrane is heterogeneous. Therefore specific lipids and proteins in membranes of mammalian spermatozoa are enriched in special domains of varying size and different time scales enabling the cell’s membrane functional variability. Being transcriptional inactive this is especially relevant for spermatozoa in responding to multiple challenges on their way to fertilization. Therefore so called detergent resistant membrane domains (DRMs) from boar spermatozoa of different developmental stages were investigated. Already in the sucrose density gradients differences were visible, so the opalescent bands of more maturated sperm had a higher density. An analysis of these bands by 31P-NMR showed an enrichment of glycerophosphatidylethanolamine and phosphatidylinositol during maturation and a decrease of sphingomyelin during maturation in the epididymis and even after ejaculation. This suggests destabilization of DRMs and hence of putative membrane domains. This could enable clustering to bigger membrane domain platforms in preparation for capacitation and acrosome reaction. First, however, seminal fluid proteins cover the spermatozoa protecting the membrane with the destabilized membrane domains. This could have led to the detected decrease of the lipid to protein ratio in DRMs of ejaculated sperm. Boar spermatozoa are sensitive to storage at cold temperatures and are therefore usually stored at 16°C, which is especially disadvantageous with regard to growing of bacteria. A screening of sperm from 64 boars showed a ratio of 10% individuals with cold resistant sperm which could be stored at 4°C without quality loss. The DRMs of cold resistant sperm had a higher proportion of longchained, polyunsaturated fatty acids, as shown by analysis with 31P-NMR und MALDI-TOF MS.

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Im Rahmen der Untersuchung wurde bei 27 Patienten, die klinische Zeichen der Karies, aber keine pulpitischen Symptome zeigten, kariöses Dentin mit Hilfe eines sterilen Exkavators entnommen. Das durchschnittliche Alter der Patienten beträgt 41 Jahre und der Durchschnittswert des DMF-T-Index 12,5. Die Untersuchungsgruppe bestand zu 55,5 % aus männlichen Probanden sowie zu 44 % aus Rauchern. Nach Isolierung von 107 Reinkulturen aus den Patientenproben erfolgte die Identifizierung der oralen Streptokokken mittels eines mikrobiologischen Standardtests (RapidID-32Strep der Firma BioMérieux) und MALDI-TOF-MS-Analyse. Parallel wurden speziesspezifische PCRs der Dentinproben für S. sanguinis, S. constellatus, S. intermedius, S. anginosus, S. mutans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis, S. gordonii und S. parasanguinis durchgeführt. Mittels MALDI-TOF-MS-Analyse konnten insgesamt sechs verschiedene Spezies oraler Streptokokken in den Dentinproben nachgewiesen werden. Am häufigsten kamen Vertreter der Mitis-Gruppe vor (in 89 % der Dentinproben), gefolgt von S. gordonii und S. sanguinis (zu 52 % und 26 % vertreten). Die MALDI-TOF-MS-Methode erwies sich als geeignetere der mit Kultivierung verbundenen Nachweismethoden. Ihre Ergebnisse wurden durch selektive PCRs einzelner Subkulturen und DNA-Sequenzierung bestätigt. Mittels der speziesspezifischen PCRs der Dentinspäne wurden zehn verschiedene Spezies oraler Streptokokken identifiziert. Vertreter der Mutans-Gruppe wurden so zu durchschnittlich 44 %, S. salivarius zu 37 % nachgewiesen. Es zeigte sich ein signifikantes Vorkommen von S. anginosus in Proben, die ebenfalls S. mutans enthielten (p= 0,00213). Alle drei Verfahren sind zur Untersuchung klinischer Proben geeignet, wobei die MALDI-TOF-MS-Analyse die genaueste Differenzierung auf Speziesebene ermöglicht. Die Non-Mutans-Streptokokken S. oralis, S. gordonii und S. anginosus scheinen die Mikroflora von kariösem Dentin zu dominieren. Sie übertrafen in der vorliegenden Arbeit in ihrem Vorkommen S. mutans in mehr als der Hälfte der untersuchten Proben. Diese Beobachtung stützt die erweiterte ökologische Plaquehypothese.

Les bactéries du genre Agrobacterium forment un ensemble taxonomiquement diversifié composé de nombreuses espèces, présent dans la plupart des sols et des rhizosphère. Les agrobactéries sont le plus souvent anodines voire stimulatrices de la croissance des plantes. Par contre, celles qui hébergent un plasmide Ti induisent la maladie de la galle du collet à de nombreuses plantes d'intérêt agronomique. Dans ce contexte, nous avons d'une part donné l'état actuel des connaissances sur la taxonomie du genre Agrobacterium, et nous avons fait une revue des méthodes d'isolement et de typage de ces bactéries. D'autre part, nous avons cherché à mettre au point des méthodes d'identification rapides et fiables des différentes espèces d'agrobactérie. La méthode de MALDI-TOF MS a permis d'identifier les espèces mais elle n'était pas assez résolutive pour typer des souches et encore moins la présence de plasmides Ti dans les isolats. Nous avons alors développé des amorces de PCR spécifiques de 17 espèces, du genre Agrobacterium et de la famille Rhizobiaceae. Ces amorces se sont révélées efficaces pour identifier les bactéries cultivées et aussi pour détecter leur présence dans des communautés microbiennes. Nous avons utilisé ces outils pour étudier la répartition des agrobactéries à l'échelle d'un pays, d'une station et entre sols nus et sols rhizosphériques en utilisant soit des isolats soit des ADN extraits des différents environnements. Enfin, nous avons montré que le clonage-séquençage ou le séquençage à haut débit d'amplicons obtenus à partir d’ADN de communautés microbiennes nous permettaient de connaître la diversité des populations d'agrobactéries / Agrobacterium are Alphaproteobacteria common in most soils that closely interact with plants in two respects. Firstly, they are rhizospheric bacteria saprophytically living in the rhizosphere of numerous plants and they are likely beneficial to plants. Secondly, when they harbor a dispensable Ti plasmid (i.e. tumor inducing plasmid), agrobacteria are plant pathogens able to cause the crown gall disease to most dicots and gymnosperms and some monocots. An epidemiological survey of crown gall thus also requires expert determination of the Agrobacterium taxonomy. In this thesis we evaluated the usefulness of MALDI-TOF MS technique as a high throughput tool to determine and classify agrobacteria. Then we set up a recA-based PCR method to accurately and exhaustively assess agrobacterial diversity either of isolated agrobacteria or directly in various biotopes. We applied standard biochemical, recA-based and Ti plasmid-based identification methods to study the prevalence of pathogenic and non-pathogenic agrobacteria at the country and local scales. Finally, we tested whether analyzing the internal composition of recA amplicons could be a way to directly assess the micro-diversity of agrobacterial populations using cloning sequencing or pyrosequencing approaches. The later methodology was applied to establish the actual field diversity of Agrobacterium and to evaluate whether plant genotypes differentially select agrobacteria in their root systems, providing first data upon biotic factors shaping the population structure of agrobacteria

Le typage bactérien est une mesure de contrôle essentielle pour lutter contre la diffusion des bactéries multirésistantes, mais les techniques actuelles sont longues et coûteuses. L'objectif de cette thèse était d'évaluer la capacité de la technique MALDI-TOF MS à typer les 3 principales espèces bactériennes responsables d'infections nosocomiales - Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa. L'analyse par MALDI-TOF MS permet d'identifier les souches de E. coli appartenant au phylogroupe B2, souches les plus virulentes parmi les souches extra-intestinales, et au STI 31, clone très impliqué dans la dissémination des P-lactamases à spectre étendu. Chez S. aureus, cette technique reconnait les souches appartenant au CC398, impliquées dans une proportion importante d'infections graves chez des personnes fragiles. La technique MALDI-TOF MS identifie également cinq clones de P. aeruginosa à haut risque épidémique - STI 11, STI 75, ST235, ST253, ST395. Si nous avons confirmé des pics caractéristiques du phylogroupe B2 décrit également par d'autres auteurs, les pics biomarqueurs identifiant E. coli ST131 ou des clones épidémiques de S. aureus varient suivant les études. Différents paramètres peuvent influencer les résultats de typage par MALDI-TOF MS et doivent donc être standardisés. La technique MALDI-TOF MS permet d'identifier certains clones épidémiques. En gardant à l'esprit que le choix d'une méthode de typage doit être fait en fonction des objectifs mais aussi des performances des différents systèmes disponibles, la technique MALDI-TOF MS pourrait se positionner comme un outil de typage de première ligne. / Bacterial typing is crucial to tackle the spread of bacterial pathogens but current methods are time-consuming and costly. The objective of this study was to evaluate the ability of MALDI-TOF MS to type the 3 main bacterial species re.sponsible for nosocomial infections - Escherichia coti, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Analysis of MALDI-TOF mass spectra allow the identification (i) of E. coti isolates belonging to phylogroup B2, that fosters the most virulent extra-intestinal strains, and (ii) of E. coli STl 31, a clone involved in the dissemination of extended-spectrum β-lactamases. MALDI-TOF MS also recognizes S. aureus isolates belonging to CC398, a pathogen responsible for invasive infections in fragile patients and associated with a higher 30-day mortality. Furthermore the MALDI-TOF MS based typing method identifies the major high risk epidemic clones of P. aeruginosa STl 11, STl 75, ST235, ST253, and ST395. We confirmed phylogroup B2 specific peaks also described by other authors. However the identification of E. coli STl 31 or epidemic clones of S. aureus is based on biomarkers that differs between studies. Different parameters can influence the MALDI-TOF MS typing results and must therefore be standardized. MALDI-TOF-based typing methods allow the detection of epidemic pathogens. Keeping in mind that the choice of a method for routine bacterial typing should be made according to the objectives but also the performance of the different systems available, the MALDI-TOF MS technique could become a first-line typing method.