Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alguns Bastonetes Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) costumam ser considerados clinicamente pouco significantes e a sua implicação em infecções é subestimada. Devido à similaridade fenotípica, mudanças taxonômicas, baixa reatividade bioquímica e limitações nos bancos de dados em sistemas comerciais, a identificação de BGNNF é frequentemente equivocada, culminando com a denominação de diferentes micro-organismos apenas como BGNNF, por falta de melhor diferenciação. O objetivo desse estudo foi avaliar, por métodos fenotípico convencional, proteômico e molecular, a identificação de BGNNF incomuns isolados em hemoculturas de pacientes atendidos em um hospital universitário no Rio de Janeiro. Foram selecionadas 78 amostras isoladas de hemoculturas caracterizadas no laboratório clinico como BGNNF para a identificação por sequenciamento dos genes 16S RNA e recA, por um conjunto amplo de testes fenotípicos manuais e por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos predominantes na amostragem foram genotipados pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, a maioria das amostras (n=31; 40%) foi incluída no gênero Burkholderia, seguido de Pseudomonas stutzeri (10%) e Delftia acidovorans (4%). Os demais isolados foram agrupados em 27 diferentes espécies. O sequencimento do gene recA identificou a maioria das espécies de Burkholderia como Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Os testes fenotípicos incluíram as 31 amostras apenas no CBc e para as outras 47 amostras, a concordância com o sequenciamento do gene 16S rRNA em nível de espécie foi de 64% (n=30) e apenas em gênero a concordância foi de 17% (n=8). A análise comparativa geral da identificação por MALDI-TOF MS com o sequenciamento do gene16S rRNA mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram concordantes em nível de espécie e 45% (n=35) apenas em gênero. Excluindo as amostras do CBc, houve um aumento da concordância em nível de espécie para 60%. As discordâncias parecem ser devido às diferenças nos perfis proteicos das amostras em relação às amostras-referência do banco de dados do equipamento e podem ser aprimorados com a atualização de perfis no sistema. A análise do polimorfismo genético de B. contaminans mostrou a ausência de um clone disseminado causando surto, além da provável origem ambiental das infecções. Os setores de nefrologia e hemodiálise contribuíram com maior número de pacientes com amostras positivas (5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em pacientes assistidos no mesmo setor com diferença de quatro meses (BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodilálise), entre as culturas, respectivamente. As discordâncias entre as técnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de identificação das espécies do CBc. Os BGNNF incomuns são de difícil caracterização independente da metodologia usada e nenhum método por si só foi capaz de identificar todas as amostras. / Some nonfermenting Gram-negative Bacilli (NFGNB) are considered of low clinical significance, and their implication in infections is usually underestimated. Due to their phenotypic similarities, frequent taxonomic changes and low biochemical reactivity, as well as to limitations of bacterial identification commercial system databases, these NFGNB are frequently misidentified and are collectively referred to as NFGNB group, in the lack of a better differentiation. The aim of the present study was to evaluate the performance of the conventional phenotypic method, the proteomic matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectometry method (MALDI-TOF MS) and of molecular methods (16S RNA and recA gene sequencing) in the identification of 78 unusual NFGNB isolated from blood cultures of pacients treated at an university hospital in Rio de Janeiro. Clonality of the predominant species identified within these isolates was determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). By the 16S rRNA gene sequence analysis, most strains (n = 31; 40%) were included in the Burkholderia spp. followed by Pseudomonas stutzeri (n = 8; 10%), Delftia acidovorans (n = 3; 4%) and Stenotrophomonas maltophilia (n = 3; 4%). The remaining bacterial isolates were included in 27 different species. By the recA gene sequencing technique, most bacteria from the Burkholderia cepacia complex (BCC), samples were classified as Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Phenotypic tests provided accurate identification of all 31 isolates included in the BCC by the 16S rRNA gene sequence analysis. For the other 47 samples, agreement of the results obtained with these two techniques in species and genus level identifications occurred in 30 (63,8%) and 17 samples (36,2%), respectively. The results obtained by the MALDI-TOF MS and 16S rRNA gene sequencing methods agreed at species and genus levels in 33 (42%) and 35 isolates (45%), respectively. When bacteria from the BCC were excluded from the analysis, the agreement between the two techniques at species level increased to 60%. Misidentification by the MALDI-TOF MS method may be due to differences in protein spectra between the samples and the reference strains in the equipment database. PFGE analysis of B. contaminans isolates revealed the absence of a disseminate clone causing an outbreak, and the probable environmental source of infections. The nefrology ang dialisis sectors contributed to the greatest number of patients with positive cultures (5 pacients and 9 isolates). Clones BcoD and BcoE were found in blood cultures of pacientes treated in a same sector with differences of 4 months (BcoD, nefrology) and 1.5 year (BcoE, dialisis). The misidentifications occurred mainly due to the hard differentiation of BCC species. Unusual NFGNB are of difficult characterization whatever the methodology used and no method alone was able to identify all the isolates.

En Afrique, les fièvres récurrentes causées par différentes espèces bactériennes du genre Borrelia sont des infections négligées transmises par les arthropodes et sont responsables de manifestations cliniques variant d’une septicémie mortelle à des formes plus bénignes et d'autres manifestations cliniques, en particulier d'avortement chez les femmes enceintes. Quatre espèces différentes de Borrelia, initialement séparées les unes des autres sur la base de leur répartition géographique et de leur vecteur, sont actuellement cultivées de prélèvements cliniques et de vecteurs : Borrelia crocidurae, Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis et Borrelia hispanica. Ces différentes espèces circulent sur le continent africain en parallèle avec au moins six espèces non encore cultivées et détectées dans des vecteurs. Notre travail est une contribution à l’investigation des fièvres récurrentes à Borrelia en Afrique. Dans cette perspective, nous avons mis au point la détection rapide en spectrométrie de masse MALDI-TOF des Borrelia dans les tiques en créant au préalable une base de données Borrelia MALDI-TOF-MS. La base de données de Borrelia et un logiciel de soustraction IHU ont été utilisés pour détecter B. crocidurae dans 20 tiques Ornithodoros sonrai, y compris huit tiques qui ont été testées positives pour B. crocidurae par PCR-séquençage, ce qui ouvre la voie à l'utilisation du MALDI-TOF-MS pour la double identification des vecteurs et des agents pathogènes vectorisés, dont il s’agissait du premier exemple maintenant étendu à d’autres modèles dans notre laboratoire. / In Africa, relapsing fever borreliae are neglected arthropod-borne pathogens causing mild to deadly septicemia and other clinical manifestations, particularly abortion in pregnant women. Four different species of Borrelia, initially distinguished one from another on the basis of geography and vector, are currently cultured causative agents in Africa: Borrelia crocidurae, Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis et Borrelia hispanica. These different species are circulating in parallel to at least six not-yet cultured species in vectors. Our work consisted in the investigation of recurrent fevers borreliosis in Africa. We have developed rapid detection in MALDI-TOF mass spectrometry of Borrelia in ticks by creating a prior a Borrelia MALDI-TOF-MS database. The Borrelia database and a custom software program that subtracts the uninfected O. sonrai profile were used to detect B. crocidurae in 20 O. sonrai ticks, including eight ticks that tested positive for B. crocidurae by PCR-sequencing; which paves the way for the use of MALDI-TOF-MS for the dual identification of vectors and vectorized pathogens. We have also illustrates a non-specialized circulation of B. crocidurae borreliae within a collection of 35 O. sonrai ticks in West Africa. These ticks were genotyped by 16S rRNA mitochondrial gene sequencing while B. crocidurae was genotyped by Multispacer Sequence Typing (MST). The 35 ticks were grouped into 12 genotypes strong geographic structuring and 35 B. crocidurae into 29 genotypes without strict geographic structure. One O. sonrai genotype carried several B. crocidurae genotypes and one B. crocidurae genotype was found in different O. sonrai genotypes.

Der zeitnahe und möglichst sichere Nachweis bakterieller Krankheitserreger und deren Empfindlichkeit gegenüber verfügbaren antibakteriell wirksamen Chemotherapeutika (Antibiotika) stellt einen Hauptaufgabenbereich der medizinischen mikrobiologischen Routinediagnostik dar. Hierzu wurden im Laufe der Jahre unterschiedliche Methoden entwickelt, womit von der genauen Beschreibung der Kolonie- und mikroskopischen Morphologie, Anfärbbarkeit und Formation über die Charakterisierung der biochemischen Leistungsfähigkeit bis hin zur genauen Sequenzierung des gesamten Genoms ein enormer Fortschritt zu verzeichnen war. Seit Mitte der 1990er Jahre etablierte sich die Massenspektrometrie als phänotypisches Nachweisverfahren und gewann zunehmend an Bedeutung. Ebenso konnten Erfolge beim Nachweis Antibiotika resistenter Bakterien verzeichnet werden. Um das Potential dieser noch jungen Nachweismethode weiter zu erforschen, wurden in dieser Arbeit Spezies der Familie Enterobacteriaceae und der Nonfermenter in eine eigene massenspektrometrische Datenbank aufgenommen, um diese als Grundlage zur Validierung des Identifizierungspotentials der Methode mittels Blindstudie zu nutzen. Im selben Arbeitsschritt wurde der Versuch unternommen, Antibiotika resistente Stämme im Zuge der Speziesidentifizierung zu detektieren, um so Aussagen über eine mögliche Einschränkung der therapeutischen Möglichkeiten und gegebenenfalls notwendigen Hygienemaßnahmen treffen zu können.

Under senare år har en särskilt hög resistensutveckling observerats hos gramnegativa bakterier inom familjen Enterobacteriaceae. Den främsta resistensmekanismen utgör produktion av så kallade "extended-spectrum β-lactamases" (ESBL) och särskilt oroväckande är karbapenemaser (ESBLCARBA) som har förmåga att bryta ner ett flertal olika grupper av β-laktamantibiotika. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) har utforskats som metod för snabb detektion av karbapenemasaktivitet genom analys av nedbrytning av antibiotika. Syftet med denna studie var att utvärdera om MALDI-TOF MS kan användas som metod för att detektera enzymatisk nedbrytning av Ceftolozan/Tazobaktam samt att undersöka vilka enzymer som uppvisar nedbrytning av antibiotikan. Sju karbapenemasproducerande isolat och en β-laktamasnegativ kontrollstam användes i studien. Isolaten inkuberades 120 min respektive 270 min med antibiotika (1mg/ml) i en buffertlösning (0,08% ammoniumbikarbonat, pH 8). Efter centrifugering analyserades supernatanten med MALDI-TOF MS. Nedbrytning av Ceftolozan detekterades hos samtliga karbapenemasproducerande stammar, utom hos E. coli med NDM-1 produktion. Nedbrytningstoppar av Tazobaktam detekterades emellertid enbart hos stammar med OXA-48 och NDM-7 produktion. Tydligast nedbrytning sågs efter 120 min. För tydligare visualisering av nedbrytningstoppar bör metoden dock optimeras med avseende på matrix, buffert och antibiotikakoncentration. / In recent years, an alarming increase of antibiotic resistance has been observed in Gram-negative bacteria, classified in the family Enterobacteriaceae. The main resistance mechanism is the production of extended-spectrum β-lactamases (ESBL). Particularly worrisome is the production of carbapenemases (ESBLCARBA) due to their ability to hydrolyze a broad range of β-lactams. Recently, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) has been investigated as a method for rapid detection of carbapenemase activity through observation of antibiotic degradation. The aim of this study was to investigate whether MALDI-TOF MS can be used as a method to detect degradation of Ceftolozane/Tazobactam as well as to examine which enzymes that possess the ability to hydrolyze the antibiotic. A total of seven carbapenemase-producing strains were used in the study. The experiment also included a β-lactamase-negative isolate as a negative control. The strains were incubated with antibiotic (1mg/ml) in a buffered solution (0,08% ammonium bicarbonate, pH 8) for 120 min and 270 min. The supernatant, after centrifugation, was analyzed by MALDI-TOF MS. All the carbapenemase-producing strains demonstrated hydrolysis of Ceftolozane, except for NDM-1 producing E. coli. However, mass peaks corresponding to the degradation of Tazobactam were only detected in strains producing OXA-48 and NDM-7. The degradation of Ceftolozane/Tazobactam was most apparent after 120 minutes. However, to better enable detection of mass peaks, further optimization is needed in regard to appropriate matrix, buffer and antibiotic concentration.

Bei der Zellkultivierung wird dem artifiziell hergestellten Grundmedium meist tierisches Serum hinzugefügt, um ein adäquates Wachstum der Zellen zu gewährleisten. So liefert das Serum zusätzliche Nährstoffe, essenzielle Wachstumsfaktoren und eine Vielzahl weiterer Moleküle. Die Seren werden kommerziell aus tierischem Vollblut hergestellt und normalerweise vor ihrer Auslieferung auf bestimmte Parameter, wie zum Beispiel Aminosäure-Gehalt und Albumin-Konzentration, getestet. Trotz dieser Testung seitens der vertreibenden Unternehmen bestehen große Qualitätsunterschiede bei den Zellkulturanwendungen. Somit sind Forschungslabore häufig gezwungen Probeseren anzufordern und diese in eigenen zeitaufwendigen und kostenintensiven Zellkulturversuchen zu testen, bevor ein Serum ausgewählt und in den eigentlichen Versuchen eingesetzt werden kann. Auch die serumvertreibenden Unternehmen müssen demzufolge alle Serumchargen bis zum Abschluss der Testversuche in ausreichenden Mengen bereithalten, was einen bedeutenden Mehraufwand darstellt. Aus diesen Gründen wäre es eine entscheidende Vereinfachung, wenn ein geeigneter Biomarker zur Testung der Serumtauglichkeit gefunden werden könnte, der diese aufwendigen Vorversuche ersetzt. Ein potenzieller Biomarker könnte das Glycerophospholipid Lysophosphatidylcholin (LPC) sein. Seine stressbedingte Bildung, vorrangig aus Phosphatidylcholin (PC), im Rahmen von Entzündungen, oxidativem Stress oder ungünstigen Lagerungsbedingungen könnte als Indikator für qualitätsmindernde Prozesse im Serum dienen. Des Weiteren könnte das vermehrte LPC selbst einen entscheidenden Einfluss auf das Wachstum von Zellen haben und somit die Qualität der Seren widerspiegeln. Die Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) eignet sich aufgrund ihrer Robustheit gegenüber Verunreinigungen und der hohen Messgeschwindigkeit für die Detektion beider Moleküle in biologischen Materialen. Zur weiteren Vereinfachung der Bestimmung der LPC-Konzentration mittels MALDI-TOF MS wird oft auf den Zusatz eines internen Standards verzichtet, um zusätzliche Fehlerquellen zu vermeiden. Hierbei wird LPC ausschließlich relativ zur PC-Konzentration ermittelt (PC/LPC-Verhältnis). Da es sich bei Serum um eine komplexe, biologische Probe handelt, könnten Molekülinteraktionen wie beispielsweise Protein-Lipid-Interaktionen Grund für unterschiedliche PC/LPC-Verhältnisse sein. Albumin als ubiquitär im Serum vorhandenes Protein kann eine Vielzahl von Molekülen binden, darunter auch bestimmte Lysophospholipide. Somit ist es wichtig zu klären, inwieweit Albumin eine adäquate Detektion von Lysophosphatidylcholin verhindern beziehungsweise beeinflussen kann. Die hier publizierte Arbeit konnte zeigen, dass Albumin-Zusatz (von Pferd und Rind) zu einem Anstieg des detektierten PC/LPC-Verhältnisses im „intakten“ Serum führt. Umgekehrt sinkt das PC/LPC-Verhältnis beim enzymatischen Verdau des Albumins wieder, weil nun mehr LPC detektiert werden kann. Der Einfluss von Pepsin und Trypsin, die durch den enzymatischen Verdau des Albumins zu einer verbesserten LPC-Detektion führen, wurde unter verschiedenen Bedingungen (Konzentration, Inkubationszeit, Temperatur) verglichen. Abschließend wurde ein verbessertes Protokoll für die MALDI-TOF MS-Messungen des PC/LPC-Verhältnisses im „intakten“ Serum durch einen vorausgehenden Pepsin-Verdau vorgeschlagen. Dabei muss vor allem darauf geachtet werden, möglichst niedrige Temperaturen zu verwenden, um die temperaturbedingte Konversion von PC zu LPC zu minimieren. Sowohl das ursprüngliche als auch das erweiterte Messprotokoll fand im zweiten Teil der Arbeit Anwendung. Hier wurde die aufwendige konventionelle Qualitätstestung von Pferdeseren mittels Zellkultur mit der massenspektrometrischen Messung von LPC als Biomarker verglichen, um eine etwaige Vereinfachung der Serumselektion zu evaluieren. Die verwendeten FDCPmix-Zellen sind murine hämatopoetische Vorläuferzellen, die beispielsweise zur Untersuchung der hämatopoetischen Stammzellnische verwendet werden. Ähnlich wie die hämatopoetischen Stammzellen selbst, stellen die FDCPmix-Zellen hohe Anforderungen an die Zellkulturbedingungen. Wird inadäquates Medium bzw. Serum verwendet, können Wachstum und Differenzierungspotential negativ beeinflusst werden, wodurch die Zellen nicht mehr für weitere Versuche geeignet sind. Folglich ist die achtsame Auswahl des Pferdeserums essenziell. Acht Pferdeseren von verschiedenen Anbietern wurden zur Kultivierung nach derzeitigem Goldstandard eingesetzt. Als Evaluationsparameter für die Qualität des jeweiligen Serums wurden Zellwachstum, Differenzierungspotenzial nach Kultivierung und die Fähigkeit Zellkolonien im semifesten Medium (colony forming units - CFUs) zu bilden, verwendet. Hierbei zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Seren. Insbesondere in der Fähigkeit CFUs auszubilden und im Wachstum waren die größten Unterschiede zu erkennen. Diese Zellkultur-Ergebnisse wurden mit MALDI-TOF MS-Messungen des PC/LPC-Verhältnisses vor und nach Pepsinverdau im „intakten“ Serum verglichen. Jedoch korrelierte das PC/LPC-Verhältnis nicht mit den Ergebnissen der Zellkulturexperimente. Dies ist mit den Unterschieden in der PC-Konzentration zwischen den verschiedenen Seren zu erklären. Enthält ein Serum generell viel PC, so kann trotz eines hohen PC/LPC-Verhältnisses die LPC-Konzentration im Serum zu hoch sein und die Zellkultivierung negativ beeinflussen. Deshalb wurde LPC mit Hilfe eines internen Standards quantifiziert. Bei den für die Kultivierung ungeeigneten Seren lag, sowohl vor als auch nach Proteinverdau, eine hohe LPC-Konzentration vor. Umgekehrt konnten die Pferdeseren mit geringen LPC-Konzentrationen mit günstigen Zellkultur-Ergebnissen assoziiert werden. Dieser negative Einfluss einer hohen LPC-Konzentration konnte durch die artifizielle Zugabe von LPC zur Zellkultur weiter bestätigt werden. Im Gegensatz zum nicht manipulierten Kontrollmedium zeigten die Proben mit artifiziell erhöhter LPC-Konzentration vor allem eine deutlich geringere Fähigkeit CFUs auszubilden, welches ein Kernkriterium für die Verwendbarkeit des Serums ist. Insgesamt konnte folglich der negative Einfluss von LPC auf die Zellkultur gezeigt werden, was seine Eignung als Indikator für die Serumqualität bestätigt. Zusätzlich zur LPC-Konzentration wurden weitere Mediator- und Signalmoleküle untersucht, die im Zuge des PC/LPC-Stoffwechsels entstehen können und unter anderem Entzündungsprozesse beeinflussen. Bei der Konversion von PC zu LPC durch die Phospholipase A2 oder durch oxidativen Stress wird die Fettsäure (z.B. Arachidonsäure oder Linolsäure) an der sn-2-Position vom Glycerolrückgrat freigesetzt und steht zur weiteren Metabolisierung durch beispielsweise Cyclooxygenasen oder Lipoxygenasen zur Verfügung. Hierbei können Eikosanoide wie Thromboxane, Prostaglandine oder Leukotriene entstehen. Daher wurden die Pferdeseren weiterhin auf Eikosanoide mittels Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS getestet. Hierbei zeigte sich, dass erhöhte Thromboxan B1-, Thromboxan B2- und 12-S-Hydroxy-Heptadecatriensäure-Konzentrationen ebenfalls auf eine ungünstige Serumqualität hinweisen. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Seren mit hohen LPC-Konzentrationen und daher schlechten Zellkultur-Ergebnissen ebenfalls hohe Konzentrationen an Linolsäure aufweisen. Diese Fettsäure wird typischerweise bei der Konversion von im Pferdeserum vorkommenden PC zu LPC aus der sn-2-Position freigesetzt. Somit scheint neben der LPC-Konzentration auch das Eikosanoidprofil qualitative Aussagen über das jeweilige Pferdeserum zu erlauben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl niedrige absolute LPC- als auch niedrige entzündungsfördernde Eikosanoid-Level mit einer günstigen Serumqualität korrelieren. Jedoch benötigt die Bestimmung des Eikosanoidprofils im Gegensatz zur LPC-Bestimmung anspruchsvollere Messmethoden wie LC-MS/MS. Die LPC-Konzentration kann mittels MALDI-TOF MS zuverlässig ermittelt werden. Diese robuste, schnelle und preiswerte Methode ermöglicht die direkte Messung im „intakten“ Serum. Dabei ist die Zugabe eines internen Standards zur Bestimmung der absoluten LPC-Konzentration notwendig, da sich das PC/LPC-Verhältnis als ungeeignet für die Qualitätsevaluation von Zellkulturseren erwiesen hat.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Allgemeine Einleitung 1.2 Factor dependent cells Paterson mixed potential (FDCPmix-Zelllinie) 1.3 Phosphatidylcholin und Lysophosphatidylcholin 1.4 Eikosanoide 1.5 Massenspektrometrie 1.5.1 MALDI-TOF Massenspektrometrie 1.5.2 ESI-IT Massenspektrometrie 1.6 Ziele der Dissertation 2 Publikationsmanuskripte 2.1 Determination of the Phosphatidylcholine/Lysophosphatidylcholine Ratio in Intact Serum by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry with Prior Enzymatic Albumin Digestion 2.2 Phospholipase A2 products predict the hematopoietic support capacity of horse serum 3 Zusammenfassung der Arbeit 4 Literaturverzeichnis 5 Nachweis über Anteile der Co-Autoren 6 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 7 Lebenslauf 8 Publikationen 9 Danksagung

Introduktion: Sepsis är utan behandling ett livshotande tillstånd, en korrekt behandling behöver en snabb och tillförlitlig artidentifiering. Olika prepareringsmetoder av positiva blododlingar inför direkt identifiering med MALDI-TOF finns. MBT Sepsityper® IVD Kit är en CE-märkt metod. För att följa IVDR-direktivet behöver Sepsityper jämföras med den nuvarande in-house-metoden. Dessa två metoder jämfördes utifrån förmåga att ge ett tillförlitligt, snabbt resultat där även den praktiska metoden samt ekonomiska aspekten undersöktes Material och metod: Alla positiva blododlingar som undersöktes preparerades med in- house-metoden och Sepsityper innan analys med MALDI-TOF MS. Med in-house-metoden användes saponin för att lysera de humana cellerna medans Sepsityper använde lyseringsbuffert. Resultatets tillförlitlighet presenteras som scorevärde där >2 är tillförlitligt till speciesnivå, 1,7–1,99 till genusnivå och <1,7 är ej tillförlitligt. Resultat: 135 positiva blododlingar undersöktes där in-house-metoden gav 115 med ett scorevärde över 1,7 medans Sepsityper® gav 100 prover med ett scorevärde över 1,7. Bland dessa prover var det 62 gramnegativa bakterier och 53 grampositiva. Slutsats: En skillnad mellan antalet identifieringar med scorevärde över 1,7 sågs men var ej signifikant enligt CHI2 test där antalet var högre för house metoden. Den data som samlats ger ej inte tillräckligt med stöd för att inte avvika från IVDR och fortsätta med in-house- metoden. / Background: Sepsis without treatment is a life-threatening condition, a rapid as well as reliable identification of the bacteria is needed. Different preparation methods of positive blood cultures for rapid identification are available. MBT Sepsityper® IVD Kit is one of them and is a CE-marked method. To comply with the IVDR directive, Sepsityper® needs to be tested and compared with the current in-house method. These two methods were compared based on the ability to provide fast and reliable results. Material and method: All the positive blood samples that were examined were prepared by the two methods then analysed with MALDI-TOF MS. The in-house-method used saponin to lyse the blood cells, Sepsityper used a lysisbuffert. How reliable the results are presented as score value, >2 means that the result is reliable to species identification, between 1.7-1.99 to genus identification and <1.7 is not reliable. Results: 135 positive blood cultures were examined and the in-house-method gave 115 with a score value above 1.7 while Sepsityper® gave 100 bottles a score value over 1.7. Among the bottles there were 62 gram-negative bacteria and 53 gram-positive bacteria. Conclusion: A difference between the number of identifications with a score value above 1.7 were seen where the number was higher for the in-house method, but the difference was not significant according to the Chi2 test. The data collected do not provide sufficient support for not following IVDR and not switch to Sepsityper®.

Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) är en viktig metod för artidentifiering av mikroorganismer på kliniska mikrobiologiska laboratorier. Enligt rekommendationer från Bruker Daltonics skall matrixapplicering ske relativt omedelbart efter att mikroorganismer har applicerats. Syftet med studien var att utvärdera effekter på artidentifiering vid förlängda tidsintervall mellan applicering av mikroorganismer och matrix med MALDI-TOF MS. Målet var att optimera arbetsflödet på mikrobiologilaboratoriet, laboratoriemedicin, Region Jönköping län (RJL). I studien undersöktes hur identifieringen av mikroorganismer påverkades av applicering avbakterie- och jästsvampstammar (n = 267) och α-Cyano-4-hydroxycinnaminsyra (HCCA)-matrix på en MALDI-provplatta vid varierande tidsintervall upp till tre timmar. Analys med MALDI-TOF MS genomfördes med masspektrometrarna MALDI Biotyper Sirius IVD System och Bruker MicroFlex LT. Resultaten visade att förlängda tidsintervall mellan applicering av mikroorganismer och matrix upp till tre timmar inte hade någon signifikant effekt på scorevärden vid artidentifiering, vilket innebar att tidsintervallen är acceptabla för artidentifiering med MALDI-TOF MS. Detta ger värdefull information för att optimera arbetsflödet och öka effektiviteten på mikrobiologilaboratoriet. / Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is an important method for species level identification in clinical microbiology laboratories. According to recommendations from Bruker Daltonics matrix application should occur relatively immediately after microorganisms have been applied. The aim of the study was to evaluate the effects on microbial identification at extended time intervals between microbial and matrix application using MALDI-TOF MS. The objective was to optimize the workflow at the microbiology laboratory, laboratory medicine, Region Jönköping län (RJL). The study investigated the impact on identification of microorganisms between the application of bacterial and yeast strains (n = 267) and α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matrix on a MALDI target plate of various time intervals up to three hours. MALDI-TOF MS was performed using MALDI Biotyper Sirius IVD System and Bruker MicroFlex LT mass spectrometers.The results showed that a delay of matrix application up to three hours had no significant effect on score values, indicating that time did not affect the accuracy of microbial identification using MALDI-TOF MS. Consequently, the study provided valuable information for optimizing the workflow and increasing the efficiency of the microbiology laboratory.

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This diploma thesis is focused on species identification of sand flies belonging to two genera of the subfamily Phlebotominae, genus Phlebotomus and Sergentomyia. Genus Phlebotomus together with the genus Lutzomyia of New World include the only proven vectors of Leishmania parasites and they are also carriers of viral and bacterial infections. Species of the genus Sergentomyia are proven vectors of sister genus Sauroleishmania that infects reptiles, but for several decades there have been speculations about their possible involvement in the transmission of mammalian Leishmania species. These suspicions arise mainly from repeated findings of mammalian Leishmania parasites in their digestive system. Correct species determination of medically significant hematophagous arthropods is very important especially for purposes of epidemiological studies so that efficient vector control may be correctly set. Routine identification of sand flies is based on morphological characters located mainly on their heads and genitalia. However, these characters may be variable within a species, they require certain expertise and in the field samples they may be damaged, making proper species identification impossible. This thesis therefore presents two alternatives of sand fly identification based on molecular...

Pioneering work performed by Rosalind Franklin over half a century ago provided the first structural models of two distinct carbon types: those that become graphitic during carbonization at high temperatures, and those that do not. Moreover it is known that certain properties of carbonaceous materials including combustion, surface area, electrical resistivity, and catalytic properties are influenced by mineral impurities. The nature of this division in biocarbon structure and the known effects of minerals on carbon properties have led to this work; three principal topics were addressed; (1) the investigation of the solid state structure of biocarbons derived from various biomass feedstocks, (2) the removal of inorganic minerals from biomass, and (3) the investigation of biocarbon electronic structure subsequent to doping with select inorganic minerals. Charcoals and carbonized charcoals (i.e. biocarbons) were prepared from a wide variety of biomass substrates, including pure sugars containing 5- and 6-membered rings with furanose and pyranose configurations, lignin, agricultural residues (corncob and nut shells) and a hard wood. These biocarbons were subject to proximate and elemental analysis, gas sorption analysis, and analysis by ICP-MS, SEM, XRD, ESR, 13C CPMAS NMR, and MALDI-TOF MS. All the carbonized charcoals contained oxygen heteroatoms, had high surface areas, and were excellent conductors of electricity. Doping the biocarbon with boron or phosphorus resulted in a slight improvement in its electrical conductivity. The XRD analysis indicated that the carbonized charcoals possess an aromaticity of about 71% that results from graphite crystallites with an average size of about 20 . The NMR analysis confirmed the highly aromatic content of the carbonized charcoals. The ESR signals indicated two major types of carbon-centered organic radicals. A number of techniques employed highlighted differences between carbonized charcoals and synthetic graphite but none more so than MALDI-TOF spectrometry. The biocarbons contained readily desorbed discrete ions with m/z values of 701, 685, 465, 453, 429, and 317. All of the above findings were used to develop a model for the structure of carbonized charcoal that is consistent with the biocarbon's oxygen content, microporosity and surface area, electrical conductivity, radical content, and its MALDI-TOF spectra. The removal of inorganic mineral constituents from various biomass feedstocks was achieved via simple washing/soaking techniques using two different aqueous media; deionized water and citric acid. The most effective and consistent demineralization treatment for removing minerals from biomass involved a hot 0.1 molL-1 citric acid percolation treatment, ca. 67% of inorganic mineral matter was removed. Mineral matter at the levels present in typical biomass derived charcoals and carbons had no significant influence upon the surface area or the electrical resistivity in carbonaceous materials after high heat treatment (950 C).