Grâce aux avancées de la recherche de ces dix dernières années, qui ont permis l'implémentation de plus en plus de fonctions au sein d'un système microfluidique, les " laboratoires sur puce " connaissent un essor important notamment dans le domaine de la santé. Les premiers dispositifs voient le jour dans le domaine commercial, mais un verrou important reste d'identifier des éléments circulants en faible concentration dans le sang par exemple. Les techniques de séparation simples, efficaces et modulables sont la clef de cette problématique. Nous présentons dans ce travail une voie originale de séparation magnétique grâce à des bobines planaires en cuivre combinées à un système microfluidique 3D permettant une séparation verticale efficace. L'étude consiste en la conception, la modélisation, la réalisation et le test de dispositifs appliqués à des solutions tests constituées de billes magnétiques dans un premier temps, puis de composés biologiques de culture. La réalisation des laboratoires sur puce a été faite par des procédés de photolithographie et grâce à une technologie originale de laminage de film sec. De par sa très bonne robustesse, dans le temps et face aux solvants, ainsi que sa biocompatibilité, la SU-8 est un candidat de choix pour la réalisation de ces LOC. Cette technologie nous a permis de réaliser des dispositifs tout-polymère tridimensionnels et intégrant des fonctions actives dont l'actionnement magnétique. La microélectronique a depuis longtemps permis de miniaturiser tous les éléments électroniques courants tels les capteurs et les bobines. Il est alors très intéressant de voir comment nous pouvons les intégrer dans un dispositif microfluidique pour créer des fonctions plus complexes. Nous avons pu ainsi démontrer une séparation continue de monocyte THP1 de culture avec une efficacité de 82% et des voies d'amélioration prometteuses validées avec des billes magnétiques.

Infection is a leading cause of death in hemodialysis patients, partly due to dysfunctional immunity. Frequent dialysis therapy improves patient outcomes and quality of life. We hypothesize that extended home hemodialysis (EHHD) also improves immune function compared to conventional in-hospital hemodialysis (CHD); therefore, we designed a prospective matching-cohort clinical study to assess serum inflammatory markers and the functional capacity of monocyte-derived dendritic cells (MDDCs) and T-lymphocytes. Serum CRP was decreased in EHHD patients suggesting that extended dialysis may decrease inflammatory solute/cytokine levels. Compared to controls, MDDCs from hemodialysis patients had similar endocytic capacity, expression of co-stimulatory molecules, and T-cell activation capacity. However, CHD was associated with the highest expression of CD83 and CD40. Activated T-cells in CHD patients also produced significantly more immunosuppressive IL-10 compared to EHHD patients and controls. Therefore, EHHD may improve immune function by decreasing inflammation, MDDC pre-activation, and synthesis of immunosuppressive cytokines.

Autoantikörper gegen Proteinase 3 (cANCA) stellen einen hochsensitiven und spezifischen Seromarker für das Krankheitsbild der Wegenersche Granulomatose dar. Während die Ätiologie dieser systemischen Vaskulitis unbekannt ist, weisen zahlreiche klinische und experimentelle Daten darauf hin, daß cANCA an der Entstehung und Chronifizierung dieser Erkrankung beteiligt sind. Insbesondere die Konsequenzen einer cANCA-Ligation an Proteinase 3 (PR3)-exprimierende Neutrophile wurden intensiv untersucht und man geht davon aus, daß Anti-PR3-Antikörper über die Aktivierung inflammatorischer, neutrophiler Zellfunktionen die Vaskulitis fördern. Über die Auswirkungen von cANCA auf Monozyten, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Immunantwort spielen und weitere Zielzellen dieser Antikörper darstellen, ist hingegen bisher wenig bekannt. Aktivierte Monozyten sind nicht nur ein wesentlicher Bestandteil der Granulome, sondern sind auch entscheidend an den vaskulären Entzündungsinfiltraten beteiligt. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Effekte von cANCA auf inflammatorische Zellfunktionen PR3-exprimierender Monozyten zu charakterisieren. Dabei war insbesondere ihr Einfluß auf die transendotheliale Migration und die Sekretion proinflammatorischer Mediatoren von Interesse. Die Isolation humaner Monozyten erfolgte mittels Gegenstromzentrifugation. Die monozytäre Transmigration wurde in mit humanen Endothelzellen bewachsenen Filtereinsätzen untersucht und mittels eines chemotaktischen Gradienten und/oder TNF-Stimulation der Endothelzellen gefördert. Die transendotheliale Migration von mit murinen, monoklonalen Anti-PR3-Antikörpern vorinkubierten Monozyten war, unabhängig vom Aktivierungszustand der Endothelzellen, deutlich vermindert. Dieser Effekt konnte sowohl durch vier von fünf cANCA-IgG-Fraktionen von Patienten mit aktiver WG als auch durch F(ab´)2-Fragmente der Autoantikörper reproduziert werden. Da bekannt ist, daß cANCA die proteolytische Aktivität von PR3 inhibieren und membrangebundenen Formen der leukozytären Serinproteasen PR3, humaner leukozytärer Elastase (HLE) und Cathepsin G (CathG) eine Rolle bei der Extravasion von Leukozyten zugesprochen wird, wurde daraufhin überprüft, ob PR3 für die monozytäre Transmigration von Bedeutung ist. Der physiologische Inhibitor dieser Serinproteasen, 1-Antitrypsin, und ein synthetischer Inhibitor von PR3 und HLE, CE-2072, verminderten die Anzahl migrierender Monozyten in gleichem Maße wie der vollständige Anti-PR3-Antikörper bzw. dessen F(ab´)2-Fragmente. Dahingegen hatte SLPI, ein Serpin, das lediglich CathG und HLE inhibiert, keinen Effekt auf die Anzahl migrierender Zellen. Dabei waren die Effekte von Anti-PR3-Antikörpern und 1-Antitrypsin nicht additiv, wodurch die Annahme, daß die Anti-PR3-mediierte Reduktion der monozytären Transmigration auf einer funktionellen Inhibition von PR3 beruht, untermauert wird. Die Reduktion der monozytären Transmigration ging nicht mit einer modifizierten endothelialen Adhäsion der Monozyten einher, wie unter dynamischen und statischen Bedingungen gezeigt werden konnte. Weder die rollende noch die feste Adhäsion der Monozyten wurde durch Anti-PR3-Antikörper oder Serinproteaseinhibitoren beeinträchtigt. Auch die durchflußzytometrisch quantifizierte Expression monozytärer ß1- und ß2-Integrine wurde durch die Autoantikörper nicht beeinflußt. Diese Ergebnisse zeigen erstmals, daß PR3 an der transendothelialen Migration, nicht aber der Adhäsion von Monozyten teilhat. Ein weiteres, wesentliches Ergebnis der vorliegenden Studie ist die, im Vergleich zu entsprechenden IgG-Kontrollen, massive Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren aus Monozyten in Gegenwart muriner Anti-PR3-Antikörper bzw. humaner cANCA, die mittels ELISA ermittelt wurde. Die Sekretion war zeitabhängig, wobei die Sekretion von TNF- und IL-1ß der von Thromboxan A2, IL-6 und IL-8 vorausging. Im Gegensatz zu den Auswirkungen von cANCA auf die monozytäre Transmigration, konnten diese Effekte nicht durch die alleinige Ligation des Antikörpers an das Antigen PR3 reproduziert werden, sondern waren von einer simultanen Ligation der Autoantikörper an PR3 und FcR auf der monozytären Oberfläche abhängig. Eine cANCA-mediierte Retention adhärenter Monozyten im Gefäßbett bei gleichzeitiger Aktivierung der monozytären Freisetzung inflammatorischer Zytokine und Prostanoide durch cANCA, könnte nicht nur die Entstehung der extra- und perivaskulären, granulomatösen Entzündung, sondern auch die Aufrechterhaltung der nekrotisierenden Vaskulitis fördern. Insgesamt weisen die Ergebnisse dieser Studie erstmals auf eine funktionelle Rolle von PR3 bei der transendothelialen Migration von Monozyten hin. Außerdem liefern sie weitere wesentliche Hinweise darauf, wie die Interaktion von cANCA mit Monozyten an der Pathogenese der Wegenerschen Granulomatose beteiligt sein könnten.

Abstract Osteoclasts are multinuclear bone degrading cells differentiated from monocytes which can be isolated from bone marrow and peripheral blood. Complex signaling between osteoclast precursors and other bone cells, such as mesenchymal stromal cells (MSC) occurs during the differentiation. Gap junctional communication (GJC) is one of the mechanisms in the cell fusion. GJC can be modulated with several substances such as the specific GJC stimulators, antiarrhythmic peptides (AAP). Due to their promising clinical value in the treatment of cardiac disorders, the effects of AAPs in cardiac tissue are studied extensively. This study was conducted in order to investigate the roles of GJC and AAPs in bone cell cultures. Further, the contribution of the MSCs on the effects of AAPs was studied along with comparison of two types of osteoclastogenesis cultures with differing quantities of MSCs. GJC in osteoclastogenesis was studied with both GJC inhibitors and stimulators in mouse monocyte line RAW 264.7 cells and primary cultures with bone marrow hematopoietic cells. The following studies were made with human monocytes from peripheral blood and bone marrow where the effects of AAP10 were investigated in normal and acidic environments. In addition, comparison of osteoclastogenesis from bone marrow and peripheral blood monocytes was carried out in in vitro cell cultures on bovine or human bone slices. The cells were analyzed with regard to multinuclearity, bone resorption and the expression of several osteoclast markers. The results show that GJC is utilized in osteoclastogenesis, but it is not indispensable. GJC in monocytes can be stimulated with the AAPs during osteoclastogenesis, but the effects depend on the culture conditions as well as on the presence of MSCs in the culture. The AAPs can also activate the MSCs leading to indirect regulation of osteoclastogenesis, as the MSCs produce several molecules affecting the differentiation. Further, monocytes from peripheral blood showed increased potential for osteoclastogenic differentiation compared to bone marrow derived monocytes. This can be explained by the presence of the osteoclastogenesis-controlling MSCs in the bone marrow culture, while the peripheral blood cultures contain only few of these cells and thus lack their regulatory effects. / Tiivistelmä Osteoklastit ovat monitumaisia luuta hajottavia soluja, jotka ovat erilaistuneet monosyyteistä. Monosyyttejä voidaan eristää luuytimestä tai perifeerisestä verestä. Erilaistumisen aikana osteoklastien esiastesolujen sekä muiden luusolujen, kuten mesenkymaalisten stroomasolujen (MSC) välillä tapahtuu monimutkaista signalointia. Aukkoliitoskommunikointi (GJC) on eräs solufuusiossa tapahtuvista mekanismeista. GJC:tä voidaan muunnella useilla aineilla, esimerkiksi spesifisillä stimulaattoreilla, antiarytmisillä peptideillä (AAP). AAP-yhdisteiden vaikutuksia on tutkittu laajalti sydänkudoksessa johtuen niiden lupaavista kliinisistä ominaisuuksista sydänperäisten oireiden hoidossa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää GJC:n ja AAP-yhdisteiden roolia luusoluviljelmissä. Lisäksi tutkittiin MSC-solujen osallistumista AAP-yhdisteiden vaikutuksiin sekä vertailtiin kahta erilaista osteoklastogeneesiviljelmää, joissa oli eri määrä MSC-soluja. GJC:tä osteoklastogeneesissä tutkittiin sekä sitä estävillä että stimuloivilla yhdisteillä hiiren monosyyttilinjan RAW 264.7 -soluissa sekä luuytimen hematopoieettisten solujen primääriviljelmissä. Seuraavat tutkimukset tehtiin ihmisen luuytimen ja perifeerisen veren monosyyteillä, ja niissä selvitettiin AAP10-yhdisteen vaikutuksia fysiologisissa sekä happamissa olosuhteissa. Lisäksi vertailtiin luuytimen ja perifeerisen veren monosyyttien osteoklastogeneesiä. In vitro -soluviljelmät tehtiin naudan tai ihmisen luulastujen päällä, ja soluista analysoitiin monitumaisuus, luun resorptio sekä useiden osteoklastimarkkereiden ilmentyminen. Tulokset osoittavat, että GJC:tä hyödynnetään osteoklastogeneesissä, mutta se ei ole korvaamaton mekanismi. GJC:tä voidaan stimuloida AAP-yhdisteillä osteoklastogeneesin aikana, mutta vaikutukset riippuvat viljelyolosuhteista sekä MSC-solujen läsnäolosta. AAP-yhdisteet voivat aktivoida myös MSC-soluja johtaen osteoklastogeneesin epäsuoraan säätelyyn, kun MSC-solut tuottavat useita erilaistumiseen vaikuttavia molekyylejä. Lisäksi perifeerisen veren monosyyteillä havaittiin korkeampi osteoklastogeeninen erilaistumispotentiaali verrattuna luuytimen monosyytteihin. Tulokset voidaan selittää osteoklastogeneesiä säätelevien MSC-solujen läsnäololla luuydinviljelmissä, kun taas perifeerisen veren monosyyttiviljelmissä näitä soluja on vain vähän, jolloin myös niiden säätelyominaisuudet puuttuvat.

Submitted by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2014-08-01T12:58:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Izabela.pdf: 1302143 bytes, checksum: ab457123bfc94643d499a3062e8b2cc2 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-01T12:58:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Izabela.pdf: 1302143 bytes, checksum: ab457123bfc94643d499a3062e8b2cc2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O teste de detecção de pirogênio é preconizado nas farmacopeias como teste de segurança imprescindível para a avaliação da qualidade de produtos injetáveis. Os métodos alternativos ao teste de pirogênio em coelhos são o Teste de Lisado de Amebócitos de Limulus (LAL) e o Teste de Ativação de Monócitos (MAT). Esses métodos ainda não podem substituir o teste em coelhos por completo, pois no caso do LAL os resultados podem não ser confiáveis quando a análise é realizada na presença de algumas substâncias interferentes com alto teor de lipídios e proteínas (encontrados nos medicamentos biológicos) e glucanas, além disso, o teste só detecta endotoxinas. Em relação ao MAT, já que o teste é sensível para todos os tipos de pirogênios e tem o mesmo mecanismo biológico responsável pela reação de febre em humanos, o Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) recomendou sua utilização desde que fique demonstrada a equivalência de seus resultados ao teste em coelhos, em conformidade com a regulamentação aplicável. Verifica-se assim, que a literatura carece de dados que envolvam a comparação entre a dose limite que causa febre em coelhos e a correspondência para o MAT relacionado ao ácido lipoteicóico (ALT), sendo assim, esse estudo tem como objetivo principal avaliar a utilização do MAT na detecção da contaminação de ALT de S. aureus em Cloreto de Sódio 0,9 % apirogênico artificialmente contaminado, através do estabelecimento de curva dose-resposta de ALT em coelhos; curva concentração-resposta de ALT para o MAT e avaliação em paralelo dos resultados obtidos utilizando ALT no teste em coelhos, LAL cromogênico e MAT. A resposta de febre foi observada a partir de 75.000 ng de ALT/Kg nos coelhos e no MAT para sangue criopreservado/IL-1β foi estabelecida em 50.000 ng/mL de ALT, ou 5,41 UEE/mL. O teste de LAL apresentou resultado falso-reativo a partir de 10.000 ng/mL de ALT. Os resultados apresentados neste estudo fornecem informações importantes sobre a comparação entre o teste de pirogênio em coelhos, MAT e LAL, contribuindo com dados para a validação do MAT, envolvendo outros pirogênios que não a endotoxina, e também para a aceitação deste teste pelos órgãos regulatórios no Brasil visando uma possível substituição do uso de animais, garantindo, assim, a segurança da saúde da população. / The pyrogenic test is preconized in the Pharmacopeias as a safety test indispensable for the quality of evaluation of injectable products. The alternative methods to the rabbit pyrogen test are the Limulus Amebocite Lysate (LAL) Test and the Monocyte Activation Test (MAT). These methods cannot replace the rabbit test completely yet, for in the case of LAL the results may not be reliable when the analysis is carried out in the presence of some interfering substances with high content of lipids and proteins (found in biological medicines) and glucans, moreover, the test only detects endotoxins. Concerning the MAT, since the test is sensitive to all types of pyrogens and has the same biological mechanism responsible for the fever reaction in humans, the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (Comitê de Coordenação Interagências sobre Validação de Métodos Alternativos - ICCVAM) have recommended its utilization provided that the equivalence of its results from the rabbit test, in conformity with the applicable regulation. It can be verified, then, that the literature lacks the data which involves the comparison between the limit dose that causes fever in rabbits and the consequence for the MAT related to the lipoteichoic acid (LTA), that being so, the aim of this study is mainly the utilization of MAT in the detection of the contamination of LTA of S. aureus in apyrogenic 0.9 % Sodium Chloride artificially contaminated, through the establishment of the dose-response curve of LTA in rabbits; concentration-response curve of LTA for the MAT and parallel evaluation of the results obtained by utilizing LTA in the test in rabbits, chromogenic LAL and MAT. The fever response was observed from 75.000 ng of LTA/Kg in rabbits and in MAT and for cryopreserved blood/IL-1β was established in 50.000 ng/mL of LTA, or 5,41 UEE/mL. The LAL test presented a false-positive result from 10.000 ng/mL of ALT. The results presented in this study provide important information on the comparison between the rabbit pyrogen test, MAT and LAL, contributing with data to the evaluation of MAT, involving pyrogens other than endotoxin, and also to the acceptance of this test by the regulatory organs in Brazil aiming at a possible animal substitution, and guaranteeing, then, the health security of the population.

Les monocytes classiques (cMo) sont des phagocytes mononucléés circulant dans le sang et capables de migrer vers les tissus enflammés pour s’y différencier en monocytes inflammatoires, cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDC), macrophages (MoM) ou cellules myéloïdes suppressives. Selon le contexte physiopathologique, les cellules dérivées de cMo peuvent être bénéfiques ou néfastes. Dans l’infection par le cytomégalovirus murin (MCMV) leur rôle est controversé. Les divergences apparentes dans la littérature pourraient s’expliquer par l’utilisation de souches distinctes de souris ou de virus, l’étude d’organes différents, et la confusion existante sur l’identité et la plasticité de différents sous-types de cellules dérivées de cMo. Par des analyses transcriptionnelles, morphologiques et fonctionnelles, mon travail de thèse montre que, dans la rate de souris infectées par MCMV, les cMo se différencient simultanément en monocytes inflammatoires, MoDC et MoM. Cette différenciation est abrogée lorsque les cMo sont incapables de répondre aux interférons de type I (IFN-I), massivement produits dans les infections virales, qui boostent l’immunité intrinsèque antivirale et promeuvent l’activation des cellules immunitaires innées et adaptatives. La déplétion des cMo compromet le contrôle de l’infection et les réponses des cellules Natural Killer et des lymphocytes T CD8+. Mon travail montre que, dans les souris infectées par MCMV, les cMo se différencient, de manière dépendante de l’IFN-I, en trois sous-types cellulaires distincts qui contribuent à la fois au contrôle de la réplication virale et à la promotion de réponses immunitaires innées et adaptatives protectrices. / Classical monocytes (cMo) are mononuclear phagocytes mainly localized in the blood at steady state. Upon inflammation cMo migrate into inflamed tissues where they can differentiate in inflammatory monocytes, monocyte-derived dendritic cells (MoDC), monocyte-derived macrophages (MoM) or myeloid derived suppressor cells (MDSC). Depending on the physiopathological context, cMo-derived cells can be beneficial or detrimental. There are major discrepancies between published reports on the role of cMo during MCMV infection. This may be due to the use of distinct strains of mice or of virus, to the study of different organs, or to the confusion existing in the field regarding the identity and the plasticity of the different types of cMo-derived cells. During my PhD, by combining gene expression profiling, morphological, phenotypical and functional studies, I have shown that splenic cMo in MCMV-infected mice encompass cells that had simultaneously differentiated in vivo into either inflammatory monocytes, MoDC or MoM. This cMo differentiation is abrogated in the absence of responsiveness to type I interferons (IFN-I), which are highly produced during viral infections and boosting cell-intrinsic anti-viral immunity as well as promoting the activation of innate and adaptive immune responses. cMo depletion compromises the control of MCMV replication and the antiviral responses of Natural Killer cells and CD8+ T lymphocytes. My PhD work demonstrates that, in MCMV-infected mice, cMo differentiate, via an IFN-I-dependent pathway, into three distinct cell subtypes that are involved both in the control of MCMV replication and in the induction of protective innate and adaptive immunity.

(EN) Reduced microbial stimulation of an immature neonatal immune system can lead to a poor balance adjustment of immune responses, thus contributing to the development of allergic diseases, whose incidence continues to rise. One of the promising precautionary measures seems to be an early preventive administration of probiotic bacteria to pregnant or nursing mothers, or to newborns. Previous works have described a beneficial effect of Escherichia coli O83:K24:H31 (E. coli O83) in the prevention of allergic diseases. In order to contribute to the clarification of E. coli O83 effects on the neonatal immune system, its immune- modulating properties were tested in vitro on umbilical cord blood cells. The ability of E. coli O83 to support the maturation of in vitro-derived dendritic cells from cord blood precursors (moDCs) of the children of healthy (children with a relatively low risk of allergy) and allergic (children at a relatively high risk of developing allergies) mothers was tracked by flow cytometry, qPCR and ELISA. Probiotic bacteria-stimulated moDCs were subsequently cultured with autologous naive CD4+ T lymphocytes and immune response polarization was also characterised by flow cytometry, qPCR, and ELISA. It was evident from the results that E. coli O83 promoted moDCs maturation. The presence of...

Infection is a leading cause of death in hemodialysis patients, partly due to dysfunctional immunity. Frequent dialysis therapy improves patient outcomes and quality of life. We hypothesize that extended home hemodialysis (EHHD) also improves immune function compared to conventional in-hospital hemodialysis (CHD); therefore, we designed a prospective matching-cohort clinical study to assess serum inflammatory markers and the functional capacity of monocyte-derived dendritic cells (MDDCs) and T-lymphocytes. Serum CRP was decreased in EHHD patients suggesting that extended dialysis may decrease inflammatory solute/cytokine levels. Compared to controls, MDDCs from hemodialysis patients had similar endocytic capacity, expression of co-stimulatory molecules, and T-cell activation capacity. However, CHD was associated with the highest expression of CD83 and CD40. Activated T-cells in CHD patients also produced significantly more immunosuppressive IL-10 compared to EHHD patients and controls. Therefore, EHHD may improve immune function by decreasing inflammation, MDDC pre-activation, and synthesis of immunosuppressive cytokines.

La maladie de Crohn (Crohn’s disease; CD) et la colite ulcéreuse (Ulcerative colitis ;CU) représentent deux formes distinctes de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), qui sont associées à une réponse immunitaire aberrante des tissus intestinaux à la flore intestinale. Les phagocytes mononucléés (MNPs) qui dialoguent, via les cytokines qu'ils produisent, avec les cellules immunitaires innées et adaptatives sont impliqués dans l’induction, la perpétuation et le maintien de la réponse inflammatoire des MICI. Chez la souris, les MNPs sont stratifiées en cellules dendritiques conventionnelles (cDCs), macrophages (M) et cellules dérivées de monocytes, une entité qui regroupe dans le tissu des cellules dendritiques dérivées de monocytes (Mo-DC), des M dérivés de monocytes et des « monocyte-like ». Toutefois, la diversité phénotypique, moléculaire et fonctionnelle des monocytes et des MNPs ainsi que la plasticité des monocytes restent à élucider dans les MICI. Les anticorps bloquant les cytokines IL12 et IL23 contrôlent la pathogénicité et la plasticité des cellules Th17, réduisant l'inflammation intestinale chez les patients atteints de MII. Cependant, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. L’étude approfondie de la plasticité des cellules T et du site tissulaire où elle pourrait se produire ne sont toujours pas clarifiés. Dans le premier chapitre, nous avons révélé l’existence de deux sous-populations distinctes de CD14+MNPs dans le colon de patients atteints de CU. Les cellules de type « inflammatory monocyte-like » CD14+CD163-CD64+ (P3) à l’opposé des CD14+CD163+CD64+ M (P4) s'accumulent dans le côlon inflammatoire. Nos résultats ont de plus établi un lien entre les P3 MNPs, l’IL12, l’IL1β et la détection de cellules Th17 mémoires produisant de l'IFN et de l'IL8, qui contribueraient collectivement à la pathogenèse de la CU. De plus, deux sous-populations CD14+ MNPs similaires sur le plan fonctionnel et moléculaire a ceux trouvés en CU, ont été détectées dans le côlon de patients atteints de CD. En revanche, dans le deuxième chapitre, nous fournissons des évidences que la sous-population monocytaire Slan+ pourrait contribuer à l’immunopathogenèse de la CD, mais pas à celle de la CU. La fréquence, le phénotype et la fonction des cellules Slan+ ont été examinés dans le sang, les ganglions mésentériques (MLN) et le côlon de patients atteints de MICI. Nous proposons que les cellules pro-inflammatoires CD14hiCD172α+Slan+ discriminent les tissus de CD et CU. En effet, elles ne s'accumulent que dans les MLNs et la muqueuse colique des patients atteints de CD. Dans le troisième chapitre, nous avons montré que les MLNs de CD et de CU, qui sont des tissus difficiles d'accès pour leur étude fonctionnelle en recherche, peuvent également être distingués par la distribution et le profil moléculaire des cellules T mémoire effectrices CXCR3-CCR6+ (Th17TEM). Nos données suggèrent également que la plasticité de Th17 se produit dans les MLNs avant leur migration vers l'intestin. Cette étude pourrait avoir des implications pour améliorer notre compréhension de la maladie. Enfin, il a été démontré qu’à l’homéostasie chez la souris, les monocytes sont continuellement recrutés dans la muqueuse intestinale où ils se différencient progressivement en M anti-inflammatoires. Ce processus de maturation est interrompu dans le contexte d'une inflammation. Les signaux environnementaux qui régulent la « cascade » de maturation d’un monocyte classique tissulaire demeurent inconnus chez l'homme. Dans le quatrième chapitre, nous avons récapitulé in vitro la cascade de différenciation des monocytes humains de «CD163- P3-like» en «CD163+P4-like» et avons montré leurs similitudes moléculaires avec les CD14+ MNP tissulaires. La manipulation de cette voie de différentiation pourrait ouvrir des pistes thérapeutiques pour restaurer l'homéostasie intestinale dans les MICI. En conclusion, une meilleure compréhension des sous-populations de MNPs, leurs fonction et plasticité dans la pathogenèse des MICI aidera à identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et contribuera à augmenter les connaissances pour la mise au point de traitements personnalisés. / Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC), the two forms of inflammatory bowel diseases (IBD), are associated with dysregulated immune response in the intestinal tissue. It is mediated by mononuclear phagocytes (MNPs) that dialogue via the cytokine they produce with innate and adaptive immune cells. In mice, MNPs are stratified into conventional dendritic cells (DCs), macrophages (M) and monocyte-derived cells that regroup tissue monocyte-derived DCs, monocyte-derived M and monocytes-like cells. However, the phenotypic, molecular and functional diversity of MNPs and their plasticity remain to be elucidated in IBD patients. Therapies in IBD employ antibodies that block IL12 and IL23, thus control Th17 pathogenicity and plasticity and decrease intestinal inflammation. However, no cure exist nowadays for the treatment of IBD. In-depth study of T cell plasticity and the tissue where it occurs remain to be investigated. In the first chapter, we revealed the existence of two distinct CD14+ MNP subsets in colon of UC patients. Only, CD163-CD64+ inflammatory monocyte-like cells (P3) but not anti-inflammatory CD163+CD64+ M (P4) accumulate in inflamed UC colon. Our findings further established a link between monocyte-like CD14hiCD172α+ CD163- MNPs, IL12, IL1β and the detection of colonic memory Th17 cells that produce IFN and IL8, which might all contribute to UC pathogenesis. Two CD14+ MNP subsets, resembling their counterparts in UC mucosa at the functional and molecular level, were also detected in CD colon. In contrast, in the second chapter, we provide evidence that Slan+ monocyte subset may contribute to CD but not UC immunopathogenesis. Frequency, phenotype, and function of Slan+ cells were examined in blood, colon, and mesenteric lymph nodes (MLN) of patients with IBD. We showed that pro-inflammatory CD14hiCD172α+Slan+ cells are a distinguishing feature between CD and UC, as they only accumulate in MLNs and colonic mucosa of CD patients. In the third chapter, we showed that MLNs of CD and UC, tissues that were hard to access for research use, can also be distinguished by frequencies of CXCR3−CCR6+ Th17 effector memory T cells (TEM) and their molecular profile. Our data further suggested that Th17 plasticity is taking place in MLN, before T cell homing to gut tissues. This investigation has clear implications in furthering our understanding of the disease. Finally, it has been demonstrated that monocytes are continuously recruited into murine gut mucosa and progressively differentiate into macrophages under homeostatic conditions, a maturation process interrupted in the context of inflammation. However, the environmental cues that regulate tissue inflammatory monocyte “waterfall” remain to be investigated in humans. In the fourth chapter we recapitulated in vitro human monocyte differentiation cascade, from CD163- inflammatory monocyte-like cells (P3) towards anti-inflammatory CD163+ macrophages (P4) and showed their molecular similarities to tissue CD14+ MNPs. Manipulating this pathway might open therapeutic avenues to restore tissue homeostasis. In conclusion, a better understanding of MNP subsets, function and plasticity in IBD pathogenesis would help identify novel therapeutic targets and shed light for the development of personalized treatments.

Depuis sa découverte en 1983, la recherche sur le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) a connu un essor exemplaire, permettant la mise en place de tests de dépistage sensibles et de traitements antirétroviraux (TARs) efficaces. Malgré ces traitements qui contrôlent la réplication virale à des niveaux plasmatiques indétectables, l’éradication du VIH n’est pas atteinte. L’ADN intégré du VIH persiste dans des sous-populations cellulaires et la réplication virale reprend après l’arrêt du traitement. Alors que la persistance des réservoirs du VIH dans les lymphocytes T CD4+ est bien documentée, la contribution des cellules myéloïdes n’est pas bien définie. De plus, les TAR ne bloquent pas la transcription du VIH, permettant ainsi une réplication virale résiduelle dans certains tissus tels que la muqueuse intestinale. Cette réplication résiduelle est une source d‘activation immunitaire chronique et une barrière contre la guérison. La survie des lymphocytes T CD4+ mémoires portant les réservoirs du VIH est dépendante, en partie, de l’interaction avec les cellules dendritiques (DCs), dans le cadre du processus de présentation antigénique. L’identification des signaux fournis par les DCs et menant à la réactivation transcriptionnelle des réservoirs du VIH reste un axe de recherche prioritaire afin d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Mes études doctorales ont eu pour but de comprendre la contribution directe et indirecte des cellules myéloïdes à la persistance du VIH-1 sous TAR. Dans la première partie de mon doctorat, je me suis intéressée à la contribution directe de différentes sous-population myéloïdes à la persistance des réservoirs du VIH sous TAR dans le sang et le colon des personnes vivant avec le VIH (PLWH). Nous avons démontré que la présence des réservoirs du VIH dans ces cellules myéloïdes était un évènement rare. En parallèle, j’ai réalisé des travaux dans un modèle de souris humanisées pour explorer l’existence et la contribution des cellules myéloïdes d’origine embryonnaire de longue durée de vie et capables d’autorenouvèlement à la persistance des réservoirs viraux sous TAR. Nous avons démontré que, contrairement aux lymphocytes T CD4+, les cellules myéloïdes résidant dans le foie et les poumons portent de l’ADN viral intégré avant, mais pas après la TAR, ce qui est un indicateur de leur faible contribution à la persistance du VIH sous TAR. Dans la deuxième partie de mon doctorat, je me suis intéressée à la contribution indirecte des cellules myéloïdes, et en particulier celle des DCs dérivées des monocytes (MDDCs) classiques CD16- versus intermédiaires/non-classiques CD16+. Nous avons démontré que les MDDCs CD16+ se distinguent des MDDC CD16- par l’activité élevée de leur enzyme RALDH métabolisant la vitamine A en acide rétinoïque et leur capacité supérieure à transmettre le VIH aux lymphocytes T CD4+ spécifiques/réactives au Staphylococcus aureus (S. aureus). De plus, nous avons démontré que les MDDC RALDH+ contribuent à l'établissement et à la réactivation des réservoirs du VIH dans les cellules T spécifiques à certains pathogènes non-VIH, tels que S. aureus, via un mécanisme dépendant de la production de l’acide rétinoïque par les MDDC en réponse à des ligands du recepteur de type Toll (TLR) 2. Ensemble, mes études doctorales démontrent que, bien que les cellules myéloïdes contribuent rarement de façon directe à la persistance des réservoirs du VIH, leur rôle indirect est important dans ce processus via l’interaction avec les lymphocytes T CD4+. De plus, les résultats que j’ai générés élargissent les connaissances sur la spécificité antigénique des lymphocytes T CD4+ mémoires portant les réservoirs du VIH et identifient l’enzyme RALDH comme une potentielle cible thérapeutique pour limiter la dissémination du virus et la persistance des réservoirs au niveau des muqueuses. Dans la première partie de mon doctorat, je me suis intéressée à la contribution directe de différentes sous-population myéloïdes à la persistance des réservoirs du VIH sous TAR dans le sang et le colon des personnes vivant avec le VIH (PLWH). Nous avons démontré que la présence des réservoirs du VIH dans ces cellules myéloïdes était un évènement rare. En parallèle, j’ai réalisé des travaux dans un modèle de souris humanisées pour explorer l’existence et la contribution des cellules myéloïdes d’origine embryonnaire de longue durée de vie et capables d’autorenouvèlement à la persistance des réservoirs viraux sous TAR. Nous avons démontré que, contrairement aux lymphocytes T CD4+, les cellules myéloïdes résidant dans le foie et les poumons portent de l’ADN viral intégré avant, mais pas après la TAR, ce qui est un indicateur de leur faible contribution à la persistence du VIH sous TAR. Dans la deuxième partie de mon doctorat, je me suis intéressée à la contribution indirecte des cellules myéloïdes, et en particulier celle des DCs dérivées des monocytes (MDDCs) classiques CD16- versus intermédiaires/non-classiques CD16+. Nous avons démontré que les MDDCs CD16+ se distinguent des MDDC CD16- par l’activité élevée de leur enzyme RALDH métabolisant la vitamine A en acide rétinoïque et leur capacité supérieure à transmettre le VIH aux lymphocytes T CD4+ spécifiques/réactives au Staphylococcus aureus (S. aureus). De plus, nous avons démontré que les MDDC RALDH+ contribuent à l'établissement et à la réactivation des réservoirs du VIH dans les cellules T spécifiques à certains pathogènes non-VIH, tels que S. aureus, via un mécanisme dépendant de la production de l’acide rétinoïque par les MDDC en réponse à des ligands du recepteur de type Toll (TLR) 2. Ensemble, mes études doctorales démontrent que, bien que les cellules myéloïdes contribuent rarement de façon directe à la persistance des réservoirs du VIH, leur rôle indirect est important dans ce processus via l’interaction avec les lymphocytes T CD4+. De plus, les résultats que j’ai générés élargissent les connaissances sur la spécificité antigénique des lymphocytes T CD4+ mémoires portant les réservoirs du VIH et identifient l’enzyme RALDH comme une potentielle cible thérapeutique pour limiter la dissémination du virus et la persistance des réservoirs au niveau des muqueuses. / Since the discovery of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) in 1983, significant breakthroughs have led to efficient and sensitive viral tests, as well as potent antiviral therapies (ART). However, although ART controls viral replication to undetectable plasma levels, viral eradication is yet not achieved. Integrated HIV-DNA persists in different cell subsets, and viral replication resumes after treatment interruption. While HIV persistence is well characterized in CD4+ T-cells, the contribution of myeloid cells remains elusive. Notably, ART does not inhibit HIV transcription, thus allowing for residual viral replication in tissues such as the gut. This low level of viral replication contributes to chronic immune activation and represents a major challenge in developing a cure. Memory CD4+ T-cells bearing HIV reservoirs interact with dendritic cells (DCs) in an antigen specific manner, resulting in T-cell clonal expansion. Hence, we need to identify cellular signals provided by DCs that lead to transcriptional reactivation of HIV reservoirs. During my Ph.D., I studied the direct and indirect mechanisms by which myeloid cells contribute to HIV persistence during ART. In the first part of my thesis, I studied the direct contribution of myeloid subsets to the persistence of the HIV reservoir during ART. We demonstrated that HIV persistence in myeloid cells is a rare event in the blood and colon of ART-treated people living with HIV (PLWH). In parallel, we used humanized mice (hu-BLT) to explore the contribution of long-lived tissue-resident macrophages (LL-TRM), with embryonic origin and self-renewal capacity to the HIV reservoir during ART. We demonstrated that myeloid cells in this hu-BLT mouse model, are permissive to HIV infection, but are not HIV reservoirs during ART. These results point to the need for establishing new models allowing LL-TRM development for HIV reservoir studies. In the second part of my thesis, I studied the indirect contribution of DCs derived from classical (CD16-) or intermediate/non-classical (CD16+) monocyte origin. We identified that, in contrast to CD16- monocyte-derived DCs (MDDCs), CD16+ MDDCs exhibit a superior activity of the RALDH enzyme, involved in retinoic acid metabolism, and a higher capacity to transmit HIV to CD4+ T-cells specific/reactivated to Staphylococcus aureus (S. aureus). Furthermore, we demonstrated that RALDH+ MDDCs contribute to HIV reservoir establishment and reactivation in T-cells with specificity to non-HIV pathogens (e.g. S. aureus) through a retinoic acid-dependent mechanism in response to Toll like receptor (TLR) 2 stimulation. Together, these results underline the key role of CD16+ MDDCs and bacterial/fungal pathogens in fueling HIV reservoir establishment/outgrowth via a RALDH/RA-dependent mechanism that may be therapeutically targeted. In conclusion, my doctoral work demonstrated that, despite the rare direct contribution of myeloid cells to the HIV reservoir, these cells play an important indirect role through their ability to interact with CD4+ T-cells and to modulate their functions. These results extend the knowledge on the antigenic specificity of memory CD4+ T-cells harboring HIV reservoirs and they identify the RALDH/retinoic acid pathway as a potential therapeutic target to limit viral dissemination and persistence of viral reservoirs in mucosal sites.