Los ensayos in vitro de transformación celular abarcan el proceso multifásico que va desde la conversión neoplásica hasta el establecimiento del fenotipo tumorigénico. En la presente tesis doctoral, el ensayo in vitro Balb/3T3, con una línea celular inmortalizada de fibroblastos de ratón, ha sido aplicado para determinar la citotoxicidad y el potencial carcinogénico de una serie de compuestos metálicos seleccionados por su interés ambiental, laboral y biomédico, adoptando una estrategia específica de trabajo en varias etapas. Esto ha implicado una optimización muy precisa del protocolo para determinar la reproducibilidad intralaboratorios del protocolo del ensayo y para asegurar la estabilidad de las condiciones experimentales de aplicación del ensayo Balb/3T3.Por consiguiente, después de la optimización del protocolo adoptado, el proyecto de tesis se desarrolló siguiendo una estrategia de cuatro etapas: a) determinación de la citotoxicidad a unas concentraciones de exposición fijadas (100 µM, 65 compuestos metálicos individuales). Esto permitió la selección de los compuestos metálicos que tendrían prioridad para las investigaciones subsiguientes; b) establecimiento de las relaciones dosis-efecto para 35 compuestos metálicos identificados como de primera prioridad en la etapa (a), para determinar los correspondientes valores de IC50 y un rango adecuado de concentraciones de exposición para ser utilizado en los pasos siguientes; c) determinación del potencial carcinogénico de los compuestos metálicos seleccionados a partir de la etapa (b); d) estudios sobre los mecanismos de transformación de las especies metálicas identificadas en la fase (c). En este contexto, una aproximación mecanística inicial fue la evaluación de la respuesta apoptótica inducida por los compuestos metálicos seleccionados en las células Balb/3T3. Este estudio sobre la apoptosis ha mostrado que se debería utilizar más de un ensayo para establecer inequívocamente la inducción de apoptosis por alguno de los compuestos metálicos en el sistema de ensayo escogido. Esto es debido a la complejidad del problema y a las dificultades para interpretar los datos experimentales. Por otra parte, los hallazgos sobre la respuesta apoptótica inducida por As(III), Cr(VI) y algunos compuestos de Pt sugieren la hipótesis de la existencia de una relación entre los procesos apoptótico, genotóxico y carcinogénico.Con respecto a los estudios mecanísticos y de metabolismo de los metales, los resultados obtenidos aplicando técnicas analíticas únicas y peculiares como el uso de radiotrazadores, espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo, y resonancia magnética nuclear han hecho posible obtener interesantes datos metabólicos sobre la entrada y el reparto intracelular de los metales incorporados en las células. Éste es un aspecto generalmente olvidado en los estudios in vitro a pesar de ser un punto clave para la interpretación mecanística de la citotoxicidad y de la actividad transformante inducidas por los compuestos químicos.Además, se encontró un buen nivel de concordancia al comparar los resultados obtenidos de la aplicación del ensayo Balb/3T3 con los modelos in vitro seleccionados de roedores y humanos.En conclusión, la presente tesis representa una importante contribución para hacer que la línea celular Balb/3T3 sea un valioso modelo in vitro para investigar la correlación entre absorción, biotransformación, citotoxicidad y potencial carcinogénico de los compuestos metálicos. Se puede afirmar que el ensayo Balb/3T3 tiene el potencial para ser adecuado para un estudio futuro de validación. / In vitro morphological cell transformation tests encompass the multi-step process from neoplastic conversion to the established tumorigenic phenotype. In the present PhD thesis the in vitro Balb/3T3 assay, an immortalised mouse fibroblast cell line, was applied for assessing cytotoxicity and carcinogenic potential of selected metal compounds of environmental, occupational and biomedical interest by adopting a specific multi-stage work strategy. This has involved a very accurate protocol optimisation in order to assess intralaboratory reproducibility of the test protocol and to assure stability of the experimental conditions in which the Balb/3T3 assay was applied.Therefore, after optimisation of the adopted protocol the present PhD project was carried out following a "four steps approach": a) determination of cytotoxicity at a fixed concentration exposure (100 µM, 65 individual metal compounds). This allowed the selection of metal compounds to which priority is given for subsequent investigations; b) setting of dose-effect relationships for 35 metal compounds identified as first priority in step (a), in order to establish the corresponding IC50 values and a suitable exposure range of concentrations to be used in the subsequent steps; c) determination of carcinogenic potential of selected metal compounds from step (b); d) mechanistic studies on transforming metal species as identified in step (c). In this context, an initial mechanistic approach was the evaluation of the apoptotic response induced by selected metal compounds on the Balb/3T3 cells. This study on apoptosis has shown that more than one assay should be used in order to establish unequivocally the induction of apoptosis by a metal compound on the selected test system. This is due to the complexity of the problem and the difficulties to interpret the experimental data. Moreover, the findings on the apoptotic response induced by As(III), Cr(VI) and some Pt-compounds suggest the hypothesis of an existing relationship among apoptotic, genotoxic and carcinogenic processes.With regard to mechanistic studies and metal metabolism, the results obtained applying unique and peculiar analytical techniques like the use of radiotracers, Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance have made possible to get interesting metabolic data on uptake and intracellular repartition of metals incorporated into cells. This is an aspect generally neglected in in vitro studies although it is a key point for mechanistic interpretation of cytotoxicity and transforming activity induced by chemicals.In addition, a good level of concordance was achieved by comparing the results obtained from the application of the Balb/3T3 assay with selected in vitro rodent and human models.In conclusion, the present PhD project represents an important contribution to make the Balb/3T3 cell line as a valuable in vitro model to investigate correlation between uptake, biotransformation, cytotoxicity and carcinogenic potential of metal compounds. It is to state that the Balb/3T3 assay has the potential to be suitable for a future validation study.

Os óleos essenciais provenientes de plantas da flora Latino-americana, têm-se apresentado como candidatos à utilização em formulações cosméticas como fragrâncias, promotores de permeação cutânea, antioxidantes e conservantes naturais. A segurança de componentes da formulação deve ser avaliada por testes toxicológicos validados, que geram resultados reprodutíveis e confiáveis. Os ensaios de citotoxicidade (OECD/GD 129), fototoxicidade in vitro (OECD 432), micronúcleo in vitro (OECD 487) e atividade antioxidante intracelular correspondem a métodos alternativos pautados nos princípios dos 3R\'s: Refinament ou Refinamento; Reduction ou Redução; e Replacement ou Substituição. Com essa diretriz, o objetivo proposto foi avaliar a citotoxicidade, a fototoxicidade in vitro, o potencial genotóxico e a atividade antioxidante intracelular dos óleos essenciais das espécies Minthostachys setosa (Briq.) Epling, Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum e Drimys brasiliensis Miers provenientes de plantas da flora Latino-americana, candidatos ao uso em cosméticos. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação e foi avaliada a sua dispersão em meio de cultura. A partir dos resultados dos ensaios de citotoxicidade na linhagem BALB/3T3 clone A31, foi calculado o valor de concentração que inibe e 50 % (IC50) de células desafiadas. Na avaliação da fototoxicidade in vitro na linhagem BALB/3T3 clone A31 e no ensaio do micronúcleo in vitro na linhagem CHO-K1, verificou-se respectivamente, os potenciais fototóxico e genotóxico das amostras. Com exceção do óleo essencial da Drimys brasiliensis, a atividade antioxidante foi avaliada na linhagem WS1. Os óleos essenciais da Minthostachys setosa, Pimenta pseudocaryophyllus e Drimys brasiliensis não apresentaram potencial citototóxico, fototóxico e genotóxico, além disso, a atividade antioxidante foi expressiva para Pimenta pseudocaryophyllus. / Essential oils from plants flora Latin America, have been presented as candidates for use in cosmetic formulations as fragrances, skin permeation enhancers, antioxidants and natural preservatives. The safety of the formulation components should be assessed by validated toxicological tests. The cytotoxicity assays (OECD/GD 129), in vitro phototoxicity (OECD 432), in vitro micronucleus (OECD 487) and intracellular antioxidant activity correspond to alternative methods guided by the 3R\'s principles: Refinament, Reduction and Replacement. In this scenario, the proposed objective was to evaluate the cytotoxicity, phototoxicity in vitro, the genotoxic potential and intracellular antioxidant activity of Minthostachys setosa (Briq.) Epling, Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum and Drimys brasiliensis Miers essential oils, from Latin American plants candidates for use in cosmetics. The essential oils were extracted by hydrodistillation and its dispersion was evaluated in culture medium. The results obtained in cytotoxicity assays on line BALB/3T3 clone A31 was calculated the IC50. In vitro phototoxicity in BALB/3T3 clone A31 cell line and the micronucleus assay in vitro in the CHO-K1 cell line, it was verify phototoxic and genotoxic potential, respectively. With the exception of essential oil Drimys brasiliensis, the intracellular antioxidant activity was assessed in WS1 cell lines. In conclusion Minthostachys setosa, Pimenta pseudocaryophyllus and Drimys brasiliensis Miers essential oils showed no cytotoxic, phototoxic and genotoxic potential, moreover, the antioxidant activity was expressive for Pimenta pseudocaryophyllus.

A pele é o maior órgão do corpo humano e constitui a principal defesa do organismo contra agentes físicos e químicos, sendo também fundamental para evitar a perda de água por dessecação. Formada por três camadas distintas, mas complementares, sendo as duas principais denominadas derme e epiderme, contendo diferentes tipos celulares, como fibroblastos, queratinócitos, melanócitos, células de Merkel e células de Langerhans, sendo que estas últimas desempenham um papel fundamental na hipersensibilidade de contato. Devido à importância da manutenção da pele saudável para a vida humana, existe uma crescente necessidade da elaboração de substitutos de tecidos para o tratamento de feridos e doentes, assim como, há grande demanda de pele para testes químicos das áreas farmacêutica e cosmética. Outro fator de fundamental importância para o desenvolvimento de métodos alternativos in vitro, é a pressão mundial para que estes testes substituam os modelos animais. Esta abordagem vai de encontro aos novos conceitos de substituição, redução e refinamento na utilização de animais em estudos científicos, ditando o futuro da cultura celular e bioengenharia de tecidos. Graças ao grande desenvolvimento do cultivo celular e descoberta de que as células cultivadas podem ser reagrupadas de acordo com o delineamento experimental, se torna possível à criação de equivalentes dermoepidérmicos para estudos in vitro, como por exemplo, testes de cito e fototoxicidade ou avaliação da fase inicial da reação alérgica e processos de sensibilização da pele. Neste caso, se faz necessária a obtenção de grande quantidade de células de Langerhans imaturas. As células de Langerhans (CLs) são células dendríticas imaturas localizadas na epiderme e epitélio superficial que desempenham um papel central na imunidade da pele, agindo como verdadeiras sentinelas capazes de captar antígenos de contato. Desta forma, foram testados quatro diferentes protocolos para extração e criopreservação destas células, sendo ainda analisadas as suas características morfológicas e fenotípicas. Obtivemos resultados não expressivos quanto ao isolamento, pureza e marcação positiva para CD1a no Protocolo 2 (Expansor de Pele). Os Protocolo 1A (Coleta de Sobrenadante) e 3 (Epiderme + Gradiente de Ficoll Paque) ofereceram altos níveis de células marcadas positivamente para CD1a, apresentando a mesma qualidade de marcação. No entanto, o Protocolo 3 forneceu um maior número de células viáveis, e uma maior pureza da amostra, uma vez que só utiliza a epiderme para a obtenção da suspensão de células, o que o coloca como modelo a ser seguido em posteriores experimentos. Os métodos aqui apontados como mais promissores, podem ser reproduzidos em laboratórios de cultura celular convencionais, contribuindo para aumentar a reprodutibilidade e confiabilidade de resultados experimentais relativos às CLs. Da mesma forma, avaliamos a utilização dos equivalentes de pele humana para a realização de testes in vitro de cito e fototoxicidade, os quais podem de fato reduzir a utilização de modelos animais para identificação do perfil tóxico de uma substância ou de formulações mais complexas. / The skin is the largest organ from the human body and constitutes the main protection of the organism against physical and chemical agents and it is also fundamental to avoid water loss by desiccation. Formed by three distinct stratus, yet complementary, being the two main called dermis and epidermis, containing different cell types, as fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Merkel cells and Langerhans cells (LCs), being these latter fundamental in the contact hypersensitivity. Due to the importance of the healthy skin maintenance to the human´s life, there is a growing need of elaboration of skin models to the treatment of injured and diseased, as well as there is a big demand of skin models to chemical tests from the pharmaceutics and cosmetology fields. Another factor of fundamental importance to the development of alternative in vitro methods is the worldwide pressure for these tests to replace animal models. This approach meets new concepts of replacement, reduction and refinement in the use of animals in scientific studies, dictating the future of cell culture and bioengineering of skin models. Thanks to the large development of cell culture and the discovery that the cultured cells can be regrouped according to the experimental delineation, the creation of skin models to in vitro studies is made possible, as for instance, tests of cytotoxicity and phototoxicity or evaluation of the initial phase from the allergic reaction and processes of skin sensitization. In this case, it is necessary the achievement of a large amount of immature Langerhans cells. The LCs are immature dendritic cells located in the epidermis and superficial epithelium that perform a central role in the skin immunity, acting as real sentinels able to collect contact antigens. Accordingly, were tested four different protocols for extraction and cryopreservation of these cells, and further analyzed its morphological and phenotypic features. We obtained no significant results in relation to the isolation, purity and CD1a positive expression in the Protocol 2. The Protocols 1A and 3 offered high levels of CD1a positively marked cells, showing the same expression levels. However, the Protocol 3 provided a bigger number of viable cells and a high purity yield, since it only uses the epidermis to obtain the single cell suspension, which places it as a model to be followed in subsequent experiments. The methods appointed here as the most promising, can be reproduced in conventional cell culture labs, contributing to increase the reproducibility and reliability of experimental results related to the LCs. In the same way, we evaluated the use of the human skin equivalents to the accomplishment of in vitro tests of cyto and phototoxicity, which can in fact reduce the use of animal models to the identification of single substances toxicity or even complex formulations.

Há uma tendência mundial para a substituição de animais vivos por métodos alternativos ou substitutivos, reduzindo o número destes para uso didático especificamente. A elaboração de métodos variados para realização de aulas de Cirurgia mantém a educação atualizada e sincronizada com o desenvolvimento de práticas de ensino contribuindo para o pensamento ético. Alguns destes métodos substitutivos são: utilização de cadáveres formolizados, modelos sintéticos, como espumas e bexigas de látex, vísceras e músculos de cadáveres de animais, vídeos ilustrativos, modelos virtuais, suturas em tecidos, preparação de peças anatômicas, dentre outros. A habilidade cirúrgica se desenvolve por meio de repetição de exercícios, razão pela qual, muitas instituições estão adotando simuladores e outros modelos de treinamento nos Programas de Graduação e Residência médico-veterinária, permitindo a repetição dos exercícios de forma individualizada. No presente estudo, utilizou-se o Líquido de Larssen Larssen modificada (Silva et al.,2004) - que permite a reutilização de corpos por até quatro vezes, com o objetivo de se avaliar a preservação de características organolépticas de cadáveres e de suas vísceras, utilizados no ensino de Técnica Cirúrgica, comparando a preservação dos corpos com e sem heparinização dos mesmos. Para tanto, foram obtidos 14 corpos de cães, cedidos de forma consensual pelos proprietários, que foram eutanasiados devido doenças graves ou vieram a óbito de forma natural. Em sete cadáveres, no momento da eutanásia, utilizou-se heparinização em volume de 5 mL por via venosa e nos demais sete corpos não. Os animais de ambos os grupos foram preservados em câmara fria (-12 graus °C a -8 graus °C) e retirados 20 horas antes do treinamento de alunos em técnica cirúrgica dos sistemas digestório, articular, urinário, respiratório e do globo ocular. Para o treinamento, foram utilizados residentes médicos-veterinários e alunos do quinto ano da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ/USP). Ao final de cada treinamento, eles responderam a um questionário que avaliou, de forma empírica, a consistência, coloração, odor e textura dos órgãos abordados, e, assim, comparar os métodos de preservação, bem como a eficiência do treinamento. Após a análise dos resultados constatou-se que, diante das condições do experimento, não houve diferença significativa entre os grupos preservados com ou sem heparina; verificou-se eficiência no treinamento cirúrgico, elucidando, desenvolvendo e capacitando os participantes em habilidades motoras fundamentais para a formação do cirurgião veterinário. Conclui-se que o treinamento cirúrgico torna-se fundamental e deve ser implementado nas instituições de ensino, sugerindo- que se faça a conscientização e educação por parte dos proprietários no tocante a doar seus animais para o ensino médico. / There is a global trend to replace live animals for alternative or substitute methods, reducing the number of these specifically for educational use. The development of various methods for surgery classes keeps updated and synchronized education with the development of teaching practices contributing to ethical thinking. Some of these substitutive methods are: use of fixation cadavers, synthetic models, such as foam and latex bladders, guts and muscles of animal carcasses, illustrative videos, virtual models, sutures in tissues, preparation of anatomical parts, among others. Surgical skill is developed through repetition exercises, which is why many institutions are adopting simulators and other training models in undergraduate programs and medical-veterinary residence, allowing the repetition of individualized exercises. In the present study, we used the liquid Larssen - modified Larssen (Silva et al., 2004) - which allows reuse bodies up to four times, in order to evaluate the organoleptic preservation of corpses and its viscera, used in the Surgical Technique teaching, comparing the preservation of bodies with and without heparin them. Therefore, we obtained 14 bodies of dogs, assigned by consensus by the owners, who were euthanized due to serious illness or death came naturally. In seven cadavers at the time of euthanasia was used heparinization volume of 5 ml intravenous and not in other seven bodies. The animals of both groups were preserved in cold storage (-12 degrees ° C to -8 degrees C) and withdrawn 20 hours before the training dea students in surgical technique of the digestive system, joint, urinary, respiratory ear and eye. For training, medical-veterinary residents were used and fifth graders at the Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science of the University of São Paulo (FMVZ / USP). At the end of each training, they completed a questionnaire that assessed, empirically, consistency, color, odor and texture of the covered bodies, and thus compare preservation methods and the training efficiency. After analyzing the results it was found that, given the experimental conditions, there was no significant difference between the groups preserved with or without heparin; it was found efficiency in surgical training, clarifying, developing and enabling key participants in motor skills for forming a veterinary surgeon. We conclude that surgical training is fundamental and must be implemented in educational institutions, sugerindo- that make awareness and education by the owners with respect to donate their animals for medical education.

A pele é o maior órgão do corpo humano e constitui a principal defesa do organismo contra agentes físicos e químicos, sendo também fundamental para evitar a perda de água por dessecação. Formada por três camadas distintas, mas complementares, sendo as duas principais denominadas derme e epiderme, contendo diferentes tipos celulares, como fibroblastos, queratinócitos, melanócitos, células de Merkel e células de Langerhans, sendo que estas últimas desempenham um papel fundamental na hipersensibilidade de contato. Devido à importância da manutenção da pele saudável para a vida humana, existe uma crescente necessidade da elaboração de substitutos de tecidos para o tratamento de feridos e doentes, assim como, há grande demanda de pele para testes químicos das áreas farmacêutica e cosmética. Outro fator de fundamental importância para o desenvolvimento de métodos alternativos in vitro, é a pressão mundial para que estes testes substituam os modelos animais. Esta abordagem vai de encontro aos novos conceitos de substituição, redução e refinamento na utilização de animais em estudos científicos, ditando o futuro da cultura celular e bioengenharia de tecidos. Graças ao grande desenvolvimento do cultivo celular e descoberta de que as células cultivadas podem ser reagrupadas de acordo com o delineamento experimental, se torna possível à criação de equivalentes dermoepidérmicos para estudos in vitro, como por exemplo, testes de cito e fototoxicidade ou avaliação da fase inicial da reação alérgica e processos de sensibilização da pele. Neste caso, se faz necessária a obtenção de grande quantidade de células de Langerhans imaturas. As células de Langerhans (CLs) são células dendríticas imaturas localizadas na epiderme e epitélio superficial que desempenham um papel central na imunidade da pele, agindo como verdadeiras sentinelas capazes de captar antígenos de contato. Desta forma, foram testados quatro diferentes protocolos para extração e criopreservação destas células, sendo ainda analisadas as suas características morfológicas e fenotípicas. Obtivemos resultados não expressivos quanto ao isolamento, pureza e marcação positiva para CD1a no Protocolo 2 (Expansor de Pele). Os Protocolo 1A (Coleta de Sobrenadante) e 3 (Epiderme + Gradiente de Ficoll Paque) ofereceram altos níveis de células marcadas positivamente para CD1a, apresentando a mesma qualidade de marcação. No entanto, o Protocolo 3 forneceu um maior número de células viáveis, e uma maior pureza da amostra, uma vez que só utiliza a epiderme para a obtenção da suspensão de células, o que o coloca como modelo a ser seguido em posteriores experimentos. Os métodos aqui apontados como mais promissores, podem ser reproduzidos em laboratórios de cultura celular convencionais, contribuindo para aumentar a reprodutibilidade e confiabilidade de resultados experimentais relativos às CLs. Da mesma forma, avaliamos a utilização dos equivalentes de pele humana para a realização de testes in vitro de cito e fototoxicidade, os quais podem de fato reduzir a utilização de modelos animais para identificação do perfil tóxico de uma substância ou de formulações mais complexas. / The skin is the largest organ from the human body and constitutes the main protection of the organism against physical and chemical agents and it is also fundamental to avoid water loss by desiccation. Formed by three distinct stratus, yet complementary, being the two main called dermis and epidermis, containing different cell types, as fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Merkel cells and Langerhans cells (LCs), being these latter fundamental in the contact hypersensitivity. Due to the importance of the healthy skin maintenance to the human´s life, there is a growing need of elaboration of skin models to the treatment of injured and diseased, as well as there is a big demand of skin models to chemical tests from the pharmaceutics and cosmetology fields. Another factor of fundamental importance to the development of alternative in vitro methods is the worldwide pressure for these tests to replace animal models. This approach meets new concepts of replacement, reduction and refinement in the use of animals in scientific studies, dictating the future of cell culture and bioengineering of skin models. Thanks to the large development of cell culture and the discovery that the cultured cells can be regrouped according to the experimental delineation, the creation of skin models to in vitro studies is made possible, as for instance, tests of cytotoxicity and phototoxicity or evaluation of the initial phase from the allergic reaction and processes of skin sensitization. In this case, it is necessary the achievement of a large amount of immature Langerhans cells. The LCs are immature dendritic cells located in the epidermis and superficial epithelium that perform a central role in the skin immunity, acting as real sentinels able to collect contact antigens. Accordingly, were tested four different protocols for extraction and cryopreservation of these cells, and further analyzed its morphological and phenotypic features. We obtained no significant results in relation to the isolation, purity and CD1a positive expression in the Protocol 2. The Protocols 1A and 3 offered high levels of CD1a positively marked cells, showing the same expression levels. However, the Protocol 3 provided a bigger number of viable cells and a high purity yield, since it only uses the epidermis to obtain the single cell suspension, which places it as a model to be followed in subsequent experiments. The methods appointed here as the most promising, can be reproduced in conventional cell culture labs, contributing to increase the reproducibility and reliability of experimental results related to the LCs. In the same way, we evaluated the use of the human skin equivalents to the accomplishment of in vitro tests of cyto and phototoxicity, which can in fact reduce the use of animal models to the identification of single substances toxicity or even complex formulations.

O aprendizado e o ensino da cirurgia veterinária envolvem o desenvolvimento de habilidades que podem ser obtidas em laboratórios, por meio de vários modelos já disponíveis, incluindo o treinamento em cadáveres. Nestes, quando comparados aos procedimentos em animais vivos, duas limitações são notadas e frequentemente mencionadas, e referem-se às alterações de consistência dos tecidos e à ausência de sangramento durante o treinamento cirúrgico. Este trabalho foi focado na superação destas questões, por meio da realização da simulação de circulação sanguínea em cadáveres adequadamente preservados, permitindo aos usuários do sistema a possibilidade de treinamento cirúrgico em um modelo mais próximo do animal vivo, viabilizando também o aprendizado e a prática da hemostasia. Depois de desenvolvido o sistema, o mesmo foi utilizado por estudantes de Medicina Veterinária com distintos níveis de experiência, que avaliaram todo o método por meio de questionário, ressaltando também os pontos positivos e negativos observados. Concluiu-se que é possível realizar a simulação de sangramento em cadáveres quimicamente preservados, e que tal sistema foi bem aceito por quem o utilizou, sendo mais uma alternativa para melhor preparar estudantes para as experiências em animais vivos que necessitem de intervenções cirúrgicas. / Veterinary surgery demands skills acquisition and refinement that can be obtained in laboratories using several available models, including training on cadavers. Those, when compared to live animal procedures, two limitations are noted and often mentioned, and are due to tissue consistency alterations and absence of bleeding during surgical training. This work was focused on overcoming these issues, by performing blood flow simulation in properly chemically preserved cadavers, giving users of this system the possibility of surgical training in a model closer to live animal, also enabling learning and practice of hemostasis. After developed the system, it was used by veterinary students with distinct experience levels, evaluating the whole method through a questionnaire, emphasizing positive and negative aspects. It was concluded that bleeding simulation in chemically preserved cadavers is possible, and that such a system was well accepted by those who used it, being an alternative to better prepare students for experiments on live animals that require surgical interventions.

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2018-02-07T14:11:00Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Diônvera.pdf: 7391423 bytes, checksum: 33213e2f7d4284eb62de66c2af1c40b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2018-02-08T12:32:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação Diônvera.pdf: 7391423 bytes, checksum: 33213e2f7d4284eb62de66c2af1c40b0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-08T12:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Diônvera.pdf: 7391423 bytes, checksum: 33213e2f7d4284eb62de66c2af1c40b0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-08-22 / O objetivo deste trabalho foi o de avaliar a atividade alelopática de diferentes partes vegetais de Achillea millefolium L. e Cymbopogon citratus (DC) Stapf sobre a germinação e o desenvolvimento inicial de sementes e plântulas de Lactuca sativa L. e Cucumis sativus L. Para a determinação do potencial alelopático das plantas mil-folhas (Achillea millefolium L.) e capim-cidrão (Cymbopogon citratus (DC) Stapf), foram instalados bioensaios em laboratório e em casa de vegetação. Os tratamentos foram extrato aquoso das diferentes partes vegetais de A. millefolium L. e C. citratus L. nas concentrações de 0% (água destilada), 15%, 30%, 45%, 60% e 75%. Foram avaliados germinação, primeira contagem de germinação, índice de velocidade de germinação, comprimento de parte aérea e raiz primária, massa seca total de plântulas, emergência de plântulas, comprimento de parte aérea e de raiz primária e massa seca total das plântulas emergidas. Houve ação alelopática negativa dos extratos de capim-cidrão e das flores de mil-folhas sobre a germinação e desenvolvimento inicial de plântulas de alface em condições de laboratório. Houve afeito alelopático negativo na primeira contagem da germinação, no índice de velocidade de germinação e na germinação em sementes de alface com o uso do extrato de folha milfolhas , em condições de laboratório. Os extratos aquosos de flores, folhas e raiz de mil-folhas apresentaram efeito tóxico para a primeira contagem da germinação de sementes de pepino, sendo que o índice de velocidade da germinação foi mais afetado pelos extratos das flores e folhas de mil folhas, em condições de laboratório. Houve efeito alelopático para o comprimento da parte aérea e massa fresca de plântulas de pepino submetidas aos extratos de flores e folhas de mil-folhas, em condições de laboratório. Houve efeito alelopático significativo no desenvolvimento da raiz das sementes de pepino submetidas aos extratos de folhas de mil-folhas, em condições de laboratório. A primeira contagem da germinação, a germinação, a emergência de plântulas, o comprimento da parte aérea e da raiz de plântulas de alface não foram afetados pelo extrato de raiz de milfolhas, em condições de ambiente protegido. O extrato de capim-cidrão afetou negativamente o índice de velocidade de emergência, a massa fresca e seca de plântulas de alface, em condições de ambiente protegido. O extrato do caule de milfolhas apresentou efeito prejudicial para o comprimento da raiz de plântulas de alface, em condições de ambiente protegido. O extrato de flores de mil-folhas afetou negativamente o comprimento da raiz das plântulas de alface, nas concentrações 15, 30 e 45% e a massa seca em todas as concentrações testadas, em condições de ambiente protegido. / The objective of this work was to evaluate the allelopathic activity of different plant parts of Achillea millefolium L. and Cymbopogon citratus (DC) Stapf on the germination and initial development of seeds and seedlings of Lactuca sativa L. and Cucumis sativus L. (Achillea millefolium L.) and citrus (Cymbopogon citratus (DC) Stapf), bioassays were installed in the laboratory and in greenhouse. The treatments were aqueous extract of the different plant parts of A. millefolium L. and C. citratus L. at the concentrations of 0% (distilled water), 15%, 30%, 45%, 60% and 75%. Germination, first germination count, germination speed index, shoot length and primary root length, total dry mass of seedlings, seedling emergence, shoot length and primary root length, and total dry mass of emerged seedlings were evaluated. There was a negative allelopathic action of extracts of citrus grass and thousand-leaf flowers on germination and initial development of lettuce seedlings under laboratory conditions. There was a negative allelopathic effect on the first germination count, the germination speed index and the germination in lettuce seeds with the use of the 1000 leaf extract under laboratory conditions. The aqueous extracts of flowers, leaves and root of thousand leaves had toxic effect for the first count of the germination of cucumber seeds, and the speed index of the germination was more affected by the extracts of the flowers and leaves of thousand leaves, in conditions. There was allelopathic effect for shoot length and fresh mass of cucumber seedlings submitted to flower extracts and leaves of mille leaves under laboratory conditions. There was a significant allelopathic effect in the development of the root of the cucumber seeds submitted to extracts of leaves of thousand leaves, under laboratory conditions. The first count of germination, germination, seedling emergence, shoot length and root lettuce seedlings were not affected by wild-type root extract under protected environment conditions. The extracts of citrus grass negatively affected the emergence speed index, the fresh and dry mass of lettuce seedlings, under protected environment conditions. The extract of the thousand-leaf stem showed a detrimental effect on the root length of lettuce seedlings under protected environment conditions. Milk leaf extract negatively affected the root length of lettuce seedlings at 15, 30 and 45% concentrations and the dry mass at all concentrations tested under protected environment conditions.

A fim de garantir a qualidade final de produtos os laboratórios de análise microbiológica fornecem dados sobre a qualidade dos mesmos em todas as suas etapas de produção. A crescente preocupação com a saúde dos pacientes conduz à busca de métodos que forneçam resultados precisos e rápidos, pois possibilitam que ações corretivas sejam tomadas em tempo real. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o potencial de tecnologia alternativa no monitoramento de endotoxina bacteriana na água tratada para diálise e dialisato e avaliar o potencial da citometria de fluxo na análise de água. Para isso utilizou-se Portable Test System (PTS®) como método alternativo para detecção de endotoxina bacteriana no monitoramento da água tratada para diálise e dialisato, o qual foi validado frente ao método convencional farmacopeico. Paralelamente realizou-se revisão narrativa da literatura a fim de avaliar a aplicabilidade da citometria de fluxo em análises de água. A análise dos diferentes parâmetros de validação para endotoxina bacteriana no método alternativo mostrou que, exceto para a menor diluição analisada, houve linearidade e precisão nos resultados. Por outro lado a concentração de 0,25 UE/mL foi a menor que apresentou exatidão e especificidade. Observou-se ainda, que o limite de detecção foi de 0,125UE/mL e o de quantificação de 0,25 UE/mL, portanto o intervalo foi de 0,25-1,0 UE/mL. Adicionalmente pela análise de resistência pode-se perceber que ao variar analistas não houve diferença significativa. Em relação ao tempo de análise em uma condição de rotina laboratorial com muitas amostras, o PTS® mostrou-se demorado. Ressalta ainda, que seria importante que a legislação vigente deternimasse a análise mensal de endotoxinas no dialisato. A revisão da literatura evidencia o potencial da tecnologia de citometria de fluxo, pois a mesma mostrou-se satisfatória quando comparada a metodologias convencionais para análise de água. O trabalho desenvolvido permitiu concluir que o PTS®) mostrou-se adequado para analisar amostras in loco, permitindo análises em tempo real, que para as quais haja a expectativa de ausência de endotoxinas ou de concentração respeitando o intervalo de 0,25 UE/mL a 1,0 UE/mL. Quanto a citometria de fluxo, esta mostrou-se uma tecnologia promissora em analisar amostras de água, sendo portanto recomendável proceder a estudos de validação e aplicabilidade. / In order to guarantee the final quality of products, the microbiological analysis laboratories provide data about their quality at all production stages. The growing concern for patients\' health leads to the search for methods that provide accurate and fast results, as they enable corrective actions to be taken in real time. The present work aimed to evaluate the alternative technology potential in the monitoring of bacterial endotoxin in treated water for dialysis and dialysate and to evaluate the potential of flow cytometry in water analysis. The different validation parameters analysis for bacterial endotoxin in alternative method showed that, except for the lowest dilution analyzed, there was linearity and precision in the results. On the other hand, the concentration of 0.25 EU / mL was the lowest that presented accuracy and specificity. It was further observed that the detection limit was 0.125UE / mL and the quantification limit was 0.25 EU / mL, so the range was 0.25-1.0 EU / mL. Additionally by the ruggedness analysis it was possible to perceived that when varying analysts there was no significant difference. Regarding the analysis time in a laboratory routine condition with many samples, the PTS® was was time consuming. It was also observed that it would be important to determine monthly analysis of endotoxins in dialysate. The literature review evidence the flow cytometry technology potential of the because it was satisfactory when compared to conventional methodologies for water analysis. The research showed that the PTS® was suitable for analyzing samples in loco, allowing real-time analyzes, for which there is expectation of endotoxins absence or concentration respecting the range of 0.25 EU / mL to 1.0 EU / mL. For the flow cytometry, it was shown to be a promising technology for analyzing water samples, and it is therefore advisable to carry out validation and applicability studies.

Há uma tendência mundial para a substituição de animais vivos por métodos alternativos ou substitutivos, reduzindo o número destes para uso didático especificamente. A elaboração de métodos variados para realização de aulas de Cirurgia mantém a educação atualizada e sincronizada com o desenvolvimento de práticas de ensino contribuindo para o pensamento ético. Alguns destes métodos substitutivos são: utilização de cadáveres formolizados, modelos sintéticos, como espumas e bexigas de látex, vísceras e músculos de cadáveres de animais, vídeos ilustrativos, modelos virtuais, suturas em tecidos, preparação de peças anatômicas, dentre outros. A habilidade cirúrgica se desenvolve por meio de repetição de exercícios, razão pela qual, muitas instituições estão adotando simuladores e outros modelos de treinamento nos Programas de Graduação e Residência médico-veterinária, permitindo a repetição dos exercícios de forma individualizada. No presente estudo, utilizou-se o Líquido de Larssen Larssen modificada (Silva et al.,2004) - que permite a reutilização de corpos por até quatro vezes, com o objetivo de se avaliar a preservação de características organolépticas de cadáveres e de suas vísceras, utilizados no ensino de Técnica Cirúrgica, comparando a preservação dos corpos com e sem heparinização dos mesmos. Para tanto, foram obtidos 14 corpos de cães, cedidos de forma consensual pelos proprietários, que foram eutanasiados devido doenças graves ou vieram a óbito de forma natural. Em sete cadáveres, no momento da eutanásia, utilizou-se heparinização em volume de 5 mL por via venosa e nos demais sete corpos não. Os animais de ambos os grupos foram preservados em câmara fria (-12 graus °C a -8 graus °C) e retirados 20 horas antes do treinamento de alunos em técnica cirúrgica dos sistemas digestório, articular, urinário, respiratório e do globo ocular. Para o treinamento, foram utilizados residentes médicos-veterinários e alunos do quinto ano da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ/USP). Ao final de cada treinamento, eles responderam a um questionário que avaliou, de forma empírica, a consistência, coloração, odor e textura dos órgãos abordados, e, assim, comparar os métodos de preservação, bem como a eficiência do treinamento. Após a análise dos resultados constatou-se que, diante das condições do experimento, não houve diferença significativa entre os grupos preservados com ou sem heparina; verificou-se eficiência no treinamento cirúrgico, elucidando, desenvolvendo e capacitando os participantes em habilidades motoras fundamentais para a formação do cirurgião veterinário. Conclui-se que o treinamento cirúrgico torna-se fundamental e deve ser implementado nas instituições de ensino, sugerindo- que se faça a conscientização e educação por parte dos proprietários no tocante a doar seus animais para o ensino médico. / There is a global trend to replace live animals for alternative or substitute methods, reducing the number of these specifically for educational use. The development of various methods for surgery classes keeps updated and synchronized education with the development of teaching practices contributing to ethical thinking. Some of these substitutive methods are: use of fixation cadavers, synthetic models, such as foam and latex bladders, guts and muscles of animal carcasses, illustrative videos, virtual models, sutures in tissues, preparation of anatomical parts, among others. Surgical skill is developed through repetition exercises, which is why many institutions are adopting simulators and other training models in undergraduate programs and medical-veterinary residence, allowing the repetition of individualized exercises. In the present study, we used the liquid Larssen - modified Larssen (Silva et al., 2004) - which allows reuse bodies up to four times, in order to evaluate the organoleptic preservation of corpses and its viscera, used in the Surgical Technique teaching, comparing the preservation of bodies with and without heparin them. Therefore, we obtained 14 bodies of dogs, assigned by consensus by the owners, who were euthanized due to serious illness or death came naturally. In seven cadavers at the time of euthanasia was used heparinization volume of 5 ml intravenous and not in other seven bodies. The animals of both groups were preserved in cold storage (-12 degrees ° C to -8 degrees C) and withdrawn 20 hours before the training dea students in surgical technique of the digestive system, joint, urinary, respiratory ear and eye. For training, medical-veterinary residents were used and fifth graders at the Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science of the University of São Paulo (FMVZ / USP). At the end of each training, they completed a questionnaire that assessed, empirically, consistency, color, odor and texture of the covered bodies, and thus compare preservation methods and the training efficiency. After analyzing the results it was found that, given the experimental conditions, there was no significant difference between the groups preserved with or without heparin; it was found efficiency in surgical training, clarifying, developing and enabling key participants in motor skills for forming a veterinary surgeon. We conclude that surgical training is fundamental and must be implemented in educational institutions, sugerindo- that make awareness and education by the owners with respect to donate their animals for medical education.

Os óleos essenciais provenientes de plantas da flora Latino-americana, têm-se apresentado como candidatos à utilização em formulações cosméticas como fragrâncias, promotores de permeação cutânea, antioxidantes e conservantes naturais. A segurança de componentes da formulação deve ser avaliada por testes toxicológicos validados, que geram resultados reprodutíveis e confiáveis. Os ensaios de citotoxicidade (OECD/GD 129), fototoxicidade in vitro (OECD 432), micronúcleo in vitro (OECD 487) e atividade antioxidante intracelular correspondem a métodos alternativos pautados nos princípios dos 3R\'s: Refinament ou Refinamento; Reduction ou Redução; e Replacement ou Substituição. Com essa diretriz, o objetivo proposto foi avaliar a citotoxicidade, a fototoxicidade in vitro, o potencial genotóxico e a atividade antioxidante intracelular dos óleos essenciais das espécies Minthostachys setosa (Briq.) Epling, Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum e Drimys brasiliensis Miers provenientes de plantas da flora Latino-americana, candidatos ao uso em cosméticos. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação e foi avaliada a sua dispersão em meio de cultura. A partir dos resultados dos ensaios de citotoxicidade na linhagem BALB/3T3 clone A31, foi calculado o valor de concentração que inibe e 50 % (IC50) de células desafiadas. Na avaliação da fototoxicidade in vitro na linhagem BALB/3T3 clone A31 e no ensaio do micronúcleo in vitro na linhagem CHO-K1, verificou-se respectivamente, os potenciais fototóxico e genotóxico das amostras. Com exceção do óleo essencial da Drimys brasiliensis, a atividade antioxidante foi avaliada na linhagem WS1. Os óleos essenciais da Minthostachys setosa, Pimenta pseudocaryophyllus e Drimys brasiliensis não apresentaram potencial citototóxico, fototóxico e genotóxico, além disso, a atividade antioxidante foi expressiva para Pimenta pseudocaryophyllus. / Essential oils from plants flora Latin America, have been presented as candidates for use in cosmetic formulations as fragrances, skin permeation enhancers, antioxidants and natural preservatives. The safety of the formulation components should be assessed by validated toxicological tests. The cytotoxicity assays (OECD/GD 129), in vitro phototoxicity (OECD 432), in vitro micronucleus (OECD 487) and intracellular antioxidant activity correspond to alternative methods guided by the 3R\'s principles: Refinament, Reduction and Replacement. In this scenario, the proposed objective was to evaluate the cytotoxicity, phototoxicity in vitro, the genotoxic potential and intracellular antioxidant activity of Minthostachys setosa (Briq.) Epling, Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum and Drimys brasiliensis Miers essential oils, from Latin American plants candidates for use in cosmetics. The essential oils were extracted by hydrodistillation and its dispersion was evaluated in culture medium. The results obtained in cytotoxicity assays on line BALB/3T3 clone A31 was calculated the IC50. In vitro phototoxicity in BALB/3T3 clone A31 cell line and the micronucleus assay in vitro in the CHO-K1 cell line, it was verify phototoxic and genotoxic potential, respectively. With the exception of essential oil Drimys brasiliensis, the intracellular antioxidant activity was assessed in WS1 cell lines. In conclusion Minthostachys setosa, Pimenta pseudocaryophyllus and Drimys brasiliensis Miers essential oils showed no cytotoxic, phototoxic and genotoxic potential, moreover, the antioxidant activity was expressive for Pimenta pseudocaryophyllus.